元素成像保护湿地根和岩石圈的方法

Summary

我们描述了一个协议，以水稻（Oryza水稻 L.）为模型物种，从湿地环境中取样、保存和分割完整的根部和周围的岩石圈土壤。保存后，可以使用元素成像技术（如同步加速器 X 射线荧光 （XRF） 化学光谱成像技术分析样品。

Abstract

根与土壤环境广泛相互作用，但可视化根与周围岩石圈之间的这种相互作用是具有挑战性的。湿地植物的岩石圈化学由于从根部到散装土壤的陡峭氧梯度，在捕获方面尤其具有挑战性。这里描述了一个协议，通过猛击冷冻和冷冻干燥，有效地保留了湿地植物的根系结构和岩石圈化学。大满贯冷冻，样品被冻结在铜块之间预先冷却液氮，尽量减少根部损伤和样品失真，可能发生闪光冻结，同时仍然尽量减少化学规格的变化。虽然样品失真仍有可能，但快速且成本最低的多个样品的能力增加了获得满意样品和优化成像时间的潜力。资料显示，该方法成功地保存了与铁斑块相关的稻根和生虫的减少砷物种。这种方法可用于研究各种湿地环境中的植物-土壤关系，这些环境跨越了从微量元素循环到植物化应用等各种浓度范围。

Introduction

根及其生殖球是动态的，异质的，对于理解植物如何获得矿物养分和污染物^1，2，3至关重要。根系是营养物质（例如磷）和污染物（例如砷）从土壤转移到植物的主要途径，因此了解这个过程对食物数量和质量、生态系统功能和植物灭菌有影响。然而，根是动态的空间和时间增长，以满足营养获取的需求，他们往往在功能，直径和结构（例如，横向根，冒险根，根毛^）2。根系的异质性可以在从细胞到生态系统的空间尺度上以及从每小时到十进制的时间尺度上进行研究。因此，根及其周围土壤（或日光圈）的动态和异质性对捕捉日光圈化学提出了挑战。尽管面临这一挑战，但必须研究土壤环境中的根源，以描述这种关键的植物与土壤关系。

湿地植物的岩石圈化学研究尤其具有挑战性，因为从散装土壤到根部存在陡峭的氧梯度，在空间和时间上都发生了变化。由于根部需要氧气来恢复，湿地植物已经适应了湿地土壤的低氧条件，创造了^4，5。Aerenchyma 是空心皮质组织，从芽延伸到根部，允许空气通过植物扩散到根部。然而，其中一些空气泄漏到岩石圈在较低的亚化部分的根，特别是附近的横向根结，不太成熟的根尖和拉长区^{6，7，8，9。}这种径向缺氧在湿地植物的日生圈中形成了一个氧化区，影响生化层（生物-地理）化学，与减少的散装土壤^10、11、12有区别。要了解湿地生殖圈和根部营养物质和污染物的命运和运输，必须保存化学减少的散装土壤、氧化的生殖圈和湿地植物的根部进行分析。然而，由于散装土壤中含有对氧敏感的土壤成分减少，根部和土壤保护方法必须保留根部结构并尽量减少对氧敏感的反应。

存在修复植物组织和保存超结构成像的方法，但这些方法不能应用于化学保存生长在湿地土壤中的根部。对于只需要植物细胞内元素分布的调查，植物通常以水力方式生长，根部可以很容易地从溶液中去除，在高压冻结和冷冻替代下固定，并分割成各种成像应用，包括高分辨率二次离子质谱（nanoSIMS）、电子显微镜和同步加速器X射线荧光 （S-XRF） 分析^{13， 14，15}.为了研究湿地根部外的Fe斑块，这些水培研究必须在溶液¹⁶中人工诱导Fe斑块的形成，不能准确地代表Fe斑块形成的分布和矿物成分的异质性以及原位17、18、19、20等相关元素。有保存湿地土壤和与冻土^有关的微生物的方法，但很难用这种技术获得根基。目前可视化土壤中生长的根及其生殖层化学的方法包括两种主要测量类型：元素通量和总元素浓度（和规格）。前者通常使用薄膜 （DGT）^22、23、24中的扩散梯度进行测量，其中土壤被放置在 rhizobox 中，以支持实验室环境中的植物生长，土壤中的阴唇元素通过凝胶扩散到结合层中。然后，可以成像此绑定层，以量化感兴趣的阴唇元素。这项技术可以成功地说明根与日光圈^{24、25、26、27}之间的关系，但根界的人工制品可能通过在rhizots中生长植物而存在，而且没有用DGT捕获有关根内部的信息。后者涉及根部和岩石圈的采样，保存样本，并直接分析样本部分的元素分布。对于湿地植物根部及其周围生虫圈的环境采样，需要仔细的样品处理，以避免样品制备中的人工制品。

这里描述了一个协议，通过猛击冷冻和冷冻干燥，有效地保护了湿地植物的根系结构和岩石圈化学。闪光冻结可以大大减缓对氧敏感溶质的转化，但可能会损坏根部，当样品干涸时，可能会引起动员。然而，在用液氮预冷的铜块之间冷冻样品的重度冻结，可最大限度地减少根部损伤和样品失真^28。然后，保存下来的样品被嵌入环氧树脂中，保存为^20、29，并可以切割和抛光，以成像其岩石圈土壤中的根部。本报告中的样本在薄截面后由 S-XRF 化学规格成像分析。但是，还可以使用其他成像技术，包括激光消融感应耦合等离子质谱 （LA-ICP-MS）、粒子诱导 X 射线发射 （PIXE）、二次离子质谱 （SIMS） 和激光诱导故障光谱 （LIBS） 成像。

Protocol

1. 准备防冻设备

1. 将两个铜块（+5 厘米 x 5 厘米 x 15 厘米）水平放置在能够容纳液氮的清洁冷却器内，并倒入足够的液氮以淹没方块。一旦冒泡消退，将两个隔垫放在每端一个铜块的顶部。
   注：垫片高度决定要冻结的样品的高度：此示例使用 2 厘米隔间创建约 3 厘米 x 3 厘米 x 2 厘米的立方体。液氮的体积取决于冷却器的大小。此示例对大约 5 个立方体系列使用大约 1 L。
   注意：使用适当的个人防护设备和通风，因为液氮是低温和窒息。
2. 使用钳子和低温手套，将另一块铜块放在其末端，使取样在就位时更容易检索。

2. 样品收集和大满贯冻结

1. 使用铲子从潮湿的土壤中提取所需的植物和岩石圈，并确保挖洞比所需的根体积大得多。将土壤和植物放入容器中，并将其放置在台面上。
   注：整个盆栽土壤和植物从锅研究也可以使用。
2. 确定需要采集根部的土壤位置（即深度和接近拍摄）。使用钢刀片切割多余的土壤，注意不要打扰所需区域的土壤。当达到所需的区域时，切开一个约 3 厘米 x 3 厘米 x 2 厘米的根"立方体"，并立即将立方体放在水平铜块上的两个隔间之间。使用低温手套，拿起垂直铜块，并把它放在垫片的顶部，猛击冻结的生球立方体。
3. 冒泡消退（+5分钟）后，从铜块中取回被猛击冻结的岩石圈立方体，并包裹在预先标记的铝箔方块内。如果需要，在铝箔上标记块的方向。放入第二个液氮容器中，直到储存在 -80 °C 的冰柜中。
4. 根据需要重复，从现场或实验中获取所需的根立方体数量。确保两个铜块有时间在样品之间冷却。

3. 冷冻干燥和嵌入岩石圈立方体

1. 根据制造商的说明准备冷冻烘干机。在从 -80 °C 冰柜中取出样品之前，请注意确保它已获得适当的真空压力和温度。
2. 当冷冻干燥机准备接收样品时，将一个冷冻的 rhizosphere 立方体放在一个干净的酸洗 50 mL 管内，并用干净的一次性湿巾松散地盖住。用橡皮筋固定擦拭。根据需要重复，以确保每个管子一个立方体。
   注：如果样品对于管子来说太大，可以直接放置在冷冻干燥容器中，使用铝箔作为样品架。
3. 将含有样品的管子放到冷冻干燥容器中，冷冻干燥数天。确切的干燥时间将取决于土壤特性。
   注意：将干燥的样品存放在冷冻干燥机或干燥器中，以避免补液。
4. 使用钢刀片将干燥的土壤立方体切割成大小，使其适合所需的形式（例如，25 mm 直径的表型是大多数应用的理想之选）。标记每个形式，将土壤立方体放置在表格中，并将表格放置在真空干燥器中。
5. 根据制造商的说明准备环氧树脂。确保所选环氧树脂不受污染，不会引起所需元素^20、29、30的规格变化。
6. 使用滴剂在土壤的一侧添加环氧树脂，直到它完全覆盖样品。当环氧树脂弄脏土壤时，土壤会变暗。
   注：慢慢加入环氧树脂，让土壤中的空气逸出。
7. 一旦表格中充满环氧树脂，关闭真空干燥器并打开真空。根据土壤中所困空气的量，可能需要定期在表单上添加更多的环氧树脂。检查前 1-4 小时每 30-90 分钟一次环氧树脂水平，并根据需要添加环氧树脂。
8. 环氧树脂变硬后（+5 天）从表单中取出样品。

4. 切割和分割岩石圈立方体

1. 使用钻石刀片精密湿锯切割样品。如果在上一次切口中未获得根部，则在不同位置切割样本。
2. 手动将切口样品用逐渐细的砂纸（例如，220、500、1000 和 1500 砂砾）在切面上砂砾，为 ±30s。
3. 使用 LA-ICP-MS 等技术对样品进行表面成像。
   注：要为 S-XRF 准备薄部分，请将样品发送给能够准备薄部分（单面或双面抛光）的公司，或按照下面描述的 步骤 4.4 - 4.6 进行 。
4. 使用超级胶水将所需的样品侧粘在石英滑梯上，并允许在一夜之间治愈。
5. 使用薄切片机，将滑梯上的土壤切割到 2 mm 厚，然后研磨到所需的厚度（通常为 30 μm）。如果需要，可以抛光样品表面。
6. 对各节进行 S-XRF 成像。按照所需的同步加速器设施和光束线的适当步骤申请和利用成像时间。

Representative Results

这种方法允许在湿地植物的根和生土层中保存根部和化学物种，并进入散装土壤。在这项工作中，该方法用于评估稻米（Oryza水稻 L.）中与Fe和Mn氧化物以及植物养分的规格和共定位。水稻是在特拉华大学的水稻设施中种植的，在那里，30个稻田间皮（每株2米x2米，49株）用于在各种水土管理条件下种植水稻，目的是降低水稻谷物的吸收率和CD。这个实验提供了1470种单个植物，在整个生长季节可以从这些植物中取样。

鉴于样本数量充足，薄部分能够捕获各种根形态。 图1A 显示土壤基质内存在几个根直径作为横截面。然而，有些土壤部分可能包含很少（如果有的话）根部。在这项工作中，对63块土壤块进行了加工和切割，在湿锯上切割一次，以确定哪些样品子集适合薄切。在63个样本中，14个样本没有根，31个样本包含1-3根，18个样本包含3个以上根。请注意，根可能以不同的质量水平存在。 图1B 显示了保存完好的根，一个被冷冻干燥过程扭曲的根，以及一个在细分段过程中被拔出的根。

使用 S-XRF 分析根薄部分，以映射感兴趣的元素的位置。 图 2B 显示纵向部分带有横向根的根横截面。 图 2C 显示了 XRF 分析的这个根部分，其中有 Fe、Mn 和 As 的三色图。Fe 存在于土壤中，并围绕 Fe 斑块的根部，在光显微图图像上也可以看到 Fe 斑块。锰是独特的存在于横向根的皮层，但也与Fe在Fe斑块的某些区域共同定位，以绿蓝色色调出现。砷主要存在于横向根的血管中，并合并为原根的血管。

化学光谱成像通过在多个事件光束能量下反复绘制 XRF 地图，并使用符合标准 AS XANES 光谱的线性组合，将各种感兴趣的物种分开。图 2D 中显示了 As 规格地图，并显示了作为物种的本地化的变异性。 图 2E 显示与三色图相同的数据。三色情节显示砷酸盐和砷酸盐谷胱甘肽与血管密切相关，而砷酸盐主要位于与 Fe 斑块相关的根部外部。

图1 - 稻根薄段，在淤泥土壤中显示各种方法结果 （鳞片条为0.5毫米）。 A） 许多不同的根直径横截面是显而易见的（在白色框中）。 B） 根可能在这个过程中损坏。白色盒子中的根保持完好无损和圆形，而橙色盒子中的根在冷冻干燥过程中被压缩。红色框显示在薄分割过程中根部被拔出的位置。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2 -稻根的横向部分，在淤泥泥土中横向根的纵向部分。A） 土壤部分显示白色盒子中的几个根横截面部分。白色箭头表示纵向部分。比例尺条为 2 mm. B） 土壤部分，显示面板 A. 白色矩形左上角的根表示由同步加速器 XRF 成像的区域。比例杆为 0.5 mm. C） 砷（红色）、铁（绿色）和锰（蓝色）的三色 XRF 图像。As、Fe 和 Mn 的最大比例为 1：50：2.5。秤杆为 100 μm。 D） 砷 XRF 规格地图，用于砷铁矿、砷酸盐和砷酸盐，其中较温暖的颜色表示 As. 比例条浓度较高。比例条为 100 μm. E） 三色图作为物种，其中最大强度被缩放到砷铁矿（红色） = 砷酸盐（绿色） = 0.5 砷谷氨酸（蓝色）。刻度条为 100 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

本文描述了一种利用可用于元素成像和/或化学规格映射的重度冷冻技术获取湿地植物根部保存的散装土壤和生肖球的协议。

与现有方法比较，此方法有几个优点。首先，这种方法允许同时调查根部和周围的生虫圈。目前存在的方法是，通过冲走土壤和保存^根31、32或在人工环境中种植植物（如rhizotbox），以及使用DGT方法检查根-土壤相互作用^{24、33、34，}但没有能力观察根本身^，来保存和化学成像根。此处描述的方法允许直接调查根部和周围的地层土壤，以便观察根-土关系。类似的技术已经用于检查原位水稻根部和周围的生虫圈，但与暴跌样品到液氮11，35，36，而不是猛击冻结这里描述。组织冻结得越快，形成冰晶^的可能性就越小。预冷铜块之间的冰封会迅速冷却样品，从而最大限度地减少冰晶的形成和随后的植物组织损伤，这些损伤可能在环境温度^11、38时使用液氮进行闪冻结。使用此处描述的方法，可以在相对较短的时间内从同一工厂、多个工厂和/或环境中采集多个样本。一旦获得，许多样品可以冷冻干燥，嵌入环氧树脂，并切与钻石刀片湿锯以最小的成本。然后，可以使用光显微镜对这些样品进行调查，以确定可直接成像（例如 LA-ICP-MS）或进一步处理薄切除和 sXRF 成像的有前途的样品。一个薄部分可以在同一幻灯片上捕获不同大小的多个根部，这有助于捕获异质的狂犬病球，并最大限度地延长仪器上的成像时间。这种方法还可用于直接观察植物与土壤的关系，如在粪便中封存，而不会干扰生虫圈。现有的方法，诱导Fe斑块形成湿地根部，如水稻使用水培实验39，40，41未能捕捉到在土壤生长的植物11，18，20，42，43，44的根覆盖和矿物成分的Fe斑块的异质性。

要使该方法成功，必须遵循几个关键步骤。首先，确保所选的样本位置和方向解决所需的问题。其次，使用环氧树脂，这是没有微量元素污染，并已证明保存化学规格作为感兴趣的元素^{20，29，30。}第三，慢慢加入环氧树脂，将样品置于环氧树脂真空中，以方便环氧树脂湿润样品和去除被包裹的气体。按照这些步骤，将提供高质量的散装土壤、岩石圈和根部样本，可用于图像分析。

应考虑该方法的若干局限性。首先，在冷冻干燥机上干燥冷冻样品会导致土壤变形，从而影响根部。这可能在粘土含量高的土壤中尤其具有挑战性，因此随着粘土干燥，容易坍塌。例如，从淤泥中获取的稻米岩层样本被制备出来，土壤的开裂是明显的，而Fe斑块涂层的稻根不受影响（图3）。

图3  -稻根薄段从淤泥稻田土壤。在冻干过程中，土壤中出现了许多裂缝，但这些裂缝并没有扭曲白色矩形所描绘的横向根纵向部分。比例栏为 0.5 毫米。请单击此处查看此图的较大版本。

资料显示，该技术可在淤泥中成功获取微米级信息（图2、3），在粗质土壤中有望获得成功：然而，粘土含量较高的土壤可能会带来挑战，应进一步调查。第二，在分割时可以从土壤中拔出根。这一挑战并非本文所述议定书所独有，但应加以考虑。第三，根可能并不存在于每个土壤立方体中，因此需要获取和切割许多样本来捕获所需植物的生化物圈。第四，保存方法需要液氮，这可能对远程野外研究构成挑战。在这里，该协议已成功地用于该领域，该油田距离液氮德瓦尔不到2英里。但是，如果在距离远程现场不远的车程内无法获得液氮，则有几个选项可以获取样品。这包括使用另一个来源冷却铜块或用大型PVC环挖掘整个植物和周围土壤，将其放入气体不透水材料中，并输送到最近的液氮源保存。为此，在获得狂生球样品之前，必须确保植物芽不会从其根部切开。如有必要，样品也可以置于制冷下，并连夜运到实验室保存。一旦收到在实验室，然后可以使用液氮冷却铜块保存部分。最后，任何湿地土壤和地栖圈的保存方法都有可能发生物种变化。为了避免这种情况，必须快速获取样品并快速冷冻或采取上述其他措施，以避免接触氧气。然后，可以剃掉冷冻干燥样品的边缘，以避免可能暴露在氧气中较高的边缘。保存减少的砷物种在根部和生球样品在这里（图1D，E）和在以前的工作²⁸表明，这种猛击冻结技术能够保存对氧敏感的化学物种，如果仔细执行。

这种方法可用于解决日光圈科学中的几个关键问题。这些应用包括与研究生物质圈中的营养和污染物相互作用相关的应用，其中可能包括污染物和营养物质与 Fe 或 Mn 斑块的相互作用。该方法允许研究植物-土壤关系的时间和空间异质性，并研究根形态如何与原位的生殖圈中的元素相互作用。它可用于与粮食安全相关的应用，如了解水稻的砷吸收、rhizosphere 中的营养动力学，或与植物化相关的应用，如金属（loid）吸收到湿地植物中。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper blocks	McMaster Carr	89275K42
Diamond blade	Buehler	15 LC, 102 mm x 0.3 mm	operation speed: 225 rpm
Epoxy forms	Struers	40300085	FixiForm
Epoxy	Epotek	301-2FL
Superglue	Loctite	404
Thin sectioning machine	Buehler	PetroThin
Wet saw	Buehler	IsoMet 1000