Summary
Gepresenteerd is een methode voor luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie van de longen die de locatie van cellen in luchtwegen, longblaasjes en interstitium behoudt voor structuur-functieanalyses. Constante luchtwegdruk wordt gehandhaafd met een luchtinflatiekamer, terwijl fixatief wordt toegediend via de rechter ventrikel. Longen worden verwerkt voor histologische studies.
Abstract
Longhestologie wordt vaak gebruikt om de bijdragen van luchtruimcellen tijdens longhomeostase en pathogenese van ziekten te onderzoeken. Veelgebruikte fixatiemethoden op basis van instillatie kunnen echter luchtruimcellen en slijm in terminale luchtwegen verplaatsen en de weefselmorfologie veranderen. Ter vergelijking: vasculaire perfusie-fixatietechnieken zijn superieur in het behoud van de locatie en morfologie van cellen in luchtruimen en de mucosale bekleding. Als positieve luchtwegdruk echter niet tegelijkertijd wordt toegepast, kunnen delen van de longen instorten en kunnen haarvaten uitpuilen in de alveolaire ruimtes, wat leidt tot vervorming van de longanatomie. Hierin beschrijven we een goedkope methode voor luchtinflatie tijdens vasculaire perfusie-fixatie om de morfologie en locatie van luchtweg- en alveolaire cellen en interstitium in muizenlongen te behouden voor downstream histologische studies. Constante luchtdruk wordt via de luchtpijp aan de longen afgegeven vanuit een afgesloten, met lucht gevulde kamer die de druk handhaaft via een instelbare vloeistofkolom terwijl het fixatief door de rechter ventrikel wordt geperfundeerd.
Introduction
Longhestologie vertegenwoordigt de gouden standaard voor het beoordelen van longarchitectuur tijdens gezondheid en ziekte en is een van de meest gebruikte hulpmiddelen door longonderzoekers1. Een van de meest kritische aspecten van deze techniek is de juiste isolatie en behoud van longweefsel, omdat variabiliteit in deze stap kan leiden tot slechte weefselkwaliteit en onjuiste resultaten1,2,3. Bij levende dieren wordt het longvolume bepaald door de balans tussen de naar binnen gerichte elastische terugslag van de long en de naar buiten gerichte krachten die door de borstwand en het middenrif worden overgedragen door oppervlaktespanning. Dienovereenkomstig, wanneer de thorax wordt binnengegaan, gaan de uiterlijke krachten verloren en klapt de long in. Histologische secties bereid uit ingeklapte longen hebben een druk uiterlijk en grenzen tussen anatomische compartimenten (d.w.z. luchtruimen, vasculatuur en interstitium) kunnen moeilijk te onderscheiden zijn. Om deze uitdaging te omzeilen, blazen onderzoekers vaak de longen op tijdens chemische fixatie, zodat de grootte en architectuur van het luchtruim behouden blijven.
Longen kunnen worden opgeblazen met lucht of vloeistof. De druk die nodig is om de longen tot hetzelfde volume op te blazen, verschilt tussen lucht- en vloeistofinflatie als gevolg van intermoleculaire krachten op het lucht-vloeistofinterface. Hogere druk (bijv. 25 cmH2O) is vereist tijdens luchtinflatie dan vloeistofinflatie (bijv. 12 cmH2O) om oppervlaktespanning te overwinnen en de ingeklapte longblaasjes te openen4. Zodra longblaasjes zijn gerekruteerd, kan een lagere druk de longblaasjes openhouden tot hetzelfde volume als de druk-volumecurveplateaus, en de druk egaliseert in de hele long volgens de wet van Pascal4,5,6,7,8.
Er bestaan twee belangrijke methoden voor longinflatie en fixatie om muizenlongen te behouden voor histologie. Meestal zijn de luchtruimen doordrongen van vloeistof - vaak met een fixatief. Het grote voordeel van deze aanpak is dat het relatief eenvoudig is en weinig training vereist. Hoewel intratracheale instillatie van fixatief de voorkeur kan hebben in studies die zich richten op de vasculatuur, heeft vloeistof die via de luchtpijp wordt ingebracht de neiging om proximale luchtwegcellen en mucines in meer distale luchtruimgebieden te duwen, terwijl luchtinflatie niet1,3,4,9,10,11. Bovendien verandert onbedoelde onthechting van leukocyten van het epitheel tijdens vloeibare inflatie hun morfologie, waardoor ze artefactueel een eenvoudig, afgerond uiterlijk krijgen4,10,11,12. Ten slotte kan inflatie van de longen met vloeistof onbedoeld het interstitium4,10,11comprimeren. Samen kunnen deze factoren de normale anatomie en cellulaire verdelingen in de bewaarde longen verstoren, waardoor de techniek wordt beperkt.
Een alternatieve methode voor weefselbehoud is vasculaire perfusie-fixatie. Bij deze methode wordt fixatief via de vena cava of de rechter ventrikel in de pulmonale vasculatuur geperfundeerd. Deze methode behoudt de locatie en morfologie van cellen in het luchtruim lumen. Tenzij de longen echter worden opgeblazen tijdens perfusiefixatie, zal het longweefsel waarschijnlijk instorten.
Luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie maakt gebruik van sterke punten van elk van de bovenstaande fixatietechnieken. Hierin geven we een protocol voor deze techniek. De benodigde materialen en apparatuur zijn relatief goedkoop en kunnen eenvoudig worden verkregen en gemonteerd. De voltooide opstelling, weergegeven in figuur 1A,zorgt voor een constante luchtwegdruk op de longen door middel van een verstelbare, met vloeistof gevulde kolom, terwijl een peristaltische pomp fixatief levert via de rechter ventrikel. Longen met geconserveerde morfologie kunnen dan verder worden verwerkt voor structuur-functieanalyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van National Jewish Health.
OPMERKING: Het protocol is georganiseerd in drie componenten. Het eerste onderdeel beschrijft de constructie van de luchtinflatie met perfusie-/fixatieapparatuur. In een tweede sectie wordt beschreven hoe u de apparatuur voor een experiment instelt. In het laatste gedeelte wordt beschreven hoe het dier moet worden voorbereid en het experiment moet worden uitgevoerd.
1. Constructie van het waterkolomapparaat (figuur 1B)
- Verwijder de zuiger uit een spuit met slippunt van 60 ml.
- Bevestig tape rond de spuit op de 30 ml markering. Stel de hoogte van de spuit in op deze markering voor de initiële bandenspanning van 25 cmH2O. Dit is ook waar het waterniveau in de kolom gedurende de hele procedure moet zijn. Label de tape als "25 cm" (zoals afgebeeld in figuur 1A)of "inflatie".
OPMERKING: Een bandenspanning van 25 cmH2O wordt gebruikt om de rekrutering van ingestorte luchtruimen te garanderen. Zodra longblaasjes zijn gerekruteerd, wordt de druk verlaagd tot 20 cmH2O om ervoor te zorgen dat de luchtruimen niet opzwollen. - Meet 5 cm van de tape naar het uiteinde van de zuiger en bevestig nog een stuk tape aan de spuit. Beweeg de spuit naar beneden naar deze markering om de bandenspanning te verlagen tot 20 cmH2O tijdens de fixatie. Label de tape als "20 cm" (zoals afgebeeld in figuur 1A)of "fixatie".
- Bevestig 180 polyvinylchloride (PVC) buizen aan het uiteinde van de spuit. De lengte van de slang is afhankelijk van de afstand tussen de spuit en de luchtinflatiekamer (ongeveer 25-30 cm).
- Plaats een mannelijk Luer (2) draadstijl T-stuk (1,219 inch lang, 0,904 inch hoog, 0,0904 inch binnendiameter) in het andere uiteinde van de buis. Deze mannelijke Luer zal verbinding maken met de stopkraan van de luchtinflatiekamer (stap 2.4).
2. Constructie van de luchtinflatiekamer (figuur 1C)
- Boor twee gaten (ongeveer 4 mm in diameter) in een plastic container van 500 ml met een schroefdop. De gaten moeten dezelfde grootte hebben als de vrouwelijke Luers (1.224 inch lengte, 0.312 inch hoogte, 0.098 inch binnendiameter).
OPMERKING: Lege media of buffercontainers kunnen worden gebruikt voor de luchtinflatiekamer. - Bedek draden van vrouwelijke Luers met siliconen pakkingmaker en plaats de kleinere kant in de voorgeboorde gaten van de container.
- Voeg siliconen pakkingmaker toe rond de vrouwelijke Luers waar ze de container binnenkomen om een luchtdichte afdichting te garanderen.
- Schroef een eenrichtingsstopkraan op de onderste vrouwelijke Luer op de luchtinflatiekamer.
- Knip buizen tot de lengte van ongeveer 25 cm en bevestig mannelijke Luers aan de vrije uiteinden van de buis. Verbind de mannelijke Luer aan het ene uiteinde van de buis met de vrije vrouwelijke Luer op de luchtinflatiekamer. De andere mannelijke Luer zal verbinding maken met de dierverwerkende container.
3. Constructie van de dierverwerkingscontainer (figuur 1D)
- Boor een gat (ongeveer 4 mm diameter) in de zijkant van een grote plastic container. Het gat moet de diameter van de vrouwelijke Luer hebben. De plastic container is nodig om overtollige fixatie-oplossing op te vangen.
OPMERKING: Een plastic opslagcontainer van 30 cm x 22 cm, 3,8 L werd gebruikt. - Bedek draden van een vrouwelijke Luer met een siliconen pakkingmaker en plaats de kleinere kant in het voorgedrillde gat van de container.
- Voeg siliconen pakkingmaker toe rond de vrouwelijke Luer waar deze de container in en uit gaat om een luchtdichte afdichting te garanderen.
- Schroef een eenrichtingsstopkraan op de vrouwelijke Luer. Slangen van de luchtinflatiekamer zullen zich aan deze stopkraan hechten.
4. Bereiding van oplossingen
- Heparine oplossing
- Vul een container met calciumvrij PBS en heparine (20 E/ml). Bereid in totaal 10 ml heparine-oplossing voor elke muis. Heparine is een antistollingsmiddel dat voorkomt dat zich tijdens perfusiefixatie bloedstolsels in de bloedvaten vormen. Heparine-oplossing zal worden gebruikt om bloed uit de longen te spoelen voorafgaand aan perfusie-fixatie.
- Fixatieve oplossing
LET OP: Fixatieven kunnen een gevaar voor de gezondheid opleveren en moeten worden gebruikt in een chemische zuurkast. Alle apparaten zijn opgesteld in een chemische zuurkast om inademing van fixatieven te voorkomen.- Vul een container met calciumvrij PBS en paraformaldehyde (4% eindconcentratie). Bereid een totaal van 50 ml fixatieve oplossing voor elke muis.
OPMERKING: Het type fixatief dat wordt gebruikt, kan variëren en is afhankelijk van downstream histologische studies.
- Vul een container met calciumvrij PBS en paraformaldehyde (4% eindconcentratie). Bereid een totaal van 50 ml fixatieve oplossing voor elke muis.
5. Voorbereiding van perfusieapparatuur
OPMERKING: Een peristaltische pomp wordt voorgesteld voor de afgifte van vloeistoffen in vasculatuur om een constant debiet te garanderen. De volgende aanwijzingen zijn voor het instellen van de peristaltische pomp en kunnen voor elk model anders zijn. Als alternatief, als een peristaltische pomp niet beschikbaar is, kan een tweede waterkolomapparaat worden gebouwd om vloeistoffen te perfuseren vanaf een hoogte van 35 cm H2O.
- Plaats eerst de buizen rond de rolassemblage.
- Bevestig de slang in de ingekepingen.
- Zet de hendels op hun plaats door eerst de linkerhendel rond de slang te plaatsen en deze met de bovenkant en vervolgens de rechterhendel op zijn plaats te zetten.
- Plaats het proximale uiteinde van de slang in de heparine-oplossing en het distale uiteinde in de container voor dierverwerking.
- Laad de heparineoplossing vooraf in de slang door de pomp te laten draaien om lucht uit de buis te verdrijven.
- Bevestig een 25G x 5/8"-naald aan het uiteinde van de linkerkant van de slang.
6. Voorbereiding van luchtinflatieapparatuur
- Plaats de spuit voor de waterkolom in een ringhouder.
- Meet een verticale hoogte van 25 cm vanaf het dierenplatform tot het tapemerk "25 cm" (stap 1.2) op de waterkolom.
- Bevestig het uiteinde van de buis van de waterkolom aan de stopkraan op de luchtkamer.
- Bevestig een buis van de vrouwelijke Luer van de luchtkamer aan de stopkraan op de dierlijke verwerkingscontainer.
OPMERKING: Als de luchtinflatiekamer is geconstrueerd zoals afgebeeld in figuur 1C,kan het bevestigen van slangen in omgekeerde volgorde ervoor zorgen dat water lekt in de buis die verbinding maakt met de tracheale canule. - Zorg ervoor dat de dop naar de luchtkamer goed gesloten is.
- Zorg ervoor dat de stopkraan aan de buitenkant van de dierverwerkingscontainer gesloten is en dat de stopkraan op de buis die van de waterkolom naar de luchtinflatiekamer leidt, open is.
- Vul de spuit met water tot de markering "25 cm". Water verlaat de spuit via de slang in de luchtkamer. Zodra de druk is gelijk gemaakt, zal het water stoppen met stromen.
- Het is mogelijk dat water langzaam in de luchtinflatiekamer lekt als de omgevingsluchtdruk in de chemische kap fluctueert. Houd het waterniveau in de spuit in de gaten en voeg indien nodig meer toe. Houd het waterniveau gedurende de hele procedure op de markering "25 cm".
OPMERKING: Gewoonlijk blijven de waterstanden consistent voor het eerste deel van de luchtinflatie bij 25 cmH2O; tijdens de fixatie zal echter waarschijnlijk meer water aan de spuit moeten worden toegevoegd. Als het water niet stopt met stromen, is het waarschijnlijk dat er een luchtlek bestaat in de luchtinflatiekamer. Mogelijk moet er meer siliconen pakkingmaker rond de Luers worden aangebracht om luchtlekken te voorkomen.
- Het is mogelijk dat water langzaam in de luchtinflatiekamer lekt als de omgevingsluchtdruk in de chemische kap fluctueert. Houd het waterniveau in de spuit in de gaten en voeg indien nodig meer toe. Houd het waterniveau gedurende de hele procedure op de markering "25 cm".
7. Bereiding van dieren (Figuur 2)
OPMERKING: Deze procedure is gewijzigd door Gage et al13. We hebben deze procedure voltooid bij volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen van verschillende leeftijden en merken geen leeftijds- of geslachtsbias op.
- Euthanaseer het dier met natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneaal.). Zorg ervoor dat het dier dood is voordat u begint met dissectie.
OPMERKING: Hoewel deze procedure wordt uitgevoerd op geëuthanaseerde dieren, kan deze procedure worden uitgevoerd op levende dieren om het hart te gebruiken om perfusaten door het hele dier te pompen. - Maak twee laterale incisies door de buikwand. Maak de eerste incisie onder de ribbenkast en de tweede boven de heupen. Snijd langs de middellijn van de inferieure incisie naar de superieure incisie.
- Maak met een stompe schaar voorzichtig een incisie in de laterale kant van het diafragma. De longen moeten instorten zodra het middenrif wordt doorboord.
OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat de longen niet worden doorboord. Een doorboorde long zal minder snel opblazen tijdens latere stappen. - Snijd dwars langs het diafragma om de thoracale holte te openen.
- Snijd superieur langs het borstbeen van het xiphoid-proces naar de jugulaire inkeping en zijdelings boven de ribbenkast om het hart en de longen volledig bloot te leggen. Pin de zijkanten van de ribbenkast vast.
- Maak een middellijnincisie in de nek boven de luchtpijp. Verwijder huid, spieren, schildklier en bindweefsel rond de luchtpijp.
- Schuif met een gebogen tang twee stukken draad of hechtdraad onder de achterste luchtpijp. Gebruik het ene stuk hechtdraad om de luer-stub-adapter op zijn plaats te houden en gebruik het andere uiteindelijk om de luchtpijp af te binden aan het einde van luchtinflatie en vasculaire perfusie-fixatie.
- Prik een klein gaatje in de luchtpijp met een 18G x 1" naald of Vannas veerschaar.
- Plaats een 20G Luer-stub adapter in dit gat in de luchtpijp.
- Bind een draad rond de luchtpijp onmiddellijk distal naar waar de Luer-stub adapter binnenkomt om het op zijn plaats te houden.
- Breng het dier over naar de dierverwerkingscontainer.
- Bevestig de Luer-stub adapter aan de vrouwelijke Luer aan de binnenkant van de dierverwerkingscontainer.
8. Luchtinflatie, perfusie en fixatie van de longen (Figuur 2)
- Plaats de 25G x 5/8"-naald die aan de slang van het perfusieapparaat is bevestigd in de rechterkamer van het hart.
- Snijd de abdominale aorta om het bloed uit het hart te laten wegvloeien en om de doorbloeding door de longen te bevorderen.
- Open de stopkraan aan de buitenkant van de dierlijke verwerkingscontainer om de longen op te blazen.
OPMERKING: Het kan even duren voor de longen volledig zijn opgeblazen. Let op het waterniveau in de spuit, het mag niet snel dalen, tenzij er een lek in de longen is. - Blaas de longen op bij 25 cmH2O gedurende 5 minuten. Inflatie bij 25 cmH2O stelt de long voor en helpt bij het werven van atelectatische longgebieden.
OPMERKING: Mogelijk moet een kleine hoeveelheid water aan de spuit worden toegevoegd om de hoogte van 25 cm te behouden. Ontsteking en/of experimenteel geïnduceerd longletsel kan de inflatie van de longen beïnvloeden. In dit geval kan het nodig zijn om de inflatiedruk te verhogen tot een maximum van 35 cmH2O om te helpen bij het werven van atelectatische regio's. - Schakel tijdens de laatste minuut van de longinflatie de peristaltische pomp in tot een debiet van 10 ml / min. Heparine-oplossing moet uit de fles door de slang in het dier stromen.
- Het doel van heparine-infusie is om de vorming van trombi in de bloedvaten te voorkomen. Dienovereenkomstig, infundeer heparine totdat de longen wit worden en verstoken zijn van bloed. Als de longen niet wit worden, kan aanpassing van de rechterventrikelnaald nodig zijn.
- Schakel na het opblazen gedurende 5 minuten de peristaltische pomp uit en schakel de perfusieslang van de heparine-oplossing naar het fixatief.
- Laat de spuit met waterkolom zakken tot het merkteken "20 cm" (stap 1.3). Het is normaal dat luchtbellen binnen de waterkolom bewegen als de druk verandert van 25 tot 20 cmH2O.
- Controleer het waterniveau in de spuit. Het moet op het merk "25 cm" zijn. Het kan nodig zijn om op dit moment meer toe te voegen.
- Wacht 1 minuut om de longen te laten leeglopen van 25 tot 20 cmH2O.
- Start de perfusiepomp opnieuw op met een debiet van 6,5 ml/min.
- Vasculaire perfusie-fix gedurende 10 - 15 minuten.
9. Extractie van longen (Figuur 3)
- Bind het tweede stuk draad rond de luchtpijp distal stevig vast aan de Luer-stub adapter. Verwijder de Luer-stub adapter uit de luchtpijp.
- Verwijder de naald uit het hart.
- Bevrijd de longen en het hart van de thoracale holte door het bindweefsel achter het mediastinum met een stompe schaar door te knippen. Zorg ervoor dat u de longen niet doorprikt.
- Verwijder voorzichtig het hart uit de longen.
- Plaats de longen een nacht fixatief.
OPMERKING: De duur van het fixatief varieert afhankelijk van downstream histologische studies.- Plaats de longen in een conische buis van 50 ml met 20-25 ml fixatief. Plaats de draad die de luchtpijp vastmaakt door de opening van de conische buis en zet vast aan de draden van de dop. Keer de conische buis om om ervoor te zorgen dat de drijvende, aan de lucht opgeblazen longen volledig ondergedompeld blijven in fixatief, anders zullen ze naar de bovenkant van de vloeistof drijven.
- Verwerk de longen voor histologische studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een intacte thorax worden de longen opengehouden door naar buiten gerichte krachten die door de borstwand worden uitgeoefend via de pleurale ruimte6,14. Wanneer het diafragma tijdens de dissectie wordt betreden, wordt de integriteit van de pleurale ruimte opgeheven en moeten de longen instorten (Figuur 2A, 2B). Om de longen opnieuw uit te zetten, wordt luchtinflatie uitgevoerd. Als eerste stap wordt 25 cm waterdruk toegepast om de rekrutering van ingestorte luchtruimen te garanderen. Dienovereenkomstig, wanneer de stopkraan buiten de houder van het dier wordt geopend, zal lucht via de luchtpijp de longen binnendringen en moet inflatie gemakkelijk worden waargenomen(figuur 2C). Zodra de longen volledig zijn uitgevouwen, wordt de bandenspanning verlaagd tot 20 cm waterdruk(figuur 2D). De 20 cm waterdruk is gekozen omdat het de longen volledig opblaa blijft, maar de luchtruimen niet overseed.
De longen moeten opgeblazen blijven na tracheale ligatie (figuur 3A) en na verwijdering uit de thorax (figuur 3B). Deflatie van de longen (Figuur 3C) kan optreden als de longen worden doorboord tijdens de bereiding of extractie van het dier. Het toevoegen van fixatief aan het pleurale oppervlak kan helpen bij het afdichten van kleine lekken tijdens de procedure; fixatief moet echter voorzichtig worden toegepast, omdat overtollige longen aan de thoracale holte kan hechten. Eventuele lekken die tijdens de fixatie niet worden afgedicht, zullen resulteren in ingeklapte longen bij verwijdering uit de luchtinflatieapparaten. Deflatie van de longen kan ook optreden als de luchtpijp niet volledig is afgebonden. Wanneer ondergedompeld in fixatieve, goed opgeblazen longen een groter drijfvermogen hebben dan leeggelopen longen.
Opgeblazen longen kunnen vervolgens worden verwerkt voor histologische analyses volgens vastgestelde protocollen1,15. Voor figuur 4werden longen verwerkt voor bevroren secties en gekleurd met een commercieel handmatig kleuringssysteem. Zeer weinig immuuncellen zijn aanwezig in de luchtweglumen van weefsel dat is gefixeerd met behulp van traditionele op vloeistof gebaseerde inflatie(figuur 4A). Ontstekingscellen daarentegen worden in het hele luchtruim bewaard in weefsel dat is gefixeerd via vasculaire perfusie met luchtinflatie (figuur 4B).
Figuur 1: Assemblage van apparaten. Een. Volledige montage van alle apparaten. B. De waterkolom bestaat uit een spuit van 60 ml die via 180 PVC-buizen op de luchtinflatiekamer is aangesloten en een mannelijke Luer in twee banen. C. Een 500 ml verzegelde plastic container werd gebruikt om de luchtinflatiekamer te bouwen. De mannelijke Luer van de waterkolom maakt verbinding met een stopkraan die verbonden is met een vrouwelijke Luer binnen de muren van de kamer. Een extra vrouwelijke Luer verbindt slangen van de luchtinflatiekamer met de dierlijke verwerkingscontainer. Beide vrouwelijke Luers zijn gecoat met siliconen pakkingmaker om een luchtdichte afdichting te garanderen. Twee mannelijke Luers zijn verbonden met beide uiteinden van de buis die de luchtinflatiekamer verbindt met de dierverwerkingscontainer. D. Dieren worden aan de luchtinflatiekamer bevestigd via een 20G Luer stub adapter die door een gat in de luchtpijp wordt geplaatst. De Luer stub adapter is aangesloten op een vrouwelijke Luer binnen de wanden van de dierverwerkingscontainer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Diervoorbereiding, verbinding met de luchtinflatiekamer en opblaas van de longen. Een. Na euthanasie worden de peritoneale en thoracale holtes van het dier blootgelegd. De ribbenkast wordt verwijderd of vastgepind om uitzetting van de longen bij inflatie mogelijk te maken. Een Luer stub adapter wordt in een klein gaatje gesneden in de luchtpijp en vastgezet met draad of hechtdraad. De Luer stub adapter is aangesloten op een vrouwelijke Luer binnen de wand van de dierlijke verwerkingskamer. Het andere uiteinde van de vrouwelijke Luer is bevestigd aan een stopkraan om de luchtstroom uit de luchtinflatiekamer te regelen (niet weergegeven). B. Ingeklapte longen voor luchtinflatie. C. Longen worden opgeblazen tot 25 cm waterdruk om atelectase gebieden te rekruteren. D. Wanneer de druk wordt veranderd in de beoogde fixatiedruk (20 cm water), lopen de longen iets leeg. Ook afgebeeld is plaatsing van een 25G x 5/8 naald in de rechter ventrikel voor vasculaire perfusie-fixatie van de long. Alle beelden zijn foto's met een resolutie van 15,9 megapixel en een beeldverhouding van 4:3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Extractie van de longen na voltooiing van de luchtinflatie met vasculaire perfusiefixatie. Een. De luchtpijp wordt distale gebonden aan de Luer stub adapter en longen worden geëxtraheerd door het bindweefsel achterste naar het mediastinum te snijden. B. Luchtopgeblazen longen na succesvolle procedurele voltooiing. C. Voorbeeld van slecht opgeblazen longen die het gevolg waren van een luchtlek dat optrad in de luchtinflatiekamer. Merk op dat deze longen kleiner zijn dan de succesvol opgeblazen longen. Alle beelden zijn foto's met een resolutie van 15,9 megapixel en een beeldverhouding van 4:3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van longweefsel verkregen door intratracheale fixatie versus luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie. Een. Longen geconserveerd door intratracheale fixatie. B. Longen geconserveerd door luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie. B (inzet). Pijlen tonen leukocyten in de luchtwegen van een long gefixeerd door vasculaire perfusie-fixatie; sterren markeren leukocyten in de longblaasjes. Ter vergelijking: leukocyten zijn met name afwezig in de luchtwegen van longen die via de intratracheale route(A-inzet)zijn gefixeerd en intra-alveolaire leukocyten worden verplaatst en lijken in nauw contact te staan met epitheelcellen. Afkortingen: A- luchtweg, V- schip. Vergroting van afbeeldingen is 40x met respectievelijk 100x en 200x voor A- en B-inzetstukken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel vaak gebruikt, verdringen intratracheale fixatiemethoden leukocyten uit de luchtwegen en kunnen ze de normale longarchitectuur veranderen. De methode van luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie die in dit protocol wordt gegeven, overwint deze valkuilen en behoudt nauwkeuriger de longanatomie. De sleutels tot het verkrijgen van hoogwaardig weefsel uit de vasculaire perfusie-fixatiemethode omvatten zorgvuldige monitoring van luchtinflatiedrukken, het vermijden van luchtlekken en het zorgen voor een adequate perfusie van fixatief in de vasculatuur.
Een beperking van deze procedure is dat wanneer de integriteit van de thorax wordt onderbroken, de longen instorten en opnieuw opblazen van de longen na instorting noodzakelijk is voor een nauwkeurige histologische beoordeling. Een alternatief voor het protocol dat de longinflatie zou handhaven zonder instorting zou het gebruik van een beademingsapparaat voor kleine dieren zijn. Dergelijke apparatuur is echter vaak duur en het protocol biedt hier een goedkope oplossing. In gezonde longen helpt oppervlakteactieve stof geproduceerd door alveolaire epitheelcellen om de oppervlaktespanning te verminderen en in de meeste gevallen kunnen longen gemakkelijk opnieuw worden uitgebreid. In zieke longen kunnen weefsels echter stijver zijn en kan de functie van de longsurfactant worden gewijzigd, waardoor de klap van de longen wordt bevorderd. Om dit effect te verzachten, kunnen ingestorte gebieden worden "gerekruteerd" met behulp van iets hogere luchtinflatiedrukken (d.w.z. 25 cmH2O)5. De druk kan dan worden verlaagd om een lichte deflatie van de longen tot fysiologische grootte mogelijk te maken. In onze handen werkt een bandenspanning van 20 cm water goed. Hogere drukken dan dit kunnen de longblaasjes overs opgezwollen en de vasculaire perfusie aantasten. Omgekeerd leidt lage druk tot instorting van het luchtruim. Langs vergelijkbare lijnen moeten vasculaire perfusiedrukken ook worden getitreerd. Overmatige perfusiedruk kan haarvaten in de alveolaire ruimte opzwepen of zelfs de haarvaten beschadigen en longoedeem veroorzaken4. Aan de andere kant, als de vasculaire perfusiedruk te laag is, kan de perfusie ontoereikend zijn. We hebben ontdekt dat stroomsnelheden van 10 ml /min voor de heparine-oplossing en 6,5 ml / min voor de fixatieve oplossing een optimaal resultaat bereiken.
Het controleren van de luchtinflatiekamer op lekken is noodzakelijk om een constante bandenspanning te garanderen tijdens vasculaire perfusiefixatie. Zodra water aan de spuit is toegevoegd, moet het in de bodem van de luchtinflatiekamer stromen totdat de druk gelijk wordt. Mogelijk moet een kleine hoeveelheid extra water aan de spuit worden toegevoegd om een kolomhoogte van 25 cm voor inflatie en 20 cm voor fixatie te behouden. Siliconenkit moet mogelijk worden vervangen als de stroom in de luchtinflatiekamer niet stopt.
Een andere oorzaak van luchtlekkage is schade aan de longen. Dit gebeurt meestal tijdens het openen van de thoracale holte of tijdens het trekken van de longen uit de thorax. Er moet dus veel worden geoefend en er moet veel zorg worden besteed aan het voorkomen van beschadiging van de long tijdens de voorbereiding van de muis. Een minder vaak voorkomende oorzaak is longpathologie die het gevolg is van ernstige longziekte. Aanwijzingen voor luchtlekken uit de longen zijn onder meer langzaam legen van de vloeistofkolom in de spuit, een sistgeluid of bellen die van het longoppervlak komen. Het aanbrengen van een kleine hoeveelheid fixeermiddel op de longen op de plaats van het lek kan helpen kleine lekken af te dichten; bepaalde fixatieven kunnen echter leiden tot hechting van de longen aan de thoracale holte en wanneer de longschade uitgebreid is, kunnen de longen nog steeds instorten zodra de luchtdruk is verwijderd.
Zodra eventuele bronnen van luchtlekkage zijn beoordeeld en beheerd, moeten de longen opblazen en opgeblazen blijven tijdens de fixatie. De luchtpijp moet onder de canule worden geligeerd voordat deze uit het opblaasapparaat wordt verwijderd om instorting te voorkomen. Longen kunnen dan worden verwerkt voor histologische studies. Luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie van longen heeft tot doel aantallen, morfologie en locatie van luchtwegcellen te behouden en tegelijkertijd de wereldwijde longarchitectuur adequaat te behouden voor histologische structuur-functiestudies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) subsidies HL140039 en HL130938. De auteurs willen Shannon Hott en Jazalle McClendon bedanken voor hun technische expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S.
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I.
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A.
