Summary
Представлен метод воздушной инфляции с сосудистой перфузией-фиксацией легких, сохраняющих расположение клеток в дыхательных путях, альвеолах и интерстиции для структурно-функционального анализа. Постоянное давление в дыхательных путях поддерживается с помощью воздушно-инфляционной камеры, в то время как фиксатор перфузируется через правый желудочек. Легкие обрабатываются для гистологических исследований.
Abstract
Гистология легких часто используется для исследования вклада, обеспечиваемого клетками воздушного пространства во время гомеостаза легких и патогенеза заболеваний. Однако широко используемые методы фиксации на основе инстилляции могут вытеснять клетки воздушного пространства и слизь в конечные дыхательные пути и могут изменять морфологию тканей. Для сравнения, методы фиксации сосудов превосходят в сохранении местоположения и морфологии клеток в воздушном пространстве и слизистой оболочки. Однако, если одновременно не применяется положительное давление в дыхательных путях, области легких могут коллапсировать, а капилляры могут выпячиваться в альвеолярные пространства, что приводит к искажению анатомии легких. Здесь мы описываем недорогой метод воздушной инфляции во время сосудистой перфузии-фиксации для сохранения морфологии и расположения дыхательных путей и альвеолярных клеток и интерстиций в легких мышей для последующих гистологических исследований. Постоянное давление воздуха подается в легкие через трахею из герметичной, заполненной воздухом камеры, которая поддерживает давление через регулируемую колонку жидкости, в то время как фиксатор перфузируется через правый желудочек.
Introduction
Гистология легких представляет собой золотой стандарт для оценки архитектуры легких во время здоровья и болезни и является одним из наиболее часто используемых инструментов исследователямилегких1. Одним из наиболее критических аспектов данной методики является правильная изоляция и сохранение легочной ткани, так как вариабельность на этом этапе может привести к ухудшению качества тканей и ошибочным результатам1,2,3. У живых животных объем легких определяется балансом между внутренней упругой отдачей легкого и внешними силами, передаваемыми от грудной стенки и диафрагмы поверхностным натяжением. Соответственно, при входе в грудную клетку теряются внешние силы и легкое разрушается. Гистологические срезы, подготовленные из коллапсированных легких, имеют переполненный вид, и границы между анатомическими компартментами (т. Е. Воздушные пространства, сосуды и интерстиции) может быть трудно различить. Чтобы обойти эту проблему, исследователи часто раздувают легкие во время химической фиксации, чтобы сохранить размер и архитектуру воздушного пространства.
Легкие могут быть раздуты воздухом или жидкостью. Давление, необходимое для надувания легких до одного и того же объема, различается между надуванием воздуха и жидкости из-за межмолекулярных сил на границе раздела воздух-жидкость. Для преодоления поверхностного натяжения и вскрытия разрушенных альвеол 4 требуется более высокое давление (например, 25 смН2О), чем давление жидкости (например,12смН2О). После того, как альвеолы были набраны, более низкое давление может держать альвеолы открытыми до того же объема, что и плато кривой давления-объема, и давления выравниваются по всему легкому в соответствии с законом Паскаля4,5,6,7,8.
Существуют два основных метода инфляции и фиксации легких для сохранения мышиных легких для гистологии. Чаще всего воздушные пространства закапываются жидкостью , часто содержащей фиксатор. Основным преимуществом такого подхода является то, что он относительно прост и требует небольшой подготовки. В то время как интратрахеальная инстилляция фиксатора может быть предпочтительной в исследованиях, которые сосредоточены на сосудистой сети, жидкость, которая закапывается через трахею, имеет тенденцию выталкивать проксимальные клетки дыхательных путей и муцины в более дистальные области воздушногопространства,в то время как инфляция воздуха не составляет1,3,4,9,10,11. Более того, непреднамеренное отслоение лейкоцитов от эпителия во время жидкой инфляции изменяет их морфологию, артефактно придавая им простой, округлый вид4,10,11,12. Наконец, надув легких жидкостью может непреднамеренно сжимать интерстиций4,10,11. Вместе эти факторы могут искажать нормальную анатомию и клеточное распределение в сохранившихся легких, тем самым ограничивая технику.
Альтернативным методом сохранения тканей является сосудистая перфузия-фиксация. При этом методе фиксатор перфузируется в легочную сосудистую систему через полую вену или правый желудочек. Этот метод сохраняет расположение и морфологию клеток в просвете воздушного пространства. Однако, если легкие не раздуваются во время фиксации перфузии, легочная ткань, вероятно, разрушится.
Воздушная инфляция с сосудистой перфузион-фиксацией использует сильные стороны каждого из вышеперечисленных методов фиксации. Здесь мы предоставляем протокол для этой техники. Материалы и оборудование, которые требуются, относительно недороги и могут быть легко получены и собраны. Завершенная установка, показанная на рисунке 1А,обеспечивает постоянное давление в дыхательных путях легких с помощью регулируемой, заполненной жидкостью колонки, в то время как перистальтический насос обеспечивает фиксацию через правый желудочек. Легкие с сохраненной морфологией затем могут быть дополнительно обработаны для структурно-функционального анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Национального еврейского здравоохранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол состоит из трех компонентов. Первый компонент детализирует конструкцию воздушного накачки с перфузионным/фиксаторным оборудованием. Во втором разделе описывается, как настроить оборудование для эксперимента. В заключительном разделе описано, как подготовить животное и провести эксперимент.
1. Конструкция водотолщавого аппарата(рисунок 1В)
- Снимите плунжер со скользящего наконечника шприца на 60 мл.
- Прикрепите ленту вокруг шприца на отметке 30 мл. Установите высоту шприца на эту отметку для начального давления инфляции 25 смН2О. Здесь также должен быть уровень воды в колонке на протяжении всей процедуры. Пометьте ленту либо как «25 см» (как показано на рисунке 1A),либо как «инфляция».
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфляционное давление в 25 смН2О используется для обеспечения набора разрушенных воздушных пространств. После набора альвеол давление снижается до 20 смН2О, чтобы гарантировать, что воздушное пространство не будет растянуто. - Отмерьте 5 см от ленты к концу плунжера и прикрепите к шприцу еще один кусок ленты. Переместите шприц вниз к этой отметке, чтобы снизить давление инфляции до 20 смН2О во время фиксации. Обозначьте ленту либо как «20 см» (как показано на рисунке 1А),либо как «фиксация».
- Прикрепите трубку 180 поливинилхлорида (ПВХ) к концу шприца. Длина трубки зависит от расстояния между шприцем и воздушной инфляционной камерой (примерно 25-30 см).
- Поместите мужской тройник в стиле нити Luer (2) (длина 1,219 дюйма, высота 0,904 дюйма, внутренний диаметр 0,0904 дюйма) на другой конец трубки. Этот самец Luer будет подключаться к запорному крану воздушно-инфляционной камеры (шаг 2.4).
2. Конструкция воздушно-инфляционной камеры(рисунок 1С)
- Просверлите два отверстия (диаметром около 4 мм) в пластиковом контейнере объемом 500 мл с навинчиваемым колпачком. Отверстия должны быть того же размера, что и женские Luers (длина 1,224 дюйма, высота 0,312 дюйма, внутренний диаметр 0,098 дюйма).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые среды или буферные контейнеры могут быть использованы для воздушно-инфляционной камеры. - Покрывать резьбу женских Луеров силиконовой прокладкой и помещать меньшую сторону в предварительно просверленные отверстия контейнера.
- Добавьте силиконовую прокладку вокруг женских Luers, где они входят в контейнер, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.
- Винт на одностороннем запорном кране на нижней женской луере на воздушно-инфляционной камере.
- Нарежьте трубку на длину примерно 25 см и прикрепите самцы Luers к свободным концам трубки. Подключите мужской Luer на одном конце трубки к свободному женскому Luer на воздушно-инфляционной камере. Другой самец Luer подключится к контейнеру для обработки животных.
3. Конструкция контейнера для переработки животных(рисунок 1D)
- Просверлите отверстие (диаметром около 4 мм) в боковой части большого пластикового контейнера. Отверстие должно быть диаметром самки Луэр. Пластиковый контейнер нужен для улавливания избыточного фиксирования раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использовался пластиковый контейнер для хранения размером 30 см х 22 см, 3,8 л. - Обложите резьбу женского Luer силиконовой прокладкой и поместите меньшую сторону в предварительно пробуреное отверстие контейнера.
- Добавьте силиконовую прокладку вокруг женского Luer, где он входит и выходит из контейнера, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.
- Прикрутите односторонний запорный кран к самке Luer. Трубка из воздушно-инфляционной камеры будет прикреплена к этому запорному крану.
4. Приготовление растворов
- Раствор гепарина
- Наполните контейнер безкальцийным PBS и гепарином (20 Ед/мл). Приготовьте в общей сложности 10 мл раствора гепарина для каждой мыши. Гепарин является антикоагулянтом, который предотвращает образование тромбов в сосудах во время перфузии-фиксации. Раствор гепарина будет использоваться для промывания крови из легких перед перфузией-фиксацией.
- Фиксаторное решение
ВНИМАНИЕ: Фиксаторы могут представлять опасность для здоровья и должны использоваться в химическом вытяжном вытяжке. Все аппараты установлены в химическом вытяжном капюшоне для предотвращения вдыхания фиксаторов.- Наполните контейнер безкальцийным PBS и параформальдегидом (конечная концентрация 4%). Приготовьте в общей сложности 50 мл фиксаторного раствора для каждой мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тип используемого фиксатора может варьироваться и будет зависеть от последующих гистологических исследований.
- Наполните контейнер безкальцийным PBS и параформальдегидом (конечная концентрация 4%). Приготовьте в общей сложности 50 мл фиксаторного раствора для каждой мыши.
5. Подготовка перфузионного аппарата
ПРИМЕЧАНИЕ: Перистальтический насос предлагается для доставки жидкостей в сосудистую азкулятуру для обеспечения постоянного расхода. Следующие направления предназначены для настройки перистальтического насоса и могут отличаться для каждой модели. Альтернативно, если перистальтический насос недоступен, может быть сконструирован второй аппарат с водяным столбом для перфузла жидкостей с высоты 35 см H2O.
- Сначала поместите трубку вокруг роликового узла.
- Закрепите трубку в насечке.
- Зафиксирует рычаги на месте, сначала поместив левый рычаг вокруг трубки и закрепив его на месте верхним, а затем правым рычагом.
- Поместите проксимальный конец трубки в раствор гепарина, а дистальный конец в контейнер для обработки животных.
- Предварительно загрузите раствор гепарина в трубку, запустив насос для выталкивания воздуха из трубки.
- Закрепите иглу 25G x 5/8" на конце левой стороны трубки.
6. Подготовка воздухо-инфляционного аппарата
- Поместите шприц для толщи воды в держатель кольца.
- Измерьте вертикальную высоту 25 см от платформы животного до отметки ленты «25 см» (шаг 1.2) на толще воды.
- Прикрепите конец трубки водяного столба к запорному крану на воздушной камере.
- Прикрепите трубку от самки Luer воздушной камеры к запорному крану на контейнере для обработки животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если воздушно-инфляционная камера сконструирована так, как показано на рисунке 1С,присоединение трубки в обратном порядке может привести к утечке воды в трубку, которая соединяется с трахеальной канюлой. - Убедитесь, что крышка воздушной камеры плотно закрыта.
- Убедитесь, что запорный кран на внешней стороне контейнера для переработки животных закрыт, а запорный кран на трубке, ведущий от толщи воды к воздушно-инфляционной камере, открыт.
- Наполните шприц водой до отметки «25 см». Вода выйдет из шприца через трубку в воздушную камеру. Как только давление будет выровняно, вода перестанет течь.
- Возможно, что вода будет медленно просачиваться в воздушно-инфляционную камеру, поскольку давление окружающего воздуха в химическом вытяжке колеблется. Следите за уровнем воды в шприце и при необходимости добавляйте его. Поддерживайте уровень воды на отметке «25 см» на протяжении всей процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно уровни воды остаются неизменными в течение первой части инфляции воздуха при 25 смH2O; однако во время фиксации в шприц, вероятно, потребуется добавить больше воды. Если вода не перестает течь, вполне вероятно, что в воздушно-инфляционной камере существует утечка воздуха. Возможно, потребуется применить больше силиконового прокладки вокруг Luers, чтобы предотвратить утечки воздуха.
- Возможно, что вода будет медленно просачиваться в воздушно-инфляционную камеру, поскольку давление окружающего воздуха в химическом вытяжке колеблется. Следите за уровнем воды в шприце и при необходимости добавляйте его. Поддерживайте уровень воды на отметке «25 см» на протяжении всей процедуры.
7. Подготовка животных (Рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была изменена из Gage et al13. Мы завершили эту процедуру на взрослых самцах и самке мышей разного возраста и не отмечаем возрастных или половых предубеждений.
- Усыпить животное пентобарбиталом натрия (150 мг/кг, внутрибрюшинно). Убедитесь, что животное мертво до начала вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя эта процедура выполняется на усыпленных животных, эта процедура может быть выполнена на живых животных, чтобы использовать сердце для перекачки перфузатов по всему животному. - Сделайте два боковых разреза через брюшную стенку. Сделайте первый разрез ниже грудной клетки, а второй над бедрами. Разрезать вдоль средней линии от нижнего разреза к верхнему разрезу.
- Используя тупые ножницы, аккуратно сделайте разрез в боковую сторону диафрагмы. Легкие должны разрушиться, как только диафрагма будет проколота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать прокола легких. Проколотое легкое с меньшей вероятностью будет раздуваться во время более поздних шагов. - Разрезать поперечно вдоль диафрагмы, чтобы открыть грудную полость.
- Разрезать вдоль грудины от мечевидного отвара до яремной выемки и сбоку над грудной клеткой, чтобы полностью обнажить сердце и легкие. Зафиксируй по бокам грудной клетки.
- Сделайте разрез средней линии в области шеи над трахеей. Удалите кожу, мышцы, щитовидную железу и соединительную ткань, окружающую трахею.
- Используя изогнутые щипцы, сдвиньте два куска нити или шва под заднюю трахею. Используйте один кусок шва, чтобы удерживать адаптер Накачки Luer-stub на месте, а другой в конечном итоге для связывания трахеи в конце воздушной инфляции и сосудистой перфузии-фиксации.
- Проделайте небольшое отверстие в трахее с помощью иглы 18G x 1" или пружинных ножниц Vannas.
- Поместите адаптер 20G Luer-stub в это отверстие в трахее.
- Завяжите одну нить вокруг трахеи непосредственно от того места, куда входит адаптер Luer-stub, чтобы удерживать ее на месте.
- Перенесите животное в контейнер для обработки животных.
- Прикрепите адаптер Luer-stub к самке Luer на внутренней стороне контейнера для обработки животных.
8. Надувание воздуха, перфузия и фиксация легких(рисунок 2)
- Поместите иглу 25G x 5/8", прикрепленную к трубке перфузионного аппарата, в правый желудочек сердца.
- Отрежьте брюшную аорту, чтобы позволить крови стекать из сердца и способствовать потоку перфусата через легкие.
- Откройте запорный кран на внешней стороне контейнера для обработки животных, чтобы надуть легкие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться время, чтобы легкие полностью раздули. Следите за уровнем воды в шприце, он не должен быстро снижаться, если нет утечки в легких. - Надувают легкие при 25 смН2О в течение 5 минут. Инфляция при 25 смН2О предопределяет легкое и помогает в наборе ателектатических областей легких.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется добавить небольшое количество воды в шприц для поддержания высоты 25 см. Воспаление и / или экспериментально индуцированное повреждение легких могут влиять на инфляцию легких. В этом случае может потребоваться повышение инфляционного давления максимум до 35 смН2О, чтобы оказать помощь в наборе ателектических областей. - В последнюю минуту надувания легких включите перистальтический насос со скоростью потока 10 мл/мин. Раствор гепарина должен течь из флакона через трубку в животное.
- Целью инфузии гепарина является предотвращение образования тромбов в сосудах. Соответственно, вливают гепарин до тех пор, пока легкие не станут белыми и не будут лишены крови. Если легкие не белеют, может потребоваться коррекция иглы правого желудочка.
- После надувания в течение 5 минут выключите перистальтический насос и переключите перфузионную трубку с раствора гепарина на фиксатор.
- Опустите шприц водяного столба до отметки «20 см» (шаг 1.3). Это нормально, когда пузырьки воздуха перемещаются в толщу воды, поскольку давление изменяется от 25 до 20 смH2O.
- Проверьте уровень воды в шприце. Он должен быть на отметке «25 см». Возможно, потребуется добавить больше в это время.
- Подождите 1 мин, чтобы дать легким сдуться от 25 до 20 смН2О.
- Перезапустите перфузионный насос со скоростью потока 6,5 мл/мин.
- Сосудистую перфузию - фиксируют в течение 10 - 15 минут.
9. Экстракция легких(рисунок 3)
- Плотно привяжите второй кусок нити вокруг трахеи дистальнее адаптера Luer-stub. Извлеките адаптер Luer-stub из трахеи.
- Извлеките иглу из сердца.
- Освободите легкие и сердце от грудной полости, разрезав соединительную ткань с задней стороны к средостечению тупыми ножницами. Позаботьтесь о том, чтобы избежать прокола легких.
- Осторожно выньте сердце из легких.
- Поместите легкие в фиксатор на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность фиксатора варьируется в зависимости от последующих гистологических исследований.- Поместите легкие в коническую трубку 50 мл, содержащую 20-25 мл фиксатора. Поместите нить, закрепляющую трахею, через отверстие конической трубки и закрепите нитью колпачка. Переверните коническую трубку, чтобы убедиться, что плавучие, надутые воздухом легкие остаются полностью погруженными в фиксатор, иначе они будут плавать к вершине жидкости.
- Обработка легких для гистологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В неповрежденной грудной клетке легкие удерживаются открытыми внешними силами, приложенными стенкой грудной клетки через плевральное пространство6,14. При введении диафрагмы во время рассечения целостность плеврального пространства упраздняется и легкие должны разрушиться(рисунок 2А,2В). Для повторного расширения легких проводится надув воздуха. В качестве первого шага применяется 25 см давления воды для обеспечения набора разрушенных воздушных пространств. Соответственно, когда запорный кран снаружи контейнера для содержания животных открыт, воздух будет поступать в легкие через трахею, и инфляция должна легко наблюдаться(рисунок 2C). Как только легкие полностью расширяются, давление надувания уменьшается до 20 см давления воды(рисунок 2D). Давление воды в 20 см выбрано потому, что оно поддерживает полное накачивания легких, но не чрезмерно растянут воздушное пространство.
Легкие должны оставаться раздутыми после лигирования трахеи(рисунок 3А)и после удаления из грудной клетки(рисунок 3В). Дефляция легких(рисунок 3C)может возникнуть, если легкие проколоты во время подготовки или извлечения животных. Добавление фиксатора на плевральную поверхность может помочь запечатать незначительные утечки во время процедуры; однако фиксатор следует применять осторожно, так как избыток может прилипать легких к грудной полости. Любые утечки, которые не запечатываются во время фиксации, приведут к коллапсу легких при удалении из аппаратов надувания воздуха. Дефляция легких может также возникнуть, если трахея не полностью связана. При погружении в фиксатор правильно надутые легкие будут иметь большую плавучесть, чем сдутые легкие.
Раздутые легкие затем могут быть обработаны для гистологических анализов в соответствии с установленными протоколами1,15. На рисунке 4легкие обрабатывали для замороженного сечения и окрашивали с помощью коммерческой системы ручного окрашивания. Очень немногие иммунные клетки присутствуют в просвете дыхательных путей тканей, зафиксированных с помощью традиционной инфляции нажидкой основе (рисунок 4A). Напротив, воспалительные клетки сохраняются во всем воздушном пространстве в тканях, фиксированных посредством сосудистой перфузии с воздушной инфляцией(рисунок 4B).
Рисунок 1:Сборка аппаратов. А. Полная сборка всех аппаратов. В. Водяной столб состоит из шприца объемом 60 мл, соединенного с воздушно-инфляционной камерой через трубку 180 ПВХ и двухстороннее мужское luer. С. Для строительства воздушно-инфляционной камеры использовался герметичный пластиковый контейнер объемом 500 мл. Самец луэра водной толщи соединяется с запорным краном, соединенным с самкой Луэр в стенах камеры. Дополнительная самка Luer соединяет трубку из воздушно-инфляционной камеры с контейнером для обработки животных. Оба женских Luers покрыты силиконовой прокладкой для обеспечения герметистики. Два самца Luers соединены с обоими концами трубки, которая соединяет воздушно-инфляционную камеру с контейнером для обработки животных. Д. Животные прикрепляются к воздушно-инфляционной камере через адаптер заглушки 20G Luer, помещенный через отверстие в трахею. Адаптер заглушки Luer подключается к самке Luer в стенках контейнера для обработки животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Подготовка животных, подключение к воздушно-инфляционной камере и надув легких. А. После эвтаназии обнажаются брюшинная и грудная полости животного. Грудная клетка удаляется или зажимается, чтобы обеспечить расширение легких при надуве. Адаптер заглушки Luer вставляется в небольшое отверстие, вырезанное в трахее и закрепленное резьбой или швом. Адаптер заглушки Luer соединен с самкой Luer в стенке камеры обработки животных. Другой конец женского Luer прикреплен к запорному крану для управления потоком воздуха из воздушно-инфляционной камеры (не показан). В. Коллапс легких перед надуваемо овением воздуха. С. Легкие раздуваются до 25 см давлением воды для набора ателектазических областей. Д. При изменении давления до предполагаемого фиксационного давления (20 см воды) легкие слегка сдуваются. Также изображено помещение иглы 25G x 5/8 в правый желудочек для сосудистой перфузии-фиксации легкого. Все изображения являются фотографиями с разрешением 15,9 мегапикселей и соотношением сторон 4:3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Экстракция легких после завершения надувания воздуха с фиксацией перфузии сосудов. А. Трахея отвязывается дистально к адаптеру заглушки Luer, а легкие извлекаются путем разрезания соединительной ткани с задней стороны средостня. В. Надувные воздухом легкие после успешного процедурного завершения. С. Пример плохо раздутых легких, которые возникли в результате утечки воздуха, которая произошла в воздушно-инфляционной камере. Обратите внимание, что эти легкие меньше, чем успешно раздутые легкие. Все изображения являются фотографиями с разрешением 15,9 мегапикселей и соотношением сторон 4:3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Сравнение легочной ткани, полученной путем внутритрахеальной фиксации, с воздушной инфляцией с сосудистой перфузионно-фиксацией. А. Легкие сохраняются путем внутритрахеальной фиксации. В. Легкие сохраняются воздушно-накачкой с сосудистой перфузией-фиксацией. B (вставка). Стрелки показывают лейкоциты в дыхательных путях легкого, зафиксированные перфузией-фиксацией сосудов; звезды выделяют лейкоциты в альвеолах. Для сравнения, лейкоциты заметно отсутствуют в дыхательных путях легких, фиксируемых интратрахеальным путем(вставка А),а внутриальвеолярные лейкоциты вытесняются, по-видимому, в тесном контакте с эпителиальными клетками. Сокращения: A- дыхательные пути, V- судно. Увеличение изображений 40x с 100x и 200x для врезок A и B соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя обычно используются, методы фиксации на основе интратрахеи вытесняют лейкоциты из дыхательных путей и могут изменить нормальную архитектуру легких. Метод воздушной инфляции с сосудистой перфузией-фиксацией, который предусмотрен в данном протоколе, преодолевает эти подводные камни и более точно сохраняет анатомию легких. Ключи к получению высококачественной ткани из метода перфузионно-фиксации сосудов включают тщательный мониторинг давления надувания воздуха, предотвращение утечек воздуха и обеспечение адекватной перфузии фиксатора в сосудистую систему.
Одним из ограничений этой процедуры является то, что когда целостность грудной клетки прерывается, легкие разрушаются и повторная инфляция легких после коллапса необходима для точной гистологической оценки. Альтернативой протоколу, который будет поддерживать инфляцию легких без коллапса, будет использование вентилятора для небольших животных. Однако такое оборудование часто стоит дорого, и протокол здесь предлагает недорогое решение. В здоровых легких сурфактант, вырабатываемый альвеолярными эпителиальными клетками, помогает снизить поверхностное натяжение, и в большинстве случаев легкие могут быть легко повторно расширены. Однако в больных легких ткани могут быть более жесткими, а функция сурфактанта легких может быть изменена, способствуя коллапсу легких. Чтобы смягчить этот эффект, разрушенные участки могут быть «набраны» с использованием несколько более высокого давления надувания воздуха (т. Е. 25 смH2O)5. Затем давление может быть уменьшено, чтобы позволить небольшую дефляцию легких до физиологического размера. В наших руках хорошо работает давление надувки воды 20 см. Давление выше этого может чрезмерно растянуть альвеолы и ухудшить перфузию сосудов. И наоборот, низкое давление приводит к коллапсу воздушного пространства. Аналогичным образом, давление перфузии сосудов также должно быть титровано. Чрезмерное перфузионное давление может растянуть капилляры в альвеолярном пространстве или даже повредить капилляры и вызвать отек легких4. С другой стороны, если давление перфузии сосудов слишком низкое, перфузия может быть недостаточной. Мы обнаружили, что скорость потока 10 мл/мин для раствора гепарина и 6,5 мл/мин для фиксаторного раствора позволяет достичь оптимального результата.
Проверка воздушной инфляционной камеры на наличие утечек необходима для обеспечения постоянного давления инфляции во время перфузионно-фиксации сосудов. Как только вода добавляется в шприц, она должна течь в нижнюю часть воздушной инфляционной камеры до тех пор, пока давление не выровняется. Небольшое количество дополнительной воды может потребоваться добавить в шприц, чтобы поддерживать высоту колонны 25 см для надувания и 20 см для фиксации. Силиконовый герметик, возможно, потребуется заменить, если поток в воздушную инфляционную камеру не прекращается.
Еще одной причиной утечки воздуха является повреждение легких. Чаще всего это происходит во время вскрытия грудной полости или при извлечении легких из грудной клетки. Таким образом, необходимо соблюдать практику и большую осторожность, чтобы избежать повреждения легких во время подготовки мыши. Менее распространенной причиной является патология легких, которая возникает в результате тяжелого заболевания легких. Подсказки к утечкам воздуха из легких включают медленное опорожнение из столба жидкости в шприце, шипящий звук или пузырьки, исходящие от поверхности легких. Нанесение небольшого количества фиксатора на легкие в месте утечки может помочь запечатать небольшие утечки; однако определенные фиксаторы могут вызвать прилипательность легких к грудной полости, и когда повреждение легких обширно, легкие все еще могут коллапсировать после снятия давления воздуха.
После того, как любые источники утечки воздуха были оценены и устранены, легкие должны раздуваться и оставаться надутыми во время фиксации. Трахею следует лигировать ниже канюли перед удалением из инфляционного аппарата, чтобы предотвратить коллапс. Легкие затем могут быть обработаны для гистологических исследований. Воздушная инфляция с сосудистой перфузией-фиксацией легких направлена на сохранение количества, морфологии и расположения клеток дыхательных путей при адекватном сохранении глобальной архитектуры легких для гистологических структурно-функциональных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантами Национального института сердца, легких и крови (NHLBI) HL140039 и HL130938. Авторы хотели бы поблагодарить Шеннон Хотт и Джазалле МакКлендон за их технический опыт.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
