Luftinflation af muriniske lunger med vaskulær perfusion-fiksering

Summary

Præsenteret er en metode til luft-inflation med vaskulær perfusion-fiksering af lungerne, der bevarer placeringen af celler i luftvejene, alveol og interstitium til struktur-funktion analyser. Konstant luftvejstryk opretholdes med et luftinflationskammer, mens fiksativ er gennemsyret via højre ventrikel. Lunger behandles til histologiske undersøgelser.

Abstract

Lunge histologi bruges ofte til at undersøge de bidrag, som luftrum celler under lunge homøostase og sygdom patogenese. Men, almindeligt anvendte instillation-baserede fiksering metoder kan fortrænge luftrum celler og slim i terminale luftveje og kan ændre væv morfologi. Til sammenligning er vaskulære perfusionsfikseringsteknikker bedre til at bevare placeringen og morfologien af celler i luftrummet og slimhindeforingen. Men hvis positive luftvejstryk ikke samtidig anvendes, regioner af lungerne kan kollapse og kapillærer kan bule ind i alveolær rum, hvilket fører til forvrængning af lunge anatomi. Heri beskriver vi en billig metode til luftinflation under vaskulær perfusionsfiksering for at bevare morfologien og placeringen af luftveje og alveolære celler og interstitium i murin lunger til downstream histologiske undersøgelser. Konstant lufttryk leveres til lungerne via luftrøret fra et forseglet, luftfyldt kammer, der opretholder trykket via en justerbar væskesøjle, mens fiksativ er gennemsyret gennem højre ventrikel.

Introduction

Lunge histologi repræsenterer guldstandarden for vurdering af lungearkitektur under sundhed og sygdom og er et af de mest almindeligt anvendte værktøjer af lungeforskere¹. Et af de mest kritiske aspekter af denne teknik er korrekt isolering og bevarelse af lungevæv, da variation i dette trin kan føre til dårlig vævskvalitet og fejlagtige resultater^1,2,3. Hos levende dyr bestemmes lungevolumen af balancen mellem indadgående elastisk rekyl af lungen og ydre kræfter, der overføres fra brystvæggen og membranen af overfladespænding. Derfor, når brystkassen indtastes, går udadvendte kræfter tabt, og lungen kollapser. Histologiske sektioner fremstillet af kollapsede lunger har et overfyldt udseende, og grænser mellem anatomiske rum (dvs. luftrum, vaskulatur og interstitium) kan være vanskelige at skelne. For at omgå denne udfordring puster forskere ofte lungerne op under kemisk fiksering, så luftrumsstørrelsen og arkitekturen opretholdes.

Lunger kan pustes op med luft eller væske. Det tryk, der er nødvendigt for at oppuste lungerne til samme volumen, varierer mellem luft- og væskeinflation på grund af intermolekyllære kræfter ved luftvæskegrænsefladen. Højere tryk (f.eks. 25 cmH₂O) er påkrævet under luftinflation end flydende inflation (f.eks. 12 cmH₂O) for at overvinde overfladespændinger og åbne det kollapsede alveol⁴. Når alveoler er blevet rekrutteret, et lavere tryk kan holde alveoler åben for samme volumen som trykvolumen kurve plateauer, og trykket udligne i hele lungen i henhold til Pascal's lov^4,5,6,7,8.

To vigtigste metoder til lungeinflation og fiksering findes for at bevare murin lunger for histologi. Oftest er luftrummet indpodet med væske - ofte indeholdende et fiksativ. Den største fordel ved denne tilgang er, at det er relativt let og kræver lidt uddannelse. Mens intratracheal indgydelse af fiksativ kan foretrækkes i undersøgelser, der fokuserer på vaskulaturen, væske, der er indpodet via luftrøret tendens til at skubbe proksimale luftvejsceller og muciner i mere distale luftrum regioner, mens luftinflationen ikke^1,3,4,9^,10,11. Desuden ændrer utilsigtet løsrivelse af leukocytter fra epitelet under flydende inflation deres morfologi, artefaktisk giver dem et simpelt, afrundet udseende^4,10,11,12. Endelig kan inflationen af lungerne med væske utilsigtet komprimere interstitium^4,10,11. Tilsammen kan disse faktorer fordreje den normale anatomi og cellulære fordelinger inden for de bevarede lunger og dermed begrænse teknikken.

En alternativ metode til vævsbevarelse er vaskulær perfusion-fiksering. I denne metode gennemsyres fiksativ i lungebårne vaskulatur via vena cava eller højre ventrikel. Denne metode bevarer placeringen og morfologien af celler i luftrummet lumen. Men medmindre lungerne er oppustet under perfusion-fiksering, lungevævet er tilbøjelige til at kollapse.

Luft-inflation med vaskulær perfusion-fiksering udnytter styrker fra hver af de ovennævnte fiksering teknikker. Heri leverer vi en protokol for denne teknik. De materialer og udstyr, der kræves, er relativt billige og kan nemt opnås og samles. Den færdige opsætning, vist i figur 1A,giver konstant luftvejstryk til lungerne ved hjælp af en justerbar, væskefyldt kolonne, mens en peristaltisk pumpe leverer fiksativ via højre ventrikel. Lunger med konserveret morfologi kan derefter behandles yderligere til strukturfunktionsanalyser.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet i denne protokol, er blevet godkendt af Den Institutionelle Komité for Dyrepleje og Anvendelse (IACUC) for National Jewish Health.

BEMÆRK: Protokollen er organiseret i tre komponenter. Den første komponent beskriver opførelsen af luft-inflation med perfusion / fiksering udstyr. I et andet afsnit beskrives, hvordan du konfigurerer udstyret til et eksperiment. Det sidste afsnit beskriver, hvordan man forbereder dyret og udfører eksperimentet.

1. Konstruktion af vandsøjleapparatet (figur 1B)

1. Fjern stemplet fra en 60 mL slip tip sprøjte.
2. Sæt tapen rundt om sprøjten ved 30 mL-mærket. Indstil sprøjtens højde til dette mærke for det første inflationstryk på 25 cmH₂O. Det er også her vandstanden i kolonnen skal være under hele proceduren. Mærk båndet enten som "25 cm" (som afbildet i figur 1A) eller "inflation".
   BEMÆRK: Et inflationspres på 25 cmH₂O bruges til at sikre rekruttering af kollapsede luftrum. Når alveolerne er blevet rekrutteret, sænkes trykket til 20 cmH₂O for at sikre, at luftrummet ikke udspiles.
3. Mål 5 cm fra båndet mod stempelden, og fastgør et andet stykke tape til sprøjten. Flyt sprøjten ned til dette mærke for at sænke inflationstrykket til 20 cmH₂O under fiksering. Mærk båndet enten som "20 cm" (som afbildet i figur 1A) eller "fiksering".
4. Fastgør 180 pvc-slanger (polyvinylchlorid) til sprøjtens slipspidsende. Slangens længde afhænger af afstanden mellem sprøjten og luftinflationskammeret (ca. 25-30 cm).
5. Placer en mandlig Luer (2) tråd stil tee (1.219 inches længde, 0.904 inches højde, 0.0904 inches indre diameter) i den anden ende af slangen. Denne mandlige Luer vil oprette forbindelse til stophanen i luftinflationskammeret (trin 2.4).

2. Opførelse af luftinflationskammeret (figur 1C)

1. Bor to huller (ca. 4 mm i diameter) i en 500 mL plastbeholder med skrue-on hætte. Hullerne skal have samme størrelse som den kvindelige Luers (1.224 inches længde, 0.312 inches højde, 0.098 inches indre diameter).
   BEMÆRK: Tomme medier eller bufferbeholdere kan bruges til luftinflationskammeret.
2. Coat tråde af kvindelige Luers med silikone pakning maker og placere den mindre side i de forborede huller i beholderen.
3. Tilsæt silikonepakningsproducent omkring de kvindelige Luers, hvor de kommer ind i beholderen for at sikre en lufttæt forsegling.
4. Skru på en envejs stophane på den nederste kvindelige Luer på luft-inflation kammer.
5. Skær slangen til en længde på ca. 25 cm og fastgør mandlige Luers til de frie ender af slangen. Tilslut den mandlige Luer i den ene ende af slangen til den frie kvindelige Luer på luftinflationskammeret. Den anden han Luer vil oprette forbindelse til dyreforarbejdningsbeholderen.

3. Konstruktion af beholderen til forarbejdning af dyr (figur 1D)

1. Bor et hul (ca. 4 mm diameter) i siden af en stor plastbeholder. Hullet skal være diameteren af den kvindelige Luer. Plastbeholderen er nødvendig for at fange overskydende fikseringsopløsning.
   BEMÆRK: Der blev brugt en 30 cm x 22 cm, 3,8 L plastbeholder.
2. Coat tråde af en kvindelig Luer med en silikone pakning maker og placere den mindre side i den predrilled hul i beholderen.
3. Tilsæt silikonepakningsproducent omkring den kvindelige Luer, hvor den kommer ind og forlader beholderen for at sikre en lufttæt forsegling.
4. en envejs stophane på den kvindelige Luer. Slanger fra luft-inflation kammer vil knytte til denne stophane.

4. Udarbejdelse af løsninger

1. Heparin løsning
   1. Fyld en beholder med calciumfri PBS og heparin (20 U/mL). Forbered i alt 10 mL heparin opløsning til hver mus. Heparin er en anti-koagulant, der forhindrer blodpropper i at danne sig i karrene under perfusion-fiksering. Heparin opløsning vil blive brugt til at skylle blod fra lungerne før perfusion-fiksering.
2. Fiksativ løsning
   FORSIGTIG: Fiksativer kan udgøre en sundhedsfare og bør anvendes i en kemisk røghætte. Alle apparater er sat op i en kemisk røghætte for at forhindre indånding af fiksativer.
   1. Fyld en beholder med calciumfri PBS og paraformaldehyd (4% endelig koncentration). Forbered i alt 50 mL fiksativ løsning til hver mus.
      BEMÆRK: Den anvendte type fiksativ kan variere og vil afhænge af downstream histologiske undersøgelser.

5.   Fremstilling af perfusionsapparater

BEMÆRK: En peristaltisk pumpe foreslås til levering af væsker i vaskulatur for at sikre konstant strømningshastighed. Følgende anvisninger er til opsætning af den peristaltiske pumpe og kan være forskellige for hver model. Alternativt, hvis en peristaltisk pumpe ikke er tilgængelig, kan der konstrueres et andet vandsøjleapparat til at gennemtrænge væsker fra en højde på 35 cm H₂O.

1. Først placeres slangen omkring rullesamlingen.
2. Fastgør slangen ind i de hakkede stolper.
3. Lås håndtagene på plads ved først at placere venstre håndtag omkring slangen og fastgøre den på plads med toppen og derefter højre håndtag.
4. Placer den proksimale ende af slangen i heparinopløsningen og den distale ende i dyreforarbejdningsbeholderen.
5. Forindlæs heparinopløsningen i slangen ved at køre pumpen for at uddrive luft fra slangen.
6. Fastgør en 25G x 5/8" nål på enden af venstre side af slangen.

6. Forberedelse af luftinflationsapparater

1. Placer sprøjten til vandsøjlen i en ringholder.
2. Mål en lodret højde på 25 cm fra dyreplatformen til tapemærket "25 cm" (trin 1.2) på vandsøjlen.
3. Fastgør enden af vandsøjlens rør til stophanen på luftkammeret.
4. Fastgør et rør fra den kvindelige Luer af luftkammeret til stophanen på dyreforarbejdningsbeholderen.
   BEMÆRK: Hvis luftinflationskammeret er konstrueret som afbildet i figur 1C, kan fastgørelse af slanger i omvendt rækkefølge få vand til at lække ind i slangen, der forbinder til luftrørets kanyle.
5. Sørg for, at hætten til luftkammeret er tæt lukket.
6. Sørg for, at stophanen på ydersiden af dyreforarbejdningsbeholderen er lukket, og stophanen på slangen, der fører fra vandsøjlen til luftinflationskammeret, er åben.
7. Fyld sprøjten med vand til mærket "25 cm". Vand vil forlade sprøjten gennem slangen ind i luftkammeret. Når trykket er udlignet, vil vandet holde op med at flyde.
   1. Det er muligt, at vand langsomt vil lække ind i luft-inflation kammer som omgivende lufttryk i den kemiske hætte svinger. Hold øje med vandstanden i sprøjten og tilsæt mere, hvis det er nødvendigt. Vandstanden skal være i vandstanden ved mærket "25 cm" under hele proceduren.
      BEMÆRK: Normalt vil vandstanden forblive ensartet for den første del af luftinflationen ved 25 cmH₂O; der vil dog sandsynligvis blive tilsat mere vand til sprøjten under fikseringen. Hvis vandet ikke holder op med at flyde, er det sandsynligt, at der findes en luftlækage i luftinflationskammeret. Mere silikone pakning maker kan være nødvendigt at anvende omkring Luers at forhindre luft lækager.

7. Tilberedning af dyr (figur 2)

BEMÆRK: Denne procedure er blevet ændret fra Gage et al¹³. Vi har afsluttet denne procedure på voksne mandlige og kvindelige mus i forskellige aldre og bemærker ingen alder eller køn bias.

1. Aflive dyret med natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitonealt.). Sørg for, at dyret er dødt, før dissektion påbegyndes.
   BEMÆRK: Mens denne procedure udføres på aflivede dyr, kan denne procedure udføres på levende dyr for at udnytte hjertet til at pumpe perfusates i hele dyret.
2. Lav to laterale snit gennem bugvæggen. Lav det første snit under brystkassen og det andet over hofterne. Skær langs midterlinjen fra det ringere snit mod det overlegne snit.
3. Brug stump saks, forsigtigt gøre et snit ind i den laterale side af mellemgulvet. Lungerne skal kollapse, så snart mellemgulvet er punkteret.
   BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for at undgå at punktere lungerne. En punkteret lunge er mindre tilbøjelige til at puste op under senere trin.
4. Skær tværgående langs mellemgulvet for at åbne brysthulen.
5. Skær overlegent langs brystbenet fra xiphoid processen til halspulsåren hak og sideværts over brystkassen til fuldt ud at udsætte hjerte og lunger. Pin ned siderne af brystkassen.
6. Lav et midternit snit i nakken over luftrøret. Fjern hud, muskler, skjoldbruskkirtlen og bindevæv omkring luftrøret.
7. Brug buede sammenkrump, glide to stykker tråd eller sutur under den bageste luftrør. Brug det ene stykke sutur til at holde inflationen Luer-stub adapter på plads, og bruge den anden i sidste ende til at binde luftrøret ved afslutningen af luft-inflation og vaskulær perfusion-fiksering.
8. Stik et lille hul i luftrøret ved hjælp af en 18G x 1 "nål eller Vannas fjedersaks.
9. Placer en 20G Luer-stub adapter i dette hul i luftrøret.
10. Bind en tråd rundt om luftrøret straks distal til, hvor Luer-stub adapteren kommer ind for at holde den på plads.
11. Overfør dyret til dyreforarbejdningsbeholderen.
12. Fastgør Luer-stub adapteren til den kvindelige Luer på indersiden af dyreforarbejdningsbeholderen.

8. Luftinflation, perfusion og fiksering af lungerne (Figur 2)

1. Placer 25G x 5/8" nål fastgjort til perfusion apparatet slanger i højre ventrikel af hjertet.
2. Skær abdominal aorta at tillade blod at dræne fra hjertet og til at fremme strømmen af perfusat gennem lungerne.
3. Åbn stophanen på ydersiden af dyreforarbejdningsbeholderen for at oppuste lungerne.
   BEMÆRK: Det kan tage tid for lungerne at puste helt op. Se vandstanden i sprøjten, det bør ikke falde hurtigt, medmindre der er en lækage i lungerne.
4. Oppust lungerne ved 25 cmH₂O i 5 minutter. Inflation ved 25 cmH₂O foreviser lungen og hjælper med at rekruttere ate atelektiske lungeregioner.
   BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at tilsættes en lille mængde vand til sprøjten for at opretholde 25 cm højden. Betændelse og/eller eksperimentelt induceret lungeskade kan påvirke inflationen i lungerne. I dette tilfælde kan det være nødvendigt at øge inflationspresset op til højst 35 cmH₂O for at hjælpe med at rekruttere i de valgte regioner.
5. I løbet af det sidste minut af lungeinflationen skal du tænde den peristaltiske pumpe til en strømningshastighed på 10 mL/min. Heparin opløsning skal strømme fra flasken gennem slangen ind i dyret.
   1. Målet med heparin infusion er at forhindre dannelse af thrombi i karrene. Derfor indgyde heparin indtil lungerne bliver hvide og er blottet for blod. Hvis lungerne ikke bliver hvide, kan justering af højre ventrikulær nål være nødvendig.
6. Efter oppustning i 5 minutter skal du slukke for den peristaltiske pumpe og skifte perfusionsslangen fra heparinopløsningen til fiksativt.
7. Sænk vandsøjlesprøjten til mærket "20 cm" (trin 1.3). Det er normalt, at luftbobler bevæger sig inden for vandsøjlen, da trykket skifter fra 25 til 20 cmH₂O.
   1. Kontroller vandstanden i sprøjten. Det skal være på "25 cm" mærket. Det kan være nødvendigt at tilføje mere på dette tidspunkt.
8. Vent i 1 min, så lungerne kan deflatere fra 25 til 20 cmH₂O.
9. Genstart perfusionspumpen med en strømningshastighed på 6,5 mL/min.
10. Vaskulær perfusion-fix i 10 - 15 minutter.

9. Udvinding af lunger (Figur 3)

1. Bind det andet stykke tråd tæt om luftrøret distalt til Luer-stub adapteren. Fjern Luer-stub-adapteren fra luftrøret.
2. Tag nålen ud af hjertet.
3. Frigør lunger og hjerte fra brysthulen ved at skære bindevævet posterior til mediastinum med stump saks. Pas på at undgå at punktere lungerne.
4. Fjern forsigtigt hjertet fra lungerne.
5. Placer lungerne i fiksativ natten over.
   BEMÆRK: Varigheden af fiksativ varierer afhænger af downstream histologiske undersøgelser.
   1. Placer lungerne i et 50 mL konisk rør, der indeholder 20-25 mL fiksativ. Placer tråden, der sikrer luftrøret gennem åbningen af det koniske rør og fastgøres af hættens tråde. Vend det koniske rør for at sikre, at de flydende, luftoppustede lunger forbliver helt nedsænket i fiksativ, ellers vil de flyde til toppen af væsken.
6. Behandl lungerne til histologiske undersøgelser.

Representative Results

I en intakt brystkasse holdes lungerne åbne af ydre kræfter, der påføres af brystvæggen via pleuralrummet^6,14. Når mellemgulvet indtastes under dissektionen, afskaffes pleuralrummets integritet, og lungerne skal kollapse (Figur 2A, 2B). For at udvide lungerne igen udføres luftinflationen. Som et første skridt anvendes 25 cm vandtryk for at sikre rekruttering af kollapsede luftrum. Når stophanen uden for dyreholdsbeholderen åbnes, vil luften derfor komme ind i lungerne via luftrøret, og inflationen skal let observeres (Figur 2C). Når lungerne er fuldt udvidet, sænkes inflationstrykket til 20 cm vandtryk (Figur 2D). De 20 cm vandtryk vælges, fordi det opretholder fuldstændig inflation af lungerne, men ikke over-udspilde luftrummet.

Lungerne skal forblive oppustede efter luftrørs ligation (Figur 3A) og efter fjernelse fra brystkassen (Figur 3B). Deflation af lunger (Figur 3C) kan forekomme, hvis lungerne punkteres under dyreforberedelse eller ekstraktion. Tilføjelse af fiksativ til lungeoverfladen kan hjælpe med at forsegle mindre lækager under proceduren; fiksativ bør dog anvendes forsigtigt, da overskydende kan klæbe lungerne til brysthulen. Eventuelle lækager, der ikke er forseglet under fiksering, vil resultere i kollapsede lunger ved fjernelse fra luftinflationsapparaterne. Deflation af lungerne kan også forekomme, hvis luftrøret ikke er helt bundet. Når nedsænket i fiksativ, korrekt oppustede lunger vil have større opdrift end deflaterede lunger.

Oppustede lunger kan derefter behandles til histologiske analyser i henhold til fastlagte protokoller^1,15. For figur 4blev lungerne behandlet til frosne sektioner og farves med et kommercielt manuelt farvningssystem. Meget få immunceller er til stede i luftvejene lumen af væv fastgjort ved hjælp af traditionel væskebaseret inflation (Figur 4A). I modsætning hertil bevares inflammatoriske celler i hele luftrummet i væv, der er fastgjort via vaskulær perfusion med luftinflation (Figur 4B).

Figur 1: Samling af apparater. A. Fuld samling af alle apparater. B. Vandsøjlen består af en 60 mL sprøjte forbundet til luft-inflation kammer via 180 PVC slanger og en to-vejs mandlige Luer. C. En 500 mL forseglet plastbeholder blev brugt til at konstruere luft-inflation kammer. Vandsøjlens mandlige Luer forbinder til en stophane forbundet med en kvindelig Luer inden for kammerets vægge. En ekstra hun Luer forbinder slanger fra luftinflationskammeret til dyreforarbejdningsbeholderen. Begge kvindelige Luers er belagt med silikone pakning maker for at sikre en lufttæt forsegling. To han luers er forbundet til begge ender af slanger, som forbinder luft-inflation kammer til dyreforarbejdning beholder. D. Dyr er fastgjort til luft-inflation kammer gennem en 20G Luer stub adapter placeret gennem et hul i luftrøret. Luer stubadapteren er forbundet til en hun luer inden for dyreforarbejdningsbeholderens vægge. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Dyreforberedelse, tilslutning til luftinflationskammeret og lungeinflation. A. Efter aktiv dødshjælp udsættes dyrets bug- og brysthulrum. Brystkassen fjernes eller fastgøres for at tillade udvidelse af lungerne ved inflation. En Luer stub adapter indsættes i et lille hul skåret i luftrøret og fastgøres med tråd eller sutur. Luer stubadapteren er forbundet med en hun luer i væggen i dyreforarbejdningskammeret. Den anden ende af den kvindelige Luer er fastgjort til en stophane for at kontrollere luftstrømmen fra luftinflationskammeret (ikke vist). B. Kollapsede lunger før luftinflation. C. Lungerne er oppustet til 25 cm vandtryk for at rekruttere atelektasiske regioner. D. Når trykket ændres til det tilsigtede fikseringstryk (20 cm vand), deflaterer lungerne lidt. Også afbildet er placering af en 25G x 5/8 nål i højre ventrikel for vaskulær perfusion-fiksering af lungen. Alle billeder er fotografier med en opløsning på 15,9 megapixel og ved 4:3 billedformat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Udvinding af lunger efter afslutning af luftinflation med vaskulær perfusionsfiksering. A. Luftrøret er bundet distal til Luer stub adapter og lunger er ekstraheret ved at skære bindevæv posterior til mediastinum. B. Luft-oppustede lunger efter vellykket proceduremæssig afslutning. C. Eksempel på dårligt oppustede lunger, der skyldes en luftlækage, der opstod i luftinflationskammeret. Bemærk disse lunger er mindre end de med succes oppustede lunger. Alle billeder er fotografier med en opløsning på 15,9 megapixel og ved 4:3 billedformat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Sammenligning af lungevæv opnået ved intratrachealbaseret fiksering versus luftinflation med vaskulær perfusionsfiksering. A. Lunger bevaret af intratracheal-baseret fiksering. B. Lunger bevaret af luft-inflation med vaskulær perfusion-fiksering. B (indsat). Pile viser leukocytter i luftvejene i en lunge fastgjort af vaskulær perfusion-fiksering; stjerner fremhæver leukocytter i alveolerne. Til sammenligning er leukocytter især fraværende i luftvejene i lungerne, der er fastgjort via intratrachealruten (A-inset), og intra-alveolær leukocytter fortrænges, hvilket ser ud til at være i tæt kontakt med epitelceller. Forkortelser: A- luftveje, V- fartøj. Forstørrelse af billeder er 40x med henholdsvis 100x og 200x for A- og B-insets. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Selvom det er almindeligt anvendt, fortrænger intratrachealbaserede fikseringsmetoder leukocytter fra luftvejene og kan ændre normal lungearkitektur. Metoden til luft-inflation med vaskulær perfusion-fiksering, der er fastsat i denne protokol overvinder disse faldgruber og mere præcist bevarer lunge anatomi. Nøglen til at opnå væv af høj kvalitet fra vaskulær perfusion-fikseringsmetoden omfatter omhyggelig overvågning af luftinflationstryk, undgåelse af luftlækager og sikring af tilstrækkelig perfusion af fiksativ i vaskulaturen.

En begrænsning af denne procedure er, at når thoraxens integritet afbrydes, er lungernes sammenbrud og genopinflation af lungerne efter sammenbrud nødvendig for nøjagtig histologisk vurdering. Et alternativ til protokollen, der ville opretholde lungeinflation uden sammenbrud ville være brugen af et lille dyr respirator. Men sådant udstyr er ofte dyrt, og protokollen her tilbyder en billig løsning. I raske lunger hjælper overfladeaktivt produceret af alveolær epitelceller med at reducere overfladespændingen, og i de fleste tilfælde kan lungerne let udvides igen. Men i syge lunger, væv kan være stivere og lunge overfladeaktive funktion kan ændres, fremme lunge sammenbrud. For at afbøde denne virkning kan kollapsede områder "rekrutteres" ved hjælp af lidt højere luftinflationstryk (dvs. 25 cmH₂O)⁵. Trykket kan derefter reduceres for at tillade let deflation af lungerne til fysiologisk størrelse. I vores hænder fungerer et inflationstryk på 20 cm vand godt. Tryk højere end dette kan over-udrede alveolerne og forringe vaskulær perfusion. Omvendt resulterer lavtryk i, at luftrummet kollapser. På samme måde skal vaskulært perfusionstryk også titreres. Overdreven perfusionstryk kan udlede kapillærer i alveolæren eller endda beskadige kapillærerne og forårsage lungeødem⁴. På den anden side, hvis vaskulær perfusion pres er for lav, perfusion kan være utilstrækkelig. Vi har konstateret, at flowhastigheder på 10 mL/min for heparinopløsningen og 6,5 mL/min for den fiksative løsning opnår et optimalt resultat.

Kontrol af luftinflationskammeret for lækager er afgørende for at sikre konstant inflationstryk under vaskulær perfusionsfiksering. Når der tilsættes vand til sprøjten, skal det strømme ind i bunden af luftinflationskammeret, indtil trykket udlignes. Det kan være nødvendigt at tilsættes en lille mængde ekstra vand til sprøjten for at opretholde en kolonnehøjde på 25 cm for inflation og 20 cm til fiksering. Silikoneforseglingsmiddel skal muligvis udskiftes, hvis strømmen ind i luftinflationskammeret ikke ophører.

En anden årsag til luftlækage er skader på lungerne. Dette forekommer oftest under åbning af brysthulen eller under udvinding af lungerne fra brystkassen. Således skal praksis og stor omhu tages for at undgå at beskadige lungen under museforberedelse. En mindre almindelig årsag er lungepatologi, der skyldes alvorlig lungesygdom. Spor til luft lækager fra lungerne omfatter langsom tømning fra væsken kolonne i sprøjten, en hvislende lyd eller bobler, der kommer fra lungeoverfladen. Anvendelse af en lille mængde fiksativ på lungerne på stedet for lækagen kan hjælpe med at forsegle små lækager; men visse fikseringsmiddel kan forårsage tilslutning af lungerne til brysthulen, og når lungeskader er omfattende, lungerne kan stadig kollapse, når lufttrykket er fjernet.

Når nogen kilder til luftlækage er blevet vurderet og forvaltet, lungerne skal pustes op og forblive oppustet under fiksering. Luftrøret skal nedtones under kanylen, før den fjernes fra inflationsapparatet for at forhindre sammenbrud. Lunger kan derefter behandles til histologiske undersøgelser. Luftinflation med vaskulær perfusion-fiksering af lunger har til formål at bevare antallet, morfologien og placeringen af luftvejsceller, samtidig med at den globale lungearkitektur bevares tilstrækkeligt til histologiske strukturfunktionsundersøgelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container