Vi presenterar en omfattande guide till förberedelse av fasta målprover, datainsamling och databehandling för seriell synkrotronkristallografi vid Diamond beamline I24.
Seriell datainsamling är en relativt ny teknik för synkrotronanvändare. Diamond Light Source är en användarhandbok för insamling av fasta måldata på I24 och presenteras med detaljerade steg-för-steg-instruktioner, siffror och videor för smidig datainsamling.
Seriell synkrotronkristallografi (SSX) är en framväxande metod för datainsamling som inspirerades av röntgenfria elektronlasrar (XFEL)1,2,3. Vid en XFEL registreras ett enda diffraktionsmönster från en vanligtvis mycket liten proteinkristall, innan kristallen förstörs av den extremt ljusa röntgenpulsen. Detta innebär vanligtvis att en ny kristall måste införas i röntgenstrålen för att få ett annat diffraktionsmönster4. Detta behov av att kontinuerligt fylla på kristaller har drivit utvecklingen av många seriella provleveranstekniker5.
Vid synkrotroner tillämpas klassiska (icke-seriella) rotationskristallografimetoder i stor utsträckning och utnyttjar en enda stor kristall som roteras i en röntgenstråle med hjälp av en goniometer för att samla in en komplett datauppsättning för strukturlösning6. För att öka kristallernas livslängd så att en komplett datauppsättning kan samlas in7,8, och även för att underlätta frakt och automatiserad provöverföring, är kristaller cryocooled till ~ 100 K för datainsamling. Vid intensiva mikrofokusstrålar används ofta multikristallstrategier eftersom strålningsskador kan förbjuda insamling av en komplett datauppsättning från en enda kristall9,10,11. Trots de begränsningar som strålskadorna medför är antalet kristaller som används fortfarande relativt blygsamt och det tillvägagångssätt som används är i huvudsak identiskt med det enda kristallexperimentet.
SSX, å andra sidan, använder seriell prov leverans för att få enstaka fortfarande diffraktions mönster från tusentals slumpmässigt orienterade kristaller för att generera en komplett data uppsättning. Det noteras att seriella tekniker som innehåller kristallrotation är under utveckling12,13 även om vi fokuserar på stillbild, nollrotation, tillvägagångssätt. Det finns ett brett utbud av provleveranssystem med olika fördelar och nackdelar14, allt från att leverera en ström av kristaller i en flödesfokuserad / trögflytande jet15,16,17, mikrofluidiskt chip18,19eller kristaller på ett fast mål som ett etsat kiselchip20,21 . Vanligtvis hålls kristaller i rumstemperatur, vilket gör att större konformationell mångfald kan observeras och ger en mer fysiologiskt relevant miljö22. SSX möjliggör insamling av datamängder med mycket låg dos23, eftersom den totala dosen av datauppsättningen motsvarar en enda kort röntgenexponering av en kristall. En annan stor fördel som SSX ger är studier av proteindynamik genom tidsupplösta metoder, med reaktioner som utlöses av exponering för laserljus24,25,26,27eller genom blandning av kristaller och ligand / substrat28,29. Med hjälp av mindre kristaller kan laserljus tränga in i kristallens helhet och initiera reaktionen på ett enhetligt sätt utan multifotonabsorption för att ge väldefinierade reaktionsinteriärer för diffraktionsdata som tas vid olika tidpunkter27. Användning av större kristaller och rotationsbaserade datainsamlingsmetoder lider av ett begränsat laserpenetrationsdjup, ickeuniform eller multifotonaktivering, strålningsskador och mekanisk overheadtid inom datasvep, vilket resulterar i en blandning av reaktionsinteriärer som kan visa sig vara svåra eller omöjliga att tolka vid snabbare reaktionshastigheter. Mindre kristaller ger en liknande fördel vid blandningsexperiment, eftersom ligands snabbt och mer enhetligt kan spridas i hela kristallen, vilket återigen gör det möjligt att registrera definierade reaktionsmediärer vid olika tidpunkter30,31,32.
På Diamonds mikrofokusstrålelinje kan både konventionell rotation och SSX-experiment utföras. Här presenteras ett omfattande protokoll för SSX-provberedning och datainsamling med fasta mål på I24 och protokoll för dataanalys av seriella data på Diamond. Även om manuskriptet och medföljande videor bör göra det möjligt för användare att utföra ett framgångsrikt SSX-experiment vid I24, bör det noteras att detta är ett snabbt utvecklande område och att tillvägagångssätt ständigt utvecklas. Det bör också noteras att seriella metoder finns tillgängliga vid andra synkrotronkällor, inklusive men inte begränsat till Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI och PXII)34och NSLS (FMX)35. Även om detaljerna för insamling och behandling av seriella uppgifter kommer att skilja sig åt mellan olika källor, kommer de grundläggande principerna att förbli desamma. Protokollen nedan bör ses som en utgångspunkt och en väg till baslägret snarare än toppen av vad som skulle kunna uppnås.
Detta protokoll förutsätter att användarna har ett protein- eller litet molekylkristallsystem, från vilket en mikrokristallslam i ordningen 0,5-2,0 ml med en god densitet av mikrokristaller per ml har producerats. Protokoll för att erhålla kristallslamm har beskrivits tidigare 36. Många olika typer av fasta mål finns tillgängliga, den vanligaste används på I24 använder ett exakt definierat kiselchip. För att skilja från andra chiplayouter, nedan och i beamline-gränssnittet kallas detta för ett “Oxford-chip”. Som tidigare beskrivits består Oxfords chiplayout av 8×8 “stadsblock”, var och en innehållande 20×20 bländare för totalt 25 600 bländare20,21.
Seriell synkrotrondatainsamling är en relativt ny teknik vid MX-strållinjer, som överbryggar klyftan mellan de ultrasnabba datainsamlingar som för närvarande utförs på XFELs och traditionell synkrotronbaserad MX. Detta manuskript syftar till att ge en översikt över hur man framgångsrikt samlar in seriella data med fast mål vid beamline I24, Diamond Light Source för låg dos, dosserier och tidsupplösta experiment. Som med standardkristallografi är provberedning en stor flaskhals i strukturlösning. SSX är inte annorlunda, och beredning av en homogen kristallslam i tillräckliga mängder har ännu inte dragit nytta av flera årtionden av studier och förfining som tillväxten av enstaka stora proteinkristaller har. Beredningen av dessa slam är dock utanför ramen för detta dokument och har sammanfattats någon annanstans36. Det kritiska steget i metoden som beskrivs här innebär noggrann användning av det tillgängliga exemplet med lättanvända GUI-gränssnitt (steg 3) och automatiserade databehandlingspipelines (steg 6) för att informera chipbelastningen (steg 1) och hur ett experiment ska fortsätta.
Den snabba feedback-pipelinen är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för användare att bedöma initiala träffhastigheter under datainsamlingen för att informera efterföljande chip-laddningsprotokoll för framgångsrik datainsamling. När användarna står inför en låg träfffrekvens (<5%) riskerar de att samla in ofullständiga data och/eller slösa bort stråltid med ytterligare samlingar. I detta fall kan provet slås samman, koncentreras genom skonsam centrifugering, och/eller större volymer kan laddas i steg 1,5. En högre träfffrekvens är i allmänhet gynnsam, men det finns en punkt av minskande avkastning där överbelastning leder till flera kristaller i samma brunn. DIALS kan hantera multi-gitterdiffraktionsdata50, men ett större problem än indexering och integration är den skadliga effekt kristallgruppering kan ha på jämn aktivering av kristaller genom laserljus eller snabb blandning för exakta tidsupplösta experiment. Särskild försiktighet bör därför iakttas för att undvika överbelastning av fasta mål för tidsbestämda experiment.
Indexerings- och integrationsbearbetningssteget ger upphov till ett område med det centrala korset som representerar strålriktningen, varje punkt som representerar riktningen för hkl 001-reflektionen av enskilda gitter och cirkelns yttre ring som representerar en rotation på 90° bort från strålaxeln. Detta visar om dina kristaller har en önskad orientering, vilket kan påverka data fullständigheten och indikera behovet av att samla in mer data eller variera laddningsprotokollet. På den vänstra panelen i figur 7cvisas effekten av överbelastning av ett chip med HEWL-kristaller. När bländare fylls med fler kristaller håller de sig till bländarnas vinklade väggar snarare än att vise vid basen i slumpmässig orientering. De två ortogonala ellipserna är ett resultat av kristaller som ligger på chipets inre väggar som är på ~ 35° till strålriktningen. Detta minskar mängden laddade kristaller, minskar träffhastigheten och minskar dramatiskt fraktionen av kristaller som ligger i dessa föredragna plan.
Det bör noteras att andra seriella metoder finns tillgängliga på I24, såsom LCP-extruders och mikrofluidiska chips. Dessa använder liknande GUI och samma bearbetningspipelines så mycket av ovanstående kommer att förbli tillämpliga även om en annan teknik används. Ett antal seriella metoder finns för både SSX och SFX utöver den fasta målmetoden som beskrivs här, var och en har vissa fördelar jämfört med den andra beroende på experimentet som ska utföras och den strållinje som används för experimentet. Eftersom seriella tillvägagångssätt utvecklas snabbt är det lämpligt att kontrollera beamline-webbsidorna (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) för de senaste uppdateringarna och prata med beamline-personalen i ett så tidigt skede som möjligt när man planerar stråltid. Tillgång till I24 för standard- och serieexperiment är gratis vid användningsstället. För användare i Storbritannien och EU täcks rese- och boendekostnader delvis genom iNEXT Discovery.
Detta arbete stöddes av iNEXT-Discovery (Grant 871037) som finansierades av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program.
Chip Holders | Custom Built | N/A | In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount. |
Chipless Chip Spacers | SWISCII | N/A | LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range |
Geobrick LV-IMS-II | Delta Tau | N/A | A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration |
Kinematic Mounts | ThorLabs | KB25/M | Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders. |
KNF Laboport Vacuum Pump | Merck | Z262285-1EA | Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed. |
Mylar Sheets 6 µm | Fisher Scientific | 15360562 | 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep |
Mylar Sheets 3 µm | Fisher Scientific | 04-675-4 | 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep |
Pelco easiGlow Glow Discharge System | Ted Pella, INC. | 91000 | A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces |
Silicon Chips | University of Southampton | N/A | Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes. |
Translation Stages | Smaract | N/A | XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution |
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) | 1byOne | B01DENO0EQ | Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier |