Summary
呈现是一种空气膨胀的方法，通过血管灌注固定肺部，保留细胞在气道、肺泡和间歇性中的位置，用于结构功能分析。恒定的气道压力通过空气膨胀室保持，而固定气道则通过右心室喷灌。肺被处理为组织学研究。
Abstract
肺组织学常用于研究空域细胞在肺平衡和疾病发病过程中的贡献。然而，常用的基于灌输的固定方法可以取代空域细胞和粘液进入终端气道，并可以改变组织形态。相比之下，血管灌注固定技术在保存空域内细胞的位置和形态以及粘膜衬里方面具有优越性。然而，如果不同时施加正气道压力，肺部区域可能会崩溃，毛细血管可能会凸入肺泡空间，导致肺解剖结构失真。在此，我们描述了一种廉价的气膨胀方法，在血管灌注固定期间，以保持气道和藻类细胞的形态和位置，并在穆林肺的间质为下游组织学研究。恒定气压通过气管从密封的充气室输送到肺部，通过可调节的液体柱保持压力，而固定气压则通过右心室喷灌。
Introduction
肺病学是评估健康和疾病期间肺结构的黄金标准，是肺研究人员最常用的工具之一。这项技术最关键的方面之一是肺组织的适当隔离和保存，因为这一步骤的变异性会导致组织质量差和错误的结果1，2，3。在活体动物中，肺体积由肺的内弹性回冲和从胸壁传输的外力和表面张力的隔膜之间的平衡决定。因此，当胸腔进入时，外力丧失，肺衰竭。从坍塌的肺部准备的组织部分具有拥挤的外观，解剖隔间（即空域、血管和间歇）之间的界限可能难以区分。为了规避这一挑战，研究人员经常在化学固定过程中充气肺部，以保持空域大小和结构。
肺可以用空气或液体充气。由于空气-液体界面的分子间力，将肺部膨胀到相同体积所需的压力在空气和液体膨胀之间有所不同。在气膨胀期间，需要比液体膨胀（例如，12 厘米H2O）更高的压力（例如，12 厘米2O），以克服表面张力并打开坍塌的肺泡4。一旦肺泡被招募，较低的压力可以保持肺泡打开到相同的体积作为压力体积曲线高原，压力均衡整个肺部根据帕斯卡定律4，5，6，7，8。
肺充膨胀和固定的两种主要方法存在，以保存穆林肺为病理学。最常见的情况是，空域中注入液体，通常含有固定剂。这种方法的主要优点是相对容易，不需要很少的培训。虽然在专注于血管的研究中，可能更喜欢在检查内灌输固定剂，但通过气管灌输的液体往往将近似气道细胞和粘液推入更偏向空域区域，而空气膨胀不会达到1、3、4、9、10、11。此外，在液体膨胀期间，白细胞不经意间从上皮分离，改变了白细胞的形态，在人工上赋予白细胞一个简单、圆润的外观4、10、11、12。最后，用液体充气的肺部可以无意中压缩间歇性4，10，11。这些因素一起会扭曲保存的肺部内的正常解剖和细胞分布，从而限制技术。
组织保存的另一种方法是血管灌注固定。在此方法中，固定剂通过静脉腔或右心室注入肺血管。这种方法保留了空域流明中细胞的位置和形态。然而，除非肺部在灌注固定过程中膨胀，否则肺组织可能会崩溃。
空气膨胀与血管灌注固定利用上述每个固定技术的优势。在此，我们为此技术提供协议。所需材料和设备相对便宜，易于获取和组装。图 1A中显示的完成设置通过可调节的、充满液体的柱子向肺部提供恒定的气道压力，而渗透泵则通过右心室提供固定性。然后，可以进一步处理具有保存形态的肺，以便进行结构功能分析。
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Protocol
本议定书中描述的所有方法都已得到国家犹太健康机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注：协议分为三个部分。第一个组件详细介绍了用灌注/固定设备建造空气膨胀装置。第二部分描述了如何为实验设置设备。最后一部分描述了如何准备动物和执行实验。
1. 水柱装置的建造（图1B）
- 从 60 mL 滑尖端注射器中取出柱塞。
- 在 30 mL 标记处将胶带固定在注射器周围。将注射器的高度设置为此标记，初始通胀压力为 25 cmH2O。这也是柱中的水位应该在整个过程中。将磁带标记为"25 厘米"（ 如图 1A所示）或"通货膨胀"。
注：25 cmH2O 的通胀压力用于确保招募倒塌的空域。一旦招募了阿尔韦奥利，压力降低到20厘米H2O，以确保空域不会被分散。 - 测量5厘米从磁带对柱塞结束，并附加另一块磁带到注射器。将注射器移到此标记，以便在固定期间将通胀压力降低到20cmH 2 O。将磁带标记为"20 厘米"（ 如图 1A所示）或"固定"。
- 将 180 多维尼氯化物 （PVC） 管连接到注射器的滑端端。管子的长度取决于注射器和空气膨胀室之间的距离（约25-30厘米）。
- 将男性 Luer （2） 螺纹式 T恤（1.219 英寸长、0.904 英寸高、0.0904 英寸内径）放入管子的另一端。这个雄性Luer将连接到空气膨胀室的停止孔（第2.4步）。
2. 建造气膨胀室（图1C）
- 在 500 mL 塑料容器中钻两个孔（直径约 4 毫米），并盖上螺丝钉。孔的大小应与雌性Luers相同（1.224 英寸长，0.312 英寸高，0.098 英寸内径）。
注：空介质或缓冲容器可用于空气膨胀室。 - 女性 Luers 的外衣线与硅胶垫片制造商，并将较小的侧放入容器的预钻孔中。
- 在进入容器的雌性 Luers 周围添加硅胶垫片制造商，以确保密封密封。
- 拧在空气膨胀室的下女性卢尔的单向停止公鸡上。
- 将管子切割到大约 25 厘米的长度，并将雄性 Luers 连接到管子的自由端。将管子一端的男性 Luer 与充气室的自由女性 Luer 连接起来。另一个雄性Luer将连接到动物加工容器。
3. 动物加工容器的建造（图1D）
- 在大型塑料容器的侧面钻一个孔（直径约4毫米）。这个洞应该是雌性卢尔的直径。塑料容器是需要捕捉多余的固定解决方案。
注：使用了30厘米×22厘米、3.8升塑料储物容器。 - 女性 Luer 的衣线与硅胶垫片制造商，并将较小的侧放入容器的预钻孔中。
- 在女性 Luer 周围添加硅胶垫片制造商，使其进出容器，以确保密封密封。
- 拧一个单向停止公鸡到女性卢尔。来自空气膨胀室的管子将附着在这个停止公鸡。
4. 准备解决方案
- 肝素解决方案
- 在容器中装满无钙PBS和肝素（20 U/mL）。为每只鼠标准备总共 10 mL 肝素溶液。肝素是一种抗凝血剂，可防止输液固定期间血管内形成血块。肝素溶液将用于在灌注固定之前冲洗肺部的血液。
- 固定解决方案
警告：固定剂可能对健康造成危害，应用于化学烟气罩。所有装置都设置在化学烟雾罩中，以防止吸入固定剂。- 在容器中装满无钙PBS和副甲醛（最终浓度为4%）。为每只鼠标准备总共 50 mL 固定解决方案。
注：使用的固定剂类型可能有所不同，将取决于下游组织学研究。
- 在容器中装满无钙PBS和副甲醛（最终浓度为4%）。为每只鼠标准备总共 50 mL 固定解决方案。
5. 准备灌注装置
注：建议使用渗透泵将液体输送到血管中，以确保恒定流速。以下方向用于设置永久泵，每个型号可能不同。或者，如果无法使用永久性泵，可以建造第二个水柱装置，从 35 厘米 H2O 的高度给液体灌注。
- 首先将油管放在滚筒组件周围。
- 将管子固定到刻录柱子中。
- 首先将左操纵杆放在管子周围，然后用顶部固定，然后用右杆固定到位，从而将杠杆固定到位。
- 将管子的近端放入肝素溶液中，将远端放入动物加工容器中。
- 通过运行泵将空气从油管中排出，将肝素溶液预装到管中。
- 将 25G x 5/8"针固定在管子左侧的末端。
6. 准备空气膨胀装置
- 将水柱的注射器放入环架中。
- 测量从动物平台到水柱上的"25 厘米"胶带标记（第 1.2 步）的垂直高度 25 厘米。
- 将水柱管的末端连接到空气室的塞孔上。
- 将空气室的雌性 Luer 的管子连接到动物加工容器上的塞孔上。
注：如果按照 图 1C中描述的充气室构造，则按相反顺序连接管条可能会导致水泄漏到连接气管管的管子中。 - 确保空气室的盖子紧闭。
- 确保动物加工容器外部的塞孔关闭，从水柱通往充气室的管子上的止步器打开。
- 将注射器装满水至"25厘米"标记。水会使注射器通过管子进入空气室。一旦压力被均衡，水就会停止流动。
- 随着化学罩内的环境气压波动，水可能会慢慢渗入膨胀气室。留意注射器内的水位，如有必要，请添加更多。在整个过程中保持水位在"25厘米"标记。
注：通常水位将保持一致，在空气膨胀的第一部分在25厘米HH2O：然而，在固定过程中，可能需要在注射器中添加更多的水。如果水不停止流动，很可能在膨胀空气室内存在空气泄漏。可能需要在 Luers 周围应用更多的硅胶垫片制造商，以防止空气泄漏。
- 随着化学罩内的环境气压波动，水可能会慢慢渗入膨胀气室。留意注射器内的水位，如有必要，请添加更多。在整个过程中保持水位在"25厘米"标记。
7. 动物准备 （图2）
注：此程序已从盖奇等人13修改。我们已经完成了这个程序，成年的雄性小鼠和雌性小鼠的不同年龄，并注意到没有年龄或性别偏见。
- 用五巴比妥钠（150毫克/千克，腹内）对动物实施安乐死。确保动物在开始解剖前死亡。
注：虽然这个程序是在安乐死动物身上进行的，但这个程序可以在活的动物身上进行，利用心脏泵灌整个动物的香水。 - 通过腹壁做两个横切口。在肋骨笼下做第一个切口，在臀部上方做第二个切口。沿着中线从下切口切到上级切口。
- 使用钝剪刀，小心地切入隔膜的侧面。隔膜一被刺穿，肺就会塌陷。
注意：必须小心，以避免刺穿肺部。被刺穿的肺在以后的步骤中充气的可能性较小。 - 沿着隔膜横向切割，打开胸腔。
- 沿着胸骨从西福伊德过程到壶状的切口，横向切开肋骨笼上方，充分暴露心脏和肺部。固定肋骨的两侧。
- 在气管上方的颈部做一个中线切口。去除气管周围的皮肤、肌肉、甲状腺和结缔组织。
- 使用弯曲的钳子，在后气管下滑动两块线或缝合线。使用一块缝合线将通货膨胀的Luer-stub适配器固定到位，并最终使用另一块缝合线在空气膨胀和血管灌注固定结束时将气管绑住。
- 使用 18G x 1" 针或 Vannas 弹簧剪刀在气管上戳一个小孔。
- 将一个20G的Luer-stub适配器放入气管中的这个孔中。
- 将一根线缠绕气管，立即与 Luer-stub 适配器进入的地方保持原位。
- 将动物转移到动物加工容器。
- 将鲁尔-斯图布适配器连接到动物加工容器内部的雌性Luer。
8. 空气膨胀、灌注和肺部固定（图2）
- 将连接到灌注装置管上的 25G x 5/8"针头放入心脏的右心室。
- 切开腹部主动脉，让血液从心脏排出，促进香水通过肺部的流动。
- 打开动物加工容器外部的塞子，使肺部充气。
注意：肺部完全充气可能需要时间。观察注射器中的水位，除非肺部有泄漏，否则不应迅速下降。 - 以 25 cmH2O 充气肺部 5 分钟。25cmH2O 的通货膨胀为肺部提供先决条件，并有助于在选择性肺区域招募人员。
注：可能需要在注射器中加入少量水，以保持 25 厘米的高度。炎症和/或实验诱发的肺损伤可能会影响肺部的通货膨胀。在这种情况下，可能需要将通胀压力提高到最高 35 cmH2O，以协助在选电区域招聘人员。 - 在肺充气的最后一分钟，打开持久性泵，流量为 10 mL/min。肝素溶液应从瓶子流经管子进入动物。
- 肝素输液的目的是防止在血管中形成血栓。因此，注入肝素，直到肺变成白色，没有血液。如果肺部不变白，可能需要调整右心室针头。
- 充气5分钟后，关闭渗透泵，将灌注管从肝素溶液切换到固定液。
- 将水柱注射器降低到"20 厘米"标记（第 1.3 步）。当压力从 25 厘米 20 厘米高 2 O 变化时，气泡在水柱内移动是正常的。
- 检查注射器中的水位。它应该是在"25厘米"标记。此时可能需要添加更多内容。
- 等待1分钟，让肺从25至20厘米H2O放气。
- 以 6.5 mL/min 的流量重新启动灌注泵。
- 血管灌注修复10-15分钟。
9. 肺部提取 （图3）
- 将气管旁的第二根线与 Luer-stub 适配器紧密相连。从气管中取出 Luer-stub 适配器。
- 从心脏取出针头。
- 用钝剪刀将结缔组织后部切入介质，将肺部和心脏从胸腔中解放出来。小心避免刺穿肺部。
- 小心地从肺部取出心脏。
- 将肺部固定过夜。
注：固定性变化的持续时间取决于下游组织学研究。- 将肺放入含有 20-25 mL 固定剂的 50 mL 圆锥管中。将螺纹固定气管通过锥形管的打开，并通过盖子的螺纹固定。倒置锥形管，以确保浮力充气的肺保持完全淹没在固定物中，否则它们将漂浮到液体的顶部。
- 处理肺部进行组织学研究。
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Representative Results
在一个完整的胸腔中，肺部由胸壁通过胸腔空间6，14施加的外力保持开放。在解剖过程中输入隔膜时，胸膜空间的完整性被废除，肺部应崩溃（图2A，2B）。为了重新扩张肺部，空气膨胀被执行。作为第一步，施加25厘米的水压，以确保招募倒塌的空域。因此，当动物饲养容器外的塞公鸡打开时，空气会通过气管进入肺部，并且应很容易观察到通货膨胀（图2C）。肺部完全扩张后，通胀压力降低至20厘米水压（图2D）。选择20厘米的水压是因为它保持了肺部的完全膨胀，但不会过度分散空域。
气管结扎（图3A）及切除胸腔后，肺部应保持充气（图3B）。如果肺在动物准备或提取过程中被刺穿，肺部的通缩（图3C）可能发生。在胸膜表面添加固定剂可能有助于在手术过程中密封轻微泄漏;然而，固定剂应谨慎应用，因为过量可能将肺粘附在胸腔上。固定过程中未密封的任何泄漏在从充气装置中取出后会导致肺衰竭。如果气管没有完全被绑住，肺部的通缩也可能发生。当淹没在固定的，适当膨胀的肺将有更大的浮力比放气的肺。
然后，膨胀的肺可以按照既定的协议1，15进行形态分析。图4，肺部经过冷冻分割处理，并涂有商业手动染色系统。使用传统的液体膨胀（图4A）固定的组织气道流明中很少有免疫细胞。相比之下，炎症细胞通过血管灌注与空气膨胀固定的组织（图4B）在整个空域保存。
图1：仪器的组装。A. 所有仪器的完整组装。 B. 水柱由一个60mL注射器组成，通过180个PVC管和一个双向男性Luer连接到充气室。 C. 一个500mL密封塑料容器用于建造充气室。水柱的雄性Luer连接到一个塞斗鸡连接到一个女性卢尔在房间的墙壁内。另一名女性Luer将油管从充气室连接到动物加工容器。两位女性 Luers 都涂在硅胶垫片制造商中，以确保密封密封。两个雄性Luers连接到管子的两端，将膨胀的气室连接到动物加工容器。 D. 动物通过一个20G的Luer存根适配器连接到空气膨胀室，通过一个洞放入气管。Luer 存根适配器与动物加工容器墙壁内的雌性 Luer 相连。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：动物准备、与空气膨胀室的连接以及肺部的膨胀。A. 安乐死后，动物的腹腔和胸腔暴露在外。肋骨笼被移除或固定，以允许肺部扩张以抑制通货膨胀。Luer 存根适配器插入一个小孔切入气管，并用螺纹或缝合线固定。Luer 存根适配器与动物加工室墙壁内的雌性 Luer 相连。女性 Luer 的另一端连接到一个停止孔，以控制来自充气室的气流（未显示）。 B. 空气膨胀前肺衰竭。 C. 肺被膨胀到25厘米的水压，以招募在电子区域。 D. 当压力变为预定固定压力（20厘米水）时，肺部会稍微放气。还描绘了将一根25G x 5/8针插入右心室，用于肺部血管灌注固定。所有图像均为分辨率为 1590 万像素、纵横比为 4：3 的照片。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：完成气膨胀后肺部抽取，血管灌注固定。A.气管与Luer存根适配器的离心相连，肺部通过切开结缔组织后部到介质提取。B.手术成功后充气肺。C.因空气膨胀室内发生空气泄漏而导致肺部充气不良的例子。请注意，这些肺比成功膨胀的肺小。所有图像均为分辨率为 1590 万像素、纵横比为 4：3 的照片。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：通过心内固定获得的肺组织与血管灌注固定的气膨胀的比较。A. 通过以内舍利为基础的固定保存的肺。 B. 肺由空气膨胀与血管灌注固定保存。 B（插图）。 箭头显示血管灌注固定固定的肺气道中的白细胞;星星在阿尔韦奥利突出白细胞。相比之下，白细胞明显缺乏通过内切途径（A嵌入）固定的肺气道，而白细胞内白细胞则被置换，似乎与上皮细胞有密切接触。缩写： A- 气道， V- 容器.图像放大倍数为 40 倍，A 和 B 插图的放大倍数分别为 100 倍和 200 倍。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
虽然常用，但基于腹内固定的方法会将白细胞从气道中取代，并可以改变正常的肺结构。本协议中提供的血管灌注固定的空气膨胀方法克服了这些陷阱，更准确地保存了肺解剖学。从血管灌注固定方法获得高质量组织的关键包括仔细监测空气膨胀压力，避免空气泄漏，并确保将固定剂充分灌注到血管中。
此过程的一个限制是，当胸腔的完整性被中断时，肺部崩溃和崩溃后肺部的再膨胀对于准确的组织学评估是必要的。协议的替代方案是使用小型动物呼吸机，以保持肺部充气而不崩溃。然而，这种设备往往很贵，这里的协议提供了一个廉价的解决方案。在健康的肺中，由上皮细胞产生的表面活性剂有助于减少表面张力，在大多数情况下，肺很容易重新膨胀。然而，在患病的肺部，组织可能更僵硬，肺表面活性剂功能可以改变，促进肺崩溃。为了减轻这种影响，塌陷区域可以"招募"使用略高的空气膨胀压力（即25厘米H2O）5。然后，压力可以降低，使肺部轻微通缩到生理大小。在我们手中，20厘米水的通胀压力效果良好。比这更高的压力会过度分散藻类，损害血管灌注。相反，低压会导致空域崩溃。类似地，血管灌注压力也必须分流。过量的灌注压力可能会使毛细血管进入肺脏空间，甚至损害毛细血管，导致肺水肿4。另一方面，如果血管灌注压力过低，灌注可能不足。我们发现肝素溶液的流量为 10 mL/min，固定溶液的流量为 6.5 mL/分钟，实现了最佳效果。
检查空气膨胀室是否泄漏是确保血管灌注固定期间持续的通货膨胀压力的必要条件。一旦水被添加到注射器中，它就会流入空气膨胀室的底部，直到压力平衡。可能需要在注射器中添加少量额外水，以保持柱高 25 厘米以防通货膨胀，20 厘米用于固定。如果流入空气膨胀室的流量不停止，硅胶密封剂可能需要更换。
空气泄漏的另一个原因是肺部受损。这通常发生在胸腔的开口或从胸腔中提取肺部期间。因此，必须注意练习和注意，以避免在小鼠准备过程中损害肺部。一个不太常见的原因是肺病理学，它是由严重的肺病造成的。肺部空气泄漏的线索包括从注射器中的液体柱中缓慢排空、发出嘶嘶声或来自肺表面的气泡。在泄漏现场对肺部应用少量固定剂有助于密封小泄漏：然而，某些固定剂可能导致肺部粘合到胸腔，当肺损伤广泛时，一旦消除气压，肺部仍可能崩溃。
一旦评估和管理了任何空气泄漏源，肺部就会充气，并在固定过程中保持充气。气管应在从通货膨胀装置中取出之前，将气管盖在管子下面，以防止崩溃。然后，肺可以处理为组织学研究。肺血管灌注固定的空气膨胀旨在保持气道细胞的数量、形态和位置，同时充分保存全球肺结构结构功能研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由国家心脏、肺和血液研究所 （NHLBI） 资助，授予HL140039 和 HL130938。作者要感谢香农·霍特和贾扎勒·麦克伦登的技术专长。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
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