Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

طريقة للحفاظ على جذور الأراضي الرطبة ورهيزوسفير للتصوير عنصري

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62227
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Plant and Soil Sciences, University of Delaware, 2National Synchrotron Radiation Lightsource-II, Brookhaven National Laboratory

Summary

نحن نصف بروتوكولا لعينة والحفاظ عليها وقسم الجذور سليمة والتربة رهيزوسفير المحيطة بها من بيئات الأراضي الرطبة باستخدام الأرز(Oryza sativa L.) كنوع نموذجي. وبمجرد الحفاظ عليها، يمكن تحليل العينة باستخدام تقنيات التصوير الأولي، مثل التصوير الطيفي الكيميائي synchrotron بالأشعة السينية (XRF).

Abstract

تتفاعل الجذور على نطاق واسع مع بيئة التربة الخاصة بها ولكن تصور مثل هذه التفاعلات بين الجذور ورهيزوسفير المحيطة بها أمر صعب. كيمياء رهيزوسفير من نباتات الأراضي الرطبة صعبة بشكل خاص لالتقاط بسبب تدرجات الأكسجين حاد من الجذور إلى التربة السائبة. هنا يوصف بروتوكول يحافظ بشكل فعال على بنية الجذر وكيمياء رهيزوسفير لنباتات الأراضي الرطبة من خلال تجميد البطولات الاربع وتجميد التجفيف. البطولات الاربع تجميد، حيث يتم تجميد العينة بين كتل النحاس تبريدها مسبقا مع النيتروجين السائل، ويقلل من تلف الجذر وتشويه العينة التي يمكن أن تحدث مع فلاش تجميد مع الاستمرار في تقليل التغيرات الطيف الكيميائي. في حين أن تشويه العينة لا يزال ممكنا ، والقدرة على الحصول على عينات متعددة بسرعة وبأقل تكلفة يزيد من إمكانية الحصول على عينات مرضية ويحسن وقت التصوير. وتبين البيانات أن هذه الطريقة ناجحة في الحفاظ على أنواع الزرنيخ المنخفضة في جذور الأرز ورهيزوسفيرات المرتبطة لويحات الحديد. ويمكن اعتماد هذه الطريقة لدراسات العلاقات بين النباتات والتربة في طائفة واسعة من بيئات الأراضي الرطبة التي تمتد على نطاقات تركيز من ركوب الدراجات عنصر التتبع لتطبيقات المعالجة النباتية.

Introduction

الجذور وجذورها هي دينامية، غير متجانسة، وأهمية حاسمة لفهم كيفية حصول النباتات على المواد الغذائية المعدنية والملوثات1،2،3. الجذور هي المسار الرئيسي الذي تنتقل به العناصر الغذائية (مثل الفوسفور) والملوثات (مثل الزرنيخ) من التربة إلى النباتات وبالتالي فهم هذه العملية له آثار على كمية الغذاء ونوعيته، وعمل النظام الإيكولوجي، والمعالجة النباتية. ومع ذلك، الجذور ديناميكية في المكان والزمان تنمو استجابة لاحتياجات اكتساب المغذيات وغالبا ما تختلف في وظيفة وقطرها وهيكل (على سبيل المثال، جذور الجانبية، جذور المغامرة، الشعر الجذر)2. ويمكن دراسة عدم تجانس نظم الجذر على المقاييس المكانية من الخلايا إلى مستوى النظام الإيكولوجي وعلى نطاقات زمنية من الساعة إلى العشارية. وهكذا، فإن الطبيعة الديناميكية وغير المتجانسة للجذور والتربة المحيطة بها، أو رهيزوسفير، تشكل تحديات لالتقاط كيمياء الرهيزوسفير مع مرور الوقت. وعلى الرغم من هذا التحدي، من الضروري دراسة الجذور في بيئة التربة الخاصة بهم لتوصيف هذه العلاقة الحرجة بين النباتات والتربة.

إن كيمياء الرهيزوسفير لنباتات الأراضي الرطبة تشكل تحديا خاصا للتحقيق بسبب تدرجات الأكسجين الحادة الموجودة من التربة السائبة إلى الجذور، والتي تتغير في المكان والزمان. لأن الجذور تحتاج إلى الأكسجين للتنفس، وقد تكيفت النباتات الأراضي الرطبة لظروف انخفاض الأكسجين من التربة الرطبة عن طريق خلق aerenchyma4،5. Aerenchyma هي الأنسجة القشرية المجوفة التي تمتد من يطلق النار على الجذور، مما يسمح بنشر الهواء من خلال النبات في الجذور. ومع ذلك، فإن بعض من هذا الهواء يتسرب إلى رهيزوسفير في أجزاء أقل فرعية من الجذور لا سيما بالقرب من تقاطعات الجذر الجانبي، نصائح الجذر أقل نضجا ومناطق الاستطالة6،7،8،9. هذا فقدان الأكسجين الشعاعي يخلق منطقة مؤتأكسدة في رهيزوسفير من نباتات الأراضي الرطبة التي تؤثر على الكيمياء رهيزوسفير (بيو جيو) ويختلف عن انخفاض التربة السائبة10،11،12. لفهم مصير ونقل المواد الغذائية والملوثات في رهيزوسفير الأراضي الرطبة والجذور، من الأهمية بمكان الحفاظ على التربة السائبة المنخفضة كيميائيا، ورهيزوسفير المؤأكسدة، وجذور نباتات الأراضي الرطبة لتحليلها. ومع ذلك، لأن التربة السائبة تحتوي على مكونات التربة المنخفضة التي هي حساسة للأوكسجين، يجب أن تحافظ طرق الحفاظ على الجذر والتربة على الهياكل الجذرية وتقليل ردود الفعل الحساسة للأوكسجين.

توجد طرق لإصلاح الأنسجة النباتية والحفاظ على البنية الفوقية للتصوير ، ولكن لا يمكن تطبيق هذه الأساليب للحفاظ كيميائيا على الجذور المتنامية في تربة الأراضي الرطبة. للتحقيقات حيث التوزيع عنصري فقط داخل الخلايا النباتية هو المطلوب، وعادة ما تزرع النباتات الهيدروبونية والجذور يمكن إزالتها بسهولة من الحل، ثابتة تحت ضغط عال تجميد وتجميد الاستبدال ومقسمة لمجموعة متنوعة من تطبيقات التصوير بما في ذلك عالية الدقة الطيف الكتلي الأيونات الثانوية (nanoSIMS)، المجهر الإلكتروني، وsnhrotron الأشعة السينية الفلورية (S-XRF) تحليل13، 14،15. للتحقيق في لوحة Fe على السطح الخارجي لجذور الأراضي الرطبة ، يجب أن تحفز هذه الدراسات المائية بشكل مصطنع تكوين لوحة Fe في الحل16، والتي لا تمثل بدقة عدم تجانس التوزيع والتركيب المعدني لتشكيل البلاك Fe والعناصر المرتبطة به في الموقع17و18و19و20. توجد طرق للحفاظ على التربة الرطبة والكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بها مع تجميد coring21، ولكن من الصعب الحصول على جذور مع هذه التقنية. الأساليب الحالية لتصور الجذور المتنامية في التربة وكيمياء رهيزوسفيرها تتكون من نوعين من أنواع القياس الأولية: التدفقات الأولية والتركيز الأساسي الكلي (والتكهنات). يتم قياس الأول عادة باستخدام تدرجات الانتشار في الأفلام الرقيقة (DGT)22،23،24، حيث يتم وضع التربة في صناديق رهيزوبوكس لدعم نمو النبات في إعداد المختبر وعناصر الشفرين في التربة المنتشرة من خلال هلام في طبقة ملزمة. ويمكن بعد ذلك تصوير هذه الطبقة الملزمة لتحديد العناصر الشفهية ذات الاهتمام. هذه التقنية يمكن أن توضح بنجاح العلاقات بين الجذور ورهيزوسفير24،25،26،27، ولكن قد توجد القطع الأثرية من الجذر يحدها النباتات المتنامية في rhizoboxes ، ولا يتم التقاط المعلومات عن باطن الجذر مع DGT. ويشمل هذا الأخير أخذ عينات من الجذور ورهيزوسفير، والحفاظ على العينة، وتحليل التوزيع الأولي مباشرة على قسم العينة. لهذه العينة البيئية من جذور النباتات الأراضي الرطبة ورهيزوسفير المحيطة بها، مطلوب التعامل مع عينة دقيقة لتجنب القطع الأثرية من إعداد العينة.

هنا يوصف بروتوكول يحافظ بشكل فعال على هياكل الجذر وكيمياء الرهيزوسفير لنباتات الأراضي الرطبة عن طريق تجميد البطولات الاربع وتجميد التجفيف. يمكن أن يؤدي تجميد الفلاش إلى إبطاء التحولات في المذابات الحساسة للأوكسجين بشكل كبير ولكنه قد يضر بالجذور وقد يسبب التعبئة عندما تجف العينات. ومع ذلك، البطولات الاربع تجميد حيث يتم تجميد العينة بين كتل النحاس تبريد مسبق مع النيتروجين السائل يقلل من تلف الجذر وتشويه العينة28. ثم يتم تضمين العينات المحفوظة في راتنج الايبوكسي الذي يحافظ على الطيف20،29 ويمكن قطع ومصقول لتصوير الجذور داخل التربة rhizosphere بهم. تم تحليل العينات في هذا التقرير من قبل التصوير الطيف الكيميائي S-XRF بعد تقسيم رقيقة. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام تقنيات تصوير أخرى، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالاجتثاث بالليزر (LA-ICP-MS)، وانبعاثات الأشعة السينية الناجمة عن الجسيمات (PIXE)، وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي (SIMS)، والتصوير الطيفي للانهيار الناجم عن الليزر (LIBS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد معدات تجميد البطولات الاربع

  1. ضع كتلتين نحاسيتين (~ 5 سم × 5 سم × 15 سم) أفقيا داخل مبرد نظيف قادر على حمل النيتروجين السائل وصب ما يكفي من النيتروجين السائل لغمر الكتل. بمجرد أن تهدأ الفقاعات ، ضع اثنين من الفواصل فوق كتلة نحاسية واحدة في كل نهاية.
    ملاحظة: يحدد ارتفاع المسافة ارتفاع العينة إلى تجميد; يستخدم هذا المثال فاصل 2 سم لإنشاء مكعبات تقريبا 3 سم × 3 سم × 2 سم. حجم النيتروجين السائل سيعتمد على حجم برودة. يستخدم هذا المثال تقريبا 1 L لحوالي 5 مكعبات في السلسلة.
    تنبيه: استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والتهوية والنيتروجين السائل هو cryogen واختناق.
  2. باستخدام ملقط وقفازات المبردة، والوقوف كتلة النحاس الأخرى على نهايته، لجعل استرجاع أسهل عندما تكون العينة في مكانها.

2. جمع العينات وتجميد البطولات الاربع

  1. استخراج النبات المطلوب و rhizosphere من التربة الرطبة باستخدام مجرفة وضمان أن حفرة حفر أكبر بكثير من حجم الجذر المطلوب. ضع التربة ونزرعها في وعاء ووضعها على سطح المقعد.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام التربة المزروعة بوعاء بأكمله والنبات من دراسة وعاء.
  2. تحديد موقع التربة المطلوب حيث الجذور التي يتعين اتخاذها (أي، عمق والقرب من تبادل لاطلاق النار). قطع التربة الزائدة باستخدام شفرة الصلب، مع الحرص على عدم تعكير صفو التربة في المنطقة المطلوبة. عندما يتم الوصول إلى المنطقة المطلوبة، وقطع الجذر "مكعب" ما يقرب من 3 سم × 3 سم × 2 سم ووضع المكعب على الفور بين اثنين من الفواصل على كتلة النحاس الأفقي. باستخدام قفازات التبريد، والتقاط كتلة النحاس العمودي ووضعه على رأس الفواصل لانتقاد تجميد مكعب رهيزوسفير.
  3. بعد انحسار محتدما (~ 5 دقيقة)، استرداد مكعب رهيزوسفير البطولات الاربع المجمدة من كتل النحاس والتفاف داخل مربع رقائق الألومنيوم المسمى مسبقا. وضع علامة على اتجاه الكتلة على احباط إذا رغبت في ذلك. ضعه في حاوية ثانية من النيتروجين السائل حتى يتم تخزينه في ثلاجة -80 درجة مئوية.
  4. كرر حسب الحاجة للحصول على العدد المطلوب من مكعبات الجذر من موقع الحقل أو التجربة. تأكد من إعطاء كل من كتل النحاس الوقت لتبرد بين العينات.

3. تجميد التجفيف وتضمين مكعبات رهيزوسفير

  1. إعداد مجفف تجميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحرص على التأكد من أنها قد حصلت على ضغط الفراغ المناسب ودرجة الحرارة قبل إزالة عينات من -80 درجة مئوية الفريزر.
  2. عندما مجفف تجميد على استعداد لتلقي العينات، ووضع مكعب واحد rhizosphere المجمدة داخل أنبوب نظيفة وحمض غسلها 50 مل وتغطي فضفاضة مع مسح نظيفة المتاح. تأمين مسح مع شريط مطاطي. كرر حسب الحاجة لضمان مكعب واحد لكل أنبوب.
    ملاحظة: إذا كانت العينة كبيرة جدا بالنسبة لأنبوب، يمكن وضعها مباشرة في وعاء مجفف تجميد باستخدام رقائق الألومنيوم كحامل عينة.
  3. وضع أنابيب تحتوي على عينات في تجميد الأوعية مجفف وتجميد الجافة لعدة أيام. يعتمد وقت التجفيف الدقيق على خصائص التربة.
    ملاحظة: تخزين عينات المجففة في مجفف تجميد أو desiccator لتجنب الإماهة.
  4. استخدام شفرة الصلب لقطع مكعبات التربة المجففة لحجم بحيث تناسب الشكل المطلوب (على سبيل المثال، شكل قطرها 25 ملم مثالية لمعظم التطبيقات). تسمية كل شكل، ووضع مكعبات التربة في أشكال ووضع أشكال داخل مجفف فراغ.
  5. إعداد الايبوكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من أن الايبوكسي المختار غير ملوث ولا يسبب تغيرات في الأطياف للعناصر المطلوبة 20،29،30.
  6. استخدام القطارة لإضافة الايبوكسي إلى النموذج على جانب واحد من التربة، حتى يغطي تماما العينة. سوف تظلم التربة في اللون كما الايبوكسي الرطب التربة.
    ملاحظة: إضافة الايبوكسي ببطء للسماح للهواء في التربة للهروب.
  7. مرة واحدة يتم تعبئة أشكال مع الايبوكسي، وإغلاق فراغ المجفف وبدوره على الفراغ. اعتمادا على كمية الهواء المحاصرين في التربة، قد تحتاج إلى إضافة المزيد من الايبوكسي إلى أشكال دوريا. تحقق من مستوى الايبوكسي كل 30-90 دقيقة لأول ساعة 1-4 وإضافة الايبوكسي حسب الحاجة.
  8. إزالة العينة من النموذج مرة واحدة وقد تصلب الايبوكسي (~ 5 أيام).

4. قطع وتقطيع مكعبات الرهيزوسفير

  1. قطع العينة باستخدام منشار شفرة الماس الرطب الدقة. قطع العينات في مواقع مختلفة إذا لم يتم الحصول على جذور في القطع السابق.
  2. الرمل يدويا عينات قطع مع الصنفرة أدق تدريجيا (على سبيل المثال، 220، 500، 1000، و 1500 حصى) على الجانب قطع ل~ 30 ق.
  3. إجراء التصوير السطحي للعينات باستخدام تقنيات مثل LA-ICP-MS.
    ملاحظة: لإعداد مقاطع رقيقة ل S-XRF، إما إرسال العينات إلى شركة قادرة على إعداد المقاطع رقيقة (تلميع الجانب واحد أو مزدوج) أو اتبع الخطوات 4.4 -4.6 كما هو موضح أدناه.
  4. الغراء الجانب عينة المطلوب إلى شريحة الكوارتز باستخدام الغراء السوبر والسماح لعلاج بين عشية وضحاها.
  5. باستخدام آلة تقسيم رقيقة، وقطع التربة على الشرائح إلى 2 مم سميكة ومن ثم طحن إلى سمك المطلوب (عادة 30 ميكرومتر). يمكن تلميع سطح العينة إذا رغبت في ذلك.
  6. إجراء التصوير S-XRF من المقاطع. اتبع الخطوات المناسبة في مرفق السنكروترون المطلوب وخط الحزم للتقدم بطلب للحصول على وقت التصوير والاستفادة منه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتسمح هذه الطريقة بالحفاظ على الجذور والأنواع الكيميائية في جذور وجذور نباتات الأراضي الرطبة وفي التربة السائبة. في هذا العمل، تم استخدام هذه الطريقة لتقييم كما speciation والتوطين المشترك مع أكاسيد Fe و Mn والمواد المغذية النباتية في رهيزوسفير الأرز(Oryza sativa L.). وقد تم زراعة الأرز في مرفق رايس في جامعة ديلاوير حيث يتم استخدام 30 من ذر الأرز (2 متر × 2 متر، 49 نبات لكل منهما) لزراعة الأرز في ظل ظروف مختلفة لإدارة التربة والمياه بهدف خفض امتصاص As و Cd إلى حبات الأرز. وفرت هذه التجربة 1470 نبتة فردية يمكن أخذ عينات منها على مدار موسم النمو.

ونظرا لعدد كاف من العينات، كانت أقسام رقيقة قادرة على التقاط مجموعة متنوعة من مورفولوجيا الجذر. يظهر الشكل 1A عدة أقطار جذر موجودة داخل مصفوفة التربة كأقسام عرضية. ومع ذلك، قد تحتوي بعض أقسام التربة على جذور قليلة، إن وجدت. وفي هذا العمل، تمت معالجة 63 كتلة من التربة وقطعها مرة واحدة على المنشار الرطب لتحديد المجموعة الفرعية من العينات المناسبة للقسم الرقيق. ومن بين العينات ال 63، لم تتضمن 14 عينة أي جذور، واحتوت 31 عينة على جذور من 1 إلى 3، و18 عينة تحتوي على أكثر من 3 جذور. لاحظ أن جذور قد تكون موجودة في مستويات متفاوتة من الجودة. يظهر الشكل 1B جذرا محفوظا جيدا وجذرا مشوها بعملية التجميد والتجفيف وجذرا تم سحبه أثناء عملية الأقسام الرقيقة.

تم تحليل أقسام الجذر رقيقة باستخدام S-XRF لرسم خريطة لموقع العناصر ذات الأهمية. يظهر الشكل 2B مقطعا عرضيا جذرا مع جذر عرضي في مقطع طولي. يوضح الشكل 2C هذا القسم الجذر تحليلها بواسطة XRF مع مؤامرة ثلاثية الألوان من Fe و Mn و As. وFe موجود في التربة والمحيطة الجذر في لوحة Fe، ولوحة Fe مرئية أيضا على الصور ميكروجراف الضوء. المنغنيز موجود بشكل فريد في قشرة الجذر الجانبي ، ولكنه أيضا يشارك في تحديد موقع Fe في بعض المناطق في لوحة Fe ، ويظهر كتدرج أخضر أزرق. كان الزرنيخ موجودا في الغالب في الأوعية الدموية للجذر الجانبي ، حيث اندمج في الأوعية الدموية للجذر الأساسي.

فصل التصوير الطيفي الكيميائي بين مختلف الأنواع ذات الاهتمام من خلال أخذ خرائط XRF المتكررة في طاقات شعاع الحادث متعددة واستخدام تركيبة خطية مناسبة لأطياف XANES القياسية. وتظهر خرائط التكهنات في الشكل 2D وتظهر التباين في توطين الأنواع AS. يظهر الشكل 2E نفس البيانات كرسم ثلاثي الألوان. تظهر المؤامرة ثلاثية الألوان الجلوتاثيون أرسينيت وأرسنيت المرتبطة ارتباطا وثيقا في الأوعية الدموية، في حين يقع في المقام الأول على الحمار على السطح الخارجي للجذر المرتبطة لوحة Fe.

Figure 1
الشكل 1 - أقسام رقيقة جذر الأرز تظهر مجموعة متنوعة من النتائج المنهجية في التربة الطمي (قضبان مقياس 0.5 ملم). أ)العديد من المقاطع العرضية المختلفة قطر الجذر واضحة (في صناديق بيضاء). ب)قد تتلف جذور أثناء العملية. وقد بقي الجذر في المربع الأبيض سليمة ودائرية، في حين تم ضغط الجذر في مربع البرتقال خلال عملية تجميد التجفيف. يظهر المربع الأحمر أين تم سحب جذر أثناء عملية الأقسام الرقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 - مقطع عرضي من جذر الأرز مع قسم طولي من جذر الجانبي في التربة الطمي. أ)قسم التربة يظهر عدة أقسام عرضية الجذر في مربعات بيضاء. تشير الأسهم البيضاء إلى المقاطع الطولية. شريط المقياس هو 2 مم ب) قسم التربة تظهر الجذر من الزاوية اليسرى العليا من لوحة A. مستطيل أبيض يدل على المنطقة التي صورتها XRF السنكروترون. شريط المقياس هو 0.5 مم C.) صورة ثلاثية الألوان XRF من الزرنيخ (الأحمر) والحديد (الأخضر) والمنغنيز (الأزرق). الحد الأقصى لحجم As و Fe و Mn هو نسبة 1:50:2.5. مقياس الشريط هو 100 ميكرومتر. د) خرائط الطيف الزرنيخ XRF لgluathione أرسينيت، أرسينيت، و أرسينات، حيث تشير الألوان الأكثر دفئا تركيزات أعلى من As. مقياس شريط هو 100 ميكرومتر. E) قطعة ثلاثية الألوان من الأنواع AS، حيث يتم تحجيم الحد الأقصى كثافة إلى أرسينيت (الأحمر) = أرسينات (الأخضر) = 0.5 شراثيون أرسينيت (الأزرق). مقياس الشريط هو 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه الورقة بروتوكولا للحصول على التربة السائبة المحفوظة + رهيزوسفير جذور نبات الأراضي الرطبة باستخدام تقنية تجميد البطولات الاربع التي يمكن استخدامها للتصوير عنصري و / أو رسم خرائط المواصفات الكيميائية.

هناك العديد من الفوائد من هذا الأسلوب على الأساليب الموجودة. أولا، تسمح هذه الطريقة بإجراء تحقيق متزامن للجذور ورهيزوسفير المحيطة بها. توجد حاليا طرق للحفاظ على جذورها وصورها كيميائيا من بيئة التربة عن طريق غسل التربة والحفاظ على الجذور31أو32 أو عن طريق زراعة النباتات في بيئات اصطناعية (على سبيل المثال ، rhizoboxes) واستخدام أساليب DGT لفحص تفاعلات التربة الجذرية24و33و34 ولكن دون القدرة على مراقبة الجذر نفسه. وتسمح الطريقة الموصوفة هنا بإجراء تحقيق مباشر في تربة الجذر والتربة المحيطة به في الموقع لرصد العلاقات بين الجذر والتربة. وقد استخدمت تقنية مماثلة لفحص جذور الأرز في الموقع ورهيزوسفير المحيطة بها ولكن مع يغرق العينة في النيتروجين السائل11،35،36 بدلا من تجميد البطولات الاربع الموصوفة هنا. يتم تجميد أسرع الأنسجة، وأقل احتمالا أنها تشكل بلورات الجليد37. البطولات الاربع تجميد بين كتل النحاس المبردة مسبقا يبرد بسرعة العينة، وبالتالي يقلل من تشكيل بلورات الجليد وتلف الأنسجة النباتية اللاحقة التي يمكن أن تحدث مع فلاش تجميد باستخدام النيتروجين السائل في درجات الحرارة المحيطة11،38. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، يمكن أخذ العديد من العينات من نفس النبات ، ومصانع متعددة من حقل ، و / أو البيئة في فترة زمنية قصيرة نسبيا. وبمجرد الحصول عليها، يمكن تجفيف العديد من العينات بالتجميد، وتضمينها في الايبوكسي، وقطعها بالمنشار الرطب بنصل الماس بأقل تكلفة ممكنة. ويمكن بعد ذلك فحص هذه العينات باستخدام مجهر خفيف لتحديد العينات الواعدة التي يمكن تصويرها مباشرة (مثل LA-ICP-MS) أو معالجتها بشكل أكبر لإجراء قسم رفيع وتصوير SXRF. يمكن لقسم واحد رقيقة التقاط جذور متعددة من مختلف الأحجام على نفس الشريحة، مما يساعد على التقاط رهيزوسفير غير متجانسة وتعظيم وقت التصوير على الصك. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لمراقبة مباشرة العلاقات بين النباتات والتربة مثل عزل في لويحات Fe دون إزعاج رهيزوسفير. الأساليب القائمة للحث على تشكيل لوحة Fe على جذور الأراضي الرطبة مثل الأرز باستخدام تجارب الزراعة المائية39،40،41 تفشل في التقاط عدم تجانس لوحة Fe من حيث تغطية الجذر وتكوين المعادن التي تحدث في النباتات المزروعة بالتربة11،18،20،42،43،44.

لكي تكون الطريقة ناجحة، من الضروري اتباع بعض الخطوات الرئيسية. أولا، تأكد من أن عينة الموقع والتوجه المحددة تتناول السؤال المطلوب. ثانيا، استخدم الايبوكسي الخالي من التلوث بالعنصر النزرة وقد ثبت أنه يحافظ على الأطياف الكيميائية لعناصر الاهتمام20و29و30. ثالثا، إضافة الايبوكسي ببطء ووضع العينة في الايبوكسي تحت فراغ لتسهيل التبول الايبوكسي من العينة وإزالة الغاز المحاصرين. وبعد هذه الخطوات سوف توفر عينة عالية الجودة من التربة السائبة، ورهيزوسفير، والجذور التي يمكن استخدامها لتحليل الصور.

وينبغي النظر في عدة قيود على الطريقة. أولا، تجفيف العينة المجمدة على مجفف تجميد يمكن أن يسبب تشوه التربة، والتي قد تؤثر على الجذور. ومن المرجح أن يكون هذا تحديا خاصا في التربة ذات المحتوى الطيني العالي وبالتالي الميل إلى الانهيار مع جفاف الطين. وكمثال على ذلك، تم إعداد عينة من رهيزوسفير الأرز تم الحصول عليها من طين الطمي وتكسير التربة واضح في حين أن جذر الأرز المغلف بالبلاك في لا يتأثر(الشكل 3).

Figure 3
الشكل 3   - الأرز الجذر رقيقة القسم من التربة الطين الطمي. وقد حدثت العديد من الشقوق في التربة أثناء تجميد التجفيف، ولكن هذه الشقوق لم تشوه القسم الطولي الجذر الجانبي، الذي يصوره المستطيل الأبيض. شريط المقياس هو 0.5 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وتظهر البيانات أن هذه التقنية يمكن أن تنجح في الحصول على معلومات على نطاق ميكرون في الطمي(الشكل 2، 3)،ومن المرجح أن هذه التقنية يمكن أن تكون ناجحة في التربة محكم خشنة؛ ومع ذلك، قد تشكل التربة ذات المحتوى الطيني الأعلى تحديات وينبغي مواصلة التحقيق فيها. ثانيا، يمكن سحب الجذور من التربة عند تقسيمها. وهذا التحدي ليس فريدا من نوعه بالنسبة للبروتوكول الوارد وصفه في هذه الورقة، بل ينبغي النظر فيه. ثالثا، قد لا تكون الجذور موجودة في كل مكعب تربة، لذلك تحتاج إلى الحصول على العديد من العينات وقطع لالتقاط رهيزوسفير النبات المطلوب. رابعا، تتطلب طريقة الحفظ النيتروجين السائل، الذي قد يشكل تحديات للدراسات الميدانية عن بعد. هنا، تم استخدام البروتوكول بنجاح في هذا المجال، الذي كان أقل من 2 كيلومتر من ديوار النيتروجين السائل. ومع ذلك، إذا لم يكن النيتروجين السائل متوفرا على مسافة قصيرة بالسيارة من موقع حقل بعيد، فتوجد عدة خيارات للحصول على العينة. ويشمل ذلك استخدام مصدر آخر لتبريد الكتل النحاسية أو التنقيب عن النبات بأكمله والتربة المحيطة به بحلقة PVC كبيرة ، ووضع هذا في مواد غير منفذة للغاز ، والنقل إلى أقرب مصدر النيتروجين السائل للحفاظ عليه. لهذا، من المهم التأكد من أن إطلاق النار النبات لا تقطع من جذورها قبل الحصول على عينة رهيزوسفير. إذا لزم الأمر، يمكن أيضا وضع العينة تحت التبريد وشحنها بين عشية وضحاها إلى المختبر للحفاظ عليها. وبمجرد تلقيها في المختبر، يمكن بعد ذلك الحفاظ على الأقسام باستخدام كتل النحاس السائل المبرد بالنيتروجين. وأخيرا، يمكن إجراء تغييرات في التكهنات مع أي طريقة للحفاظ على تربة الأراضي الرطبة ورهيزوسفيرس. لتجنب ذلك ، يجب الحصول على عينات وتجميدها بسرعة أو غيرها من التدابير التي اتخذت على النحو الوارد أعلاه لتجنب التعرض للأوكسجين. ويمكن بعد ذلك حلق حواف العينات المجففة بالتجميد لتجنب الحواف التي قد تكون تعرضت أعلى للأوكسجين. الحفاظ على أنواع الزرنيخ انخفاض في عينات الجذر ورهيزوسفير هنا (الشكل 1D، هاء) ، وفي العمل السابق28 يشير إلى أن هذه التقنية تجميد البطولات الاربع قادرة على الحفاظ على الأنواع الكيميائية الحساسة للأوكسجين إذا أجريت بعناية.

ويمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة العديد من الأسئلة الرئيسية في علم الرهيزوسفير. وتشمل هذه التطبيقات المتعلقة بدراسة التفاعلات المغذيات والملوثات في رهيزوسفير التي قد تشمل تفاعلات الملوثات والمواد المغذية مع لويحات Fe أو Mn. وتسمح هذه الطريقة بدراسة التغايرية الزمنية والمكانية للعلاقات بين النباتات والتربة ودراسة كيفية تفاعل مورفولوجيا الجذور مع العناصر الموجودة في الغلاف المهزوزفيري في الموقع. ويمكن استخدامه في التطبيقات المتعلقة بالأمن الغذائي مثل فهم امتصاص الزرنيخ من قبل الأرز، وديناميات المغذيات في رهيزوسفير، أو التطبيقات المتعلقة بالتطبي النباتي مثل امتصاص المعدن (اللويد) في نباتات الأراضي الرطبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ويعترف المؤلفان بمنحة بذور مشتركة إلى سيفرث وطابيرو لدعم التعاون بين مختبر جامعة ديلاوير وبروكهافن الوطني. استخدمت أجزاء من هذا البحث خط شعاع XFM (4-BM) من مصدر ضوء السنكروترون الوطني II ، وهو مكتب وزارة الطاقة الأمريكية (DOE) لمرفق مستخدمي العلوم الذي يعمل لمكتب وزارة الطاقة للعلوم من قبل مختبر بروكهافن الوطني بموجب العقد رقم DE-SC0012704.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Copper blocks McMaster Carr 89275K42
Diamond blade Buehler 15 LC, 102 mm x 0.3 mm operation speed: 225 rpm
Epoxy forms Struers 40300085 FixiForm
Epoxy Epotek 301-2FL
Superglue Loctite 404
Thin sectioning machine Buehler PetroThin
Wet saw Buehler IsoMet 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
  2. McNear, D. H. The rhizosphere - roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
  5. Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
  6. Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
  7. Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
  8. Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
  9. Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
  10. Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
  11. Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
  12. Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
  13. Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
  14. vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
  15. Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  16. Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
  17. Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
  18. Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
  19. Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
  20. Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
  21. Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
  22. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
  23. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  24. Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  25. Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
  26. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  27. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
  28. Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
  29. Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
  30. Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
  31. Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
  32. Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
  33. Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
  34. Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
  35. Voegelin, A., Weber, F. -A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
  36. Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
  37. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  38. Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
  39. Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
  40. Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
  41. Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
  42. Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
  43. Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
  44. Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).

Tags

العلوم البيئية، العدد 168، تجميد البطولات الاربع، تجميد التجفيف، رسم خرائط المواصفات، الأشعة السينية الفلورية، LA-ICP-MS، لوحة الجذر
طريقة للحفاظ على جذور الأراضي الرطبة ورهيزوسفير للتصوير عنصري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A.,… More

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A., Tappero, R. A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62227, doi:10.3791/62227 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter