Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Une méthode pour préserver les racines et les rhizosphères des zones humides pour l’imagerie élémentaire

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62227
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Plant and Soil Sciences, University of Delaware, 2National Synchrotron Radiation Lightsource-II, Brookhaven National Laboratory

Summary

Nous décrivons un protocole pour échantillonner, préserver et sectionner les racines intactes et le sol de la rhizosphère environnante dans les milieux humides en utilisant le riz(Oryza sativa L.) comme espèce modèle. Une fois conservé, l’échantillon peut être analysé à l’aide de techniques d’imagerie élémentaire, telles que l’imagerie par spéciation chimique par fluorescence X synchrotron (XRF).

Abstract

Les racines interagissent beaucoup avec leur environnement de sol, mais il est difficile de visualiser de telles interactions entre les racines et la rhizosphère environnante. La chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides est particulièrement difficile à capturer en raison des gradients d’oxygène abrupts des racines au sol en vrac. Ici, un protocole est décrit qui préserve efficacement la structure racinaire et la chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides grâce à la congélation et à la lyophilisation. La congélation slam, où l’échantillon est congelé entre des blocs de cuivre pré-refroidis avec de l’azote liquide, minimise les dommages aux racines et la distorsion de l’échantillon qui peuvent se produire avec la congélation éclair tout en minimisant les changements de spéciation chimique. Bien que la distorsion de l’échantillon soit encore possible, la possibilité d’obtenir plusieurs échantillons rapidement et à un coût minimal augmente le potentiel d’obtenir des échantillons satisfaisants et optimise le temps d’imagerie. Les données montrent que cette méthode réussit à préserver les espèces d’arsenic réduites dans les racines de riz et les rhizosphères associées aux plaques de fer. Cette méthode peut être adoptée pour l’étude des relations plantes-sol dans une grande variété d’environnements de zones humides qui couvrent des plages de concentration allant du cycle des oligo-éléments aux applications de phytoremédiation.

Introduction

Les racines et leurs rhizosphères sont dynamiques, hétérogènes et d’une importance cruciale pour comprendre comment les plantes obtiennent des nutriments minéraux et des contaminants1,2,3. Les racines sont la principale voie par laquelle les nutriments (p. ex., le phosphore) et les contaminants (p. ex., l’arsenic) se déplacent du sol aux plantes et, par conséquent, la compréhension de ce processus a des répercussions sur la quantité et la qualité des aliments, le fonctionnement de l’écosystème et la phytoremédiation. Cependant, les racines sont dynamiques dans l’espace et le temps en croissance en réponse aux besoins d’acquisition de nutriments et elles varient souvent en fonction, en diamètre et en structure (par exemple, racines latérales, racines adventices, poils racinaires)2. L’hétérogénéité des systèmes racinaires peut être étudiée à l’échelle spatiale, du niveau cellulaire au niveau de l’écosystème et à l’échelle temporelle, de l’heure au décennal. Ainsi, la nature dynamique et hétérogène des racines et de leur sol environnant, ou rhizosphère, pose des défis pour capturer la chimie de la rhizosphère au fil du temps. Malgré ce défi, il est impératif d’étudier les racines dans leur environnement de sol pour caractériser cette relation critique plante-sol.

La chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides est particulièrement difficile à étudier en raison des gradients d’oxygène abrupts qui existent du sol en vrac aux racines, qui changent dans l’espace et le temps. Parce que les racines ont besoin d’oxygène pour respirer, les plantes des zones humides se sont adaptées aux conditions de faible teneur en oxygène des sols des zones humides en créant un aerenchyma4,5. Les aéréchymes sont des tissus corticaux évidés qui s’étendent des pousses aux racines, permettant la diffusion de l’air à travers la plante dans les racines. Cependant, une partie de cet air s’échappe dans la rhizosphère dans les parties moins subérisées des racines, en particulier près des jonctions latérales des racines, des extrémités des racines moins matures et des zones d’allongement6,7,8,9. Cette perte radiale d’oxygène crée une zone oxydée dans la rhizosphère des plantes des zones humides qui affecte la rhizosphère (bio-géo)chimie et est distincte du sol en vrac réduit10,11,12. Pour comprendre le devenir et le transport des nutriments et des contaminants dans les rhizosphères et les racines des zones humides, il est essentiel de préserver le sol en vrac chimiquement réduit, la rhizosphère oxydée et les racines des plantes des zones humides pour analyse. Cependant, comme le sol en vrac contient des constituants réduits du sol qui sont sensibles à l’oxygène, les méthodes de préservation des racines et du sol doivent préserver les structures racinaires et minimiser les réactions sensibles à l’oxygène.

Il existe des méthodes pour fixer les tissus végétaux et préserver l’ultrastructure pour l’imagerie, mais ces méthodes ne peuvent pas être appliquées pour préserver chimiquement les racines qui poussent dans le sol des zones humides. Pour les études où seule la distribution élémentaire dans les cellules végétales est souhaitée, les plantes sont généralement cultivées en hydroponie et les racines peuvent être facilement retirées de la solution, fixées sous congélation à haute pression et substitution par congélation et sectionnées pour une variété d’applications d’imagerie, y compris la spectrométrie de masse ionique secondaire à haute résolution (nanoSIMS), la microscopie électronique et l’analyse synchrotron par fluorescence X (S-XRF)13, 14,15. Pour étudier la plaque de Fe à l’extérieur des racines des zones humides, ces études hydroponiques doivent induire artificiellement la formation de plaque de Fe dans la solution16, qui ne représente pas avec précision l’hétérogénéité de la distribution et de la composition minérale de la formation de plaque de Fe et des éléments associés in situ17,18,19,20. Des méthodes existent pour préserver le sol des zones humides et les micro-organismes associés au carottage par congélation21, mais il est difficile d’obtenir des racines avec cette technique. Les méthodes actuelles pour visualiser les racines qui poussent dans le sol et leur chimie rhizosphérique se composent de deux types de mesure primaires: les flux élémentaires et la concentration élémentaire totale (et la spéciation). Le premier est généralement mesuré à l’aide de gradients diffusifs dans des couches minces (DGT)22,23,24, dans lesquelles le sol est placé dans des rhizoboxes pour soutenir la croissance des plantes en laboratoire et les éléments labiles dans le sol diffusent à travers un gel dans une couche de liaison. Cette couche de liaison peut ensuite être imagée pour quantifier les éléments labiles d’intérêt. Cette technique peut illustrer avec succès les relations entre les racines et la rhizosphère24,25,26,27, mais des artefacts provenant de la délimitation des racines peuvent exister en cultivant des plantes dans des rhizoboxes, et les informations sur l’intérieur des racines ne sont pas capturées avec DGT. Ce dernier implique l’échantillonnage des racines et de la rhizosphère, la préservation de l’échantillon et l’analyse directe de la distribution élémentaire sur une section d’échantillon. Pour cet échantillonnage environnemental des racines des plantes des zones humides et de leur rhizosphère environnante, une manipulation minutieuse des échantillons est nécessaire pour éviter les artefacts provenant de la préparation des échantillons.

Ici, un protocole est décrit qui préserve efficacement les structures racinaires et la chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides par congélation et lyophilisation. La congélation éclair peut ralentir considérablement les transformations des solutés sensibles à l’oxygène, mais peut endommager les racines et provoquer une mobilisation lorsque les échantillons se dessèchent. Cependant, la congélation par claquement où l’échantillon est congelé entre des blocs de cuivre pré-refroidis avec de l’azote liquide minimise les dommages aux racines et la distorsion de l’échantillon28. Les échantillons conservés sont ensuite incorporés dans une résine époxy qui préserve la spéciationAs 20,29 et peut être coupée et polie pour l’imagerie des racines dans leur sol de rhizosphère. Les échantillons de ce rapport ont été analysés par imagerie de spéciation chimique S-XRF après sectionnement mince. Cependant, d’autres techniques d’imagerie pourraient également être utilisées, notamment la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif par ablation laser (LA-ICP-MS), l’émission de rayons X induite par particules (PIXE), la spectrométrie de masse ionique secondaire (SIMS) et l’imagerie par spectroscopie de dégradation induite par laser (LIBS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation de l’équipement de congélation par slam

  1. Placez deux blocs de cuivre (~5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontalement à l’intérieur d’un refroidisseur propre capable de contenir de l’azote liquide et versez suffisamment d’azote liquide pour immerger les blocs. Une fois que le bouillonnement s’estompe, placez deux entretoises au-dessus d’un bloc de cuivre à chaque extrémité.
    REMARQUE : La hauteur de l’entretoise détermine la hauteur de l’échantillon à congeler; cet exemple utilise une entretoise de 2 cm pour créer des cubes d’environ 3 cm x 3 cm x 2 cm. Le volume de l’azote liquide dépendra de la taille du refroidisseur. Cet exemple utilise environ 1 L pour environ 5 cubes en série.
    ATTENTION : Utilisez un équipement de protection individuelle et une ventilation appropriés, car l’azote liquide est un cryogène et un asphyxiant.
  2. À l’aide de pinces et de gants cryogéniques, placez l’autre bloc de cuivre à son extrémité pour faciliter la récupération lorsque l’échantillon est en place.

2. Prélèvement d’échantillons et congélation

  1. Extrayez la plante et la rhizosphère souhaitées du sol humide à l’aide d’une pelle et assurez-vous que le trou creusé est beaucoup plus grand que le volume racinaire souhaité. Placez le sol et la plante dans un récipient et placez-le sur une paillasse.
    REMARQUE: L’ensemble du sol en pot et de la plante provenant d’une étude en pot peut également être utilisé.
  2. Déterminer l’emplacement souhaité du sol où les racines doivent être prélevées (c.-à-d. la profondeur et la proximité de la pousse). Coupez l’excès de sol à l’aide d’une lame en acier, en prenant soin de ne pas déranger le sol dans la zone souhaitée. Lorsque la zone souhaitée est atteinte, coupez un « cube » de racine d’environ 3 cm x 3 cm x 2 cm et placez immédiatement le cube entre les deux entretoises sur le bloc de cuivre horizontal. À l’aide de gants cryogéniques, ramassez le bloc de cuivre vertical et placez-le sur les entretoises pour geler le cube de rhizosphère.
  3. Après que le bouillonnement se soit calmé (~ 5 min), récupérez le cube de rhizosphère congelé par slam des blocs de cuivre et enveloppez-le à l’intérieur d’un carré de feuille d’aluminium pré-étiqueté. Marquez l’orientation du bloc sur la feuille si vous le souhaitez. Placer dans un deuxième récipient d’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit stocké dans un congélateur à -80 °C.
  4. Répétez l’opération au besoin pour obtenir le nombre souhaité de cubes racines à partir du site de terrain ou de l’expérience. Assurez-vous que les deux blocs de cuivre ont le temps de refroidir entre les échantillons.

3. Lyophilisation et incorporation de cubes de rhizosphère

  1. Préparez le lyophilisateur conformément aux instructions du fabricant. Veillez à ce qu’il ait obtenu la pression et la température de vide appropriées avant de retirer les échantillons du congélateur à -80 °C.
  2. Lorsque le lyophilisateur est prêt à recevoir des échantillons, placez un cube de rhizosphère congelé à l’intérieur d’un tube de 50 mL propre et lavé à l’acide et couvrez-le lâchement avec une lingette jetable propre. Fixez la lingette avec un élastique. Répétez l’opération au besoin pour vous assurer qu’un cube par tube.
    REMARQUE: Si l’échantillon est trop grand pour un tube, il peut être placé directement dans le récipient de lyophilisation en utilisant le papier d’aluminium comme porte-échantillon.
  3. Placer les tubes contenant des échantillons dans des récipients lyophilisateurs et les congeler pendant plusieurs jours. Le temps de séchage exact dépendra des propriétés du sol.
    REMARQUE: Conservez les échantillons séchés dans le lyophilisateur ou un dessiccateur pour éviter la réhydratation.
  4. Utilisez une lame en acier pour couper les cubes de sol séchés à la taille afin qu’ils s’adaptent à la forme souhaitée (par exemple, la forme de 25 mm de diamètre est idéale pour la plupart des applications). Étiquetez chaque forme, placez les cubes de sol dans les formes et placez les formes à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide.
  5. Préparez l’époxy selon les instructions du fabricant. S’assurer que l’époxy choisi n’est pas contaminé et ne provoque pas de changements de spéciation des éléments souhaités 20,29,30.
  6. Utilisez un compte-gouttes pour ajouter de l’époxy à la forme d’un côté du sol, jusqu’à ce qu’il recouvre entièrement l’échantillon. Le sol s’assombrit en couleur à mesure que l’époxy mouille le sol.
    REMARQUE: Ajouter l’époxy lentement pour permettre à l’air dans le sol de s’échapper.
  7. Une fois les formulaires remplis d’époxy, fermez le dessiccateur à vide et allumez le vide. Selon la quantité d’air emprisonnée dans le sol, il peut être nécessaire d’ajouter périodiquement plus d’époxy aux formes. Vérifiez le niveau d’époxy toutes les 30-90 minutes pendant les 1-4 premières heures et ajoutez de l’époxy au besoin.
  8. Retirez l’échantillon de la forme une fois que l’époxy a durci (~ 5 jours).

4. Découpe et sectionnement des cubes de rhizosphère

  1. Découpez l’échantillon à l’aide d’une scie humide de précision à lame diamantée. Coupez les échantillons à différents endroits si aucune racine n’est obtenue lors de la coupe précédente.
  2. Poncez manuellement les échantillons coupés avec du papier de verre progressivement plus fin (par exemple, 220, 500, 1000 et 1500 grains) sur le côté coupé pendant environ 30 s.
  3. Effectuez l’imagerie de surface des échantillons à l’aide de techniques telles que LA-ICP-MS.
    REMARQUE: Pour préparer des sections minces pour S-XRF, envoyez les échantillons à une entreprise capable de préparer les sections minces (polissage simple ou double face) ou suivez les étapes 4.4 à 4.6 décrites ci-dessous.
  4. Collez le côté de l’échantillon souhaité sur une lame de quartz à l’aide de super colle et laissez durcir pendant la nuit.
  5. À l’aide d’une fine machine à sectionnement, coupez le sol sur des lames jusqu’à 2 mm d’épaisseur, puis broyez jusqu’à l’épaisseur souhaitée (généralement 30 μm). La surface de l’échantillon peut être polie si vous le souhaitez.
  6. Effectuez l’imagerie S-XRF des sections. Suivez les étapes appropriées à l’installation synchrotron et à la ligne de faisceau souhaitées pour demander et utiliser le temps d’imagerie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cette méthode permet de préserver les racines et les espèces chimiques dans les racines et la rhizosphère des plantes des zones humides et dans le sol en vrac. Dans ce travail, la méthode a été utilisée pour évaluer la spéciation as et la co-localisation avec les oxydes de Fe et Mn et les nutriments des plantes dans la rhizosphère du riz (Oryza sativa L.). Le riz a été cultivé à l’installation RICE de l’Université du Delaware où 30 mésocosmes de rizières (2 m x 2 m, 49 plantes chacun) sont utilisés pour cultiver du riz dans diverses conditions de gestion du sol et de l’eau dans le but de réduire l’absorption d’As et de Cd dans les grains de riz. Cette expérience a fourni 1470 plantes individuelles à partir desquelles des rhizosphères ont pu être échantillonnées tout au long de la saison de croissance.

Avec un nombre suffisant d’échantillons, des sections minces ont pu capturer une variété de morphologies racinaires. La figure 1A montre plusieurs diamètres de racines présents dans la matrice du sol sous forme de sections transversales. Cependant, certaines sections de sol peuvent contenir peu de racines, voire aucune. Dans ce travail, 63 blocs de sol ont été traités et coupés une fois sur la scie humide pour déterminer quel sous-ensemble d’échantillons convenait à la coupe mince. Sur les 63 échantillons, 14 ne contenaient aucune racine, 31 contenaient 1 à 3 racines et 18 plus de 3 racines. Notez que les racines peuvent être présentes à différents niveaux de qualité. La figure 1B montre une racine bien conservée, une racine déformée par le processus de lyophilisation et une racine qui a été retirée pendant le processus de coupe mince.

Les sections minces des racines ont été analysées à l’aide de S-XRF pour cartographier l’emplacement des éléments d’intérêt. La figure 2B montre une section transversale de la racine avec une racine latérale en section longitudinale. La figure 2C montre cette section racine analysée par XRF avec un tracé tricolore de Fe, Mn et As. Le Fe est présent dans le sol et entourant la racine dans la plaque fe, et la plaque fe est également visible sur les images de micrographie lumineuse. Le manganèse est présent de manière unique dans le cortex de la racine latérale, mais co-localise également avec Fe dans certaines zones de la plaque Fe, apparaissant comme une teinte vert-bleu. L’arsenic était principalement présent dans le système vasculaire de la racine latérale, fusionnant dans le système vasculaire de la racine primaire.

L’imagerie de spéciation chimique a séparé les différentes espèces d’intérêt As en prenant des cartes XRF répétées à plusieurs énergies de faisceau incident et en utilisant une combinaison linéaire adaptée aux spectres As XANES standard. Les cartes de spéciation As sont montrées dans la figure 2D et montrent la variabilité dans la localisation des espèces As. La figure 2E montre les mêmes données qu’un graphique tricolore. Le tracé tricolore montre l’arsénite et l’arsénite glutathion étroitement associés dans le système vasculaire, tandis que l’arséniate est principalement situé à l’extérieur de la racine associée à la plaque Fe.

Figure 1
Figure 1 - Sections minces de racines de riz montrant une variété de résultats méthodologiques dans un sol limoneux limoneux (les barres d’échelle mesurent 0,5 mm). R) De nombreuses sections transversales de diamètre de racine différentes sont évidentes (dans des boîtes blanches). B)Les racines peuvent être endommagées pendant le processus. La racine dans la boîte blanche est restée intacte et circulaire, tandis que la racine dans la boîte orange a été comprimée pendant le processus de lyophilisation. La boîte rouge indique où une racine a été retirée pendant le processus de sectionnement fin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 - Section transversale d’une racine de riz avec une section longitudinale d’une racine latérale dans un sol limoneux limoneux. A) Section du sol montrant plusieurs sections transversales des racines dans des boîtes blanches. Les flèches blanches désignent les sections longitudinales. La barre d’échelle est de 2 mm. B) Section du sol montrant la racine du coin supérieur gauche du panneau A. Le rectangle blanc indique la zone imagée par synchrotron XRF. La barre d’échelle est de 0,5 mm. C)Image XRF tricolore de l’arsenic (rouge), du fer (vert) et du manganèse (bleu). L’échelle maximale de As, Fe et Mn est dans un rapport de 1:50:2,5. La barre d’échelle est de 100 μm. D) Cartes de spéciation XRF de l’arsenic pour l’arsénite glutathion, l’arsénite et l’arséniate, où les couleurs plus chaudes indiquent des concentrations plus élevées de As. La barre d’échelle est de 100 μm. E) Graphique tricolore de l’espèce As, où l’intensité maximale est mise à l’échelle à l’arsénite (rouge) = arséniate (vert) = 0,5 arsénite glutathion (bleu). La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cet article décrit un protocole pour obtenir un sol en vrac préservé + rhizosphères de racines de plantes de zones humides en utilisant une technique de congélation slam qui peut être utilisée pour l’imagerie élémentaire et / ou la cartographie de la spéciation chimique.

Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes. Tout d’abord, cette méthode permet l’étude simultanée des racines et des rhizosphères environnantes. Il existe actuellement des méthodes pour préserver et imager chimiquement les racines de leur environnement pédologique en lavant le sol et en préservant les racines31,32 ou en cultivant des plantes dans des environnements artificiels (par exemple, des rhizoboxes) et en utilisant des méthodes DGT pour examiner les interactions racine-sol24,33,34 mais sans la capacité d’observer la racine elle-même. La méthode décrite ici permet l’étude directe de la racine et du sol de la rhizosphère environnante in situ pour l’observation des relations racine-sol. Une technique similaire a été utilisée pour examiner les racines de riz in situ et la rhizosphère environnante, mais en plongeant l’échantillon dans l’azote liquide11,35,36 plutôt que la congélation slam décrite ici. Plus les tissus sont congelés rapidement, moins ils sont susceptibles de former des cristaux de glace37. La congélation entre les blocs de cuivre pré-refroidis refroidis refroidit rapidement l’échantillon et minimise donc la formation de cristaux de glace et les dommages ultérieurs aux tissus végétaux qui peuvent survenir avec la congélation éclair à l’aide d’azote liquide à des températures ambiantes11,38. En utilisant la méthode décrite ici, plusieurs échantillons peuvent être prélevés sur la même plante, plusieurs plantes d’un champ et / ou de l’environnement dans un laps de temps relativement court. Une fois obtenus, de nombreux échantillons peuvent être lyophilisés, incorporés dans de l’époxy et coupés avec une scie humide à lame de diamant à un coût minimal. Ces échantillons peuvent ensuite être étudiés au microscope optique pour identifier des échantillons prometteurs qui peuvent être directement imagés (par exemple, LA-ICP-MS) ou traités ultérieurement pour la section mince et l’imagerie sXRF. Une section mince peut capturer plusieurs racines de différentes tailles sur la même diapositive, ce qui permet de capturer la rhizosphère hétérogène et de maximiser le temps d’imagerie sur l’instrument. Cette méthode peut également être utilisée pour observer directement les relations plantes-sol telles que la séquestration as dans les plaques de Fe sans perturber la rhizosphère. Les méthodes existantes pour induire la formation de plaque de Fe sur les racines des zones humides comme le riz en utilisant des expériences hydroponiques39,40,41 ne parviennent pas à capturer l’hétérogénéité de la plaque de Fe en termes de couverture racinaire et de composition minérale qui se produit dans les plantes cultivées dans le sol11,18,20, 42,43,44.

Pour que la méthode réussisse, il est essentiel de suivre quelques étapes clés. Tout d’abord, assurez-vous que l’emplacement et l’orientation de l’échantillon sélectionnés répondent à la question souhaitée. Deuxièmement, utilisez un époxy exempt de contamination par oligo-éléments et dont il a été démontré qu’il préserve la spéciation chimique des éléments As d’intérêt20,29,30. Troisièmement, ajoutez de l’époxy lentement et placez l’échantillon dans de l’époxy sous vide pour faciliter le mouillage époxy de l’échantillon et l’élimination du gaz piégé. En suivant ces étapes, vous fournirez un échantillon de haute qualité de sol en vrac, de rhizosphère et de racines pouvant être utilisé pour l’analyse d’images.

Plusieurs limites de la méthode doivent être prises en compte. Tout d’abord, le séchage de l’échantillon congelé sur un lyophilisateur peut provoquer une déformation du sol, ce qui peut affecter les racines. Cela risque d’être particulièrement difficile dans les sols à forte teneur en argile et donc à propension à l’effondrement à mesure que les argiles sèchent. À titre d’exemple, un échantillon de rhizosphère de riz obtenu à partir d’une argile limoneuse a été préparé et une fissuration du sol est apparente alors que la racine de riz enduite de plaque de Fe n’est pas affectée(figure 3).

Figure 3
Graphique 3   - Section mince de racine de riz d’un sol de paddy argileux limoneux. De nombreuses fissures dans le sol se sont produites lors de la lyophilisation, mais ces fissures n’ont pas déformé la section longitudinale latérale de la racine, représentée par le rectangle blanc. La barre d’échelle est de 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Les données montrent que cette technique peut obtenir avec succès des informations à l’échelle du micron dans un limon limoneux (Figures 2, 3), et il est probable que la technique puisse réussir dans des sols texturés plus grossiers; cependant, les sols à teneur plus élevée en argile peuvent poser des défis et devraient faire l’objet d’études plus approfondies. Deuxièmement, les racines peuvent être arrachées du sol lors du sectionnement. Ce défi n’est pas propre au protocole décrit dans le présent document, mais devrait être pris en considération. Troisièmement, les racines peuvent ne pas être présentes dans tous les cubes de sol, de sorte que de nombreux échantillons doivent être obtenus et coupés pour capturer la rhizosphère de la plante souhaitée. Quatrièmement, la méthode de conservation nécessite de l’azote liquide, ce qui pourrait poser des défis pour les études sur le terrain à distance. Ici, le protocole a été utilisé avec succès sur le terrain, qui était à moins de 2 miles d’un Dewar à l’azote liquide. Toutefois, si l’azote liquide n’est pas disponible à une courte distance en voiture d’un site de terrain éloigné, plusieurs options existent pour obtenir l’échantillon. Cela comprend l’utilisation d’une autre source pour refroidir les blocs de cuivre ou l’excavation de l’ensemble de la plante et du sol environnant avec un grand anneau en PVC, le placer dans un matériau imperméable aux gaz et le transporter vers la source d’azote liquide la plus proche pour la conservation. Pour cela, il est important de s’assurer que la pousse de la plante n’est pas coupée de ses racines avant d’obtenir l’échantillon de rhizosphère. Si nécessaire, l’échantillon peut également être placé au réfrigérateur et expédié pendant la nuit au laboratoire pour conservation. Une fois reçues en laboratoire, les sections peuvent ensuite être conservées à l’aide de blocs de cuivre refroidis à l’azote liquide. Enfin, des changements de spéciation sont possibles avec n’importe quelle méthode de préservation des sols et des rhizosphères des zones humides. Pour éviter cela, les échantillons doivent être prélevés et congelés rapidement ou d’autres mesures doivent être prises comme ci-dessus pour éviter l’exposition à l’oxygène. Les bords des échantillons lyophilisés peuvent ensuite être rasés pour éviter les bords qui auraient pu être plus exposés à l’oxygène. La préservation d’espèces d’arsenic réduites dans les échantillons de racines et de rhizosphères ici(Figure 1D, E) et dans des travaux antérieurs28 suggère que cette technique de congélation par claque est capable de préserver les espèces chimiques sensibles à l’oxygène si elle est soigneusement effectuée.

Cette méthode peut être utilisée pour répondre à plusieurs questions clés de la science de la rhizosphère. Il s’agit notamment d’applications liées à l’étude des interactions entre les nutriments et les contaminants dans la rhizosphère, qui peuvent inclure des interactions de contaminants et de nutriments avec des plaques de Fe ou de Mn. La méthode permet d’étudier l’hétérogénéité temporelle et spatiale des relations plantes-sols et d’examiner comment les morphologies racinaires interagissent in situ avec les éléments de la rhizosphère. Il peut être utilisé dans des applications liées à la sécurité alimentaire telles que la compréhension de l’absorption d’arsenic par le riz, la dynamique des nutriments dans la rhizosphère ou des applications liées à la phytoremedation telles que l’absorption de métaux dans les plantes des zones humides.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent une subvention de démarrage conjointe à Seyfferth et Tappero pour soutenir la collaboration entre l’Université du Delaware et le Brookhaven National Laboratory. Certaines parties de cette recherche ont utilisé la ligne de faisceau XFM (4-BM) de la National Synchrotron Light Source II, une installation d’utilisateurs du Bureau des sciences du département de l’Énergie des États-Unis (DOE) exploitée pour le Bureau des sciences du DOE par le Brookhaven National Laboratory en vertu du contrat no. DE-SC0012704.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Copper blocks McMaster Carr 89275K42
Diamond blade Buehler 15 LC, 102 mm x 0.3 mm operation speed: 225 rpm
Epoxy forms Struers 40300085 FixiForm
Epoxy Epotek 301-2FL
Superglue Loctite 404
Thin sectioning machine Buehler PetroThin
Wet saw Buehler IsoMet 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
  2. McNear, D. H. The rhizosphere - roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
  5. Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
  6. Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
  7. Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
  8. Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
  9. Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
  10. Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
  11. Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
  12. Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
  13. Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
  14. vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
  15. Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  16. Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
  17. Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
  18. Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
  19. Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
  20. Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
  21. Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
  22. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
  23. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  24. Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  25. Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
  26. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  27. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
  28. Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
  29. Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
  30. Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
  31. Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
  32. Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
  33. Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
  34. Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
  35. Voegelin, A., Weber, F. -A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
  36. Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
  37. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  38. Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
  39. Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
  40. Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
  41. Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
  42. Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
  43. Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
  44. Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).

Tags

Sciences de l’environnement numéro 168 congélation slam lyophilisation cartographie de la spéciation fluorescence X LA-ICP-MS plaque racinaire
Une méthode pour préserver les racines et les rhizosphères des zones humides pour l’imagerie élémentaire
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A.,… More

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A., Tappero, R. A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62227, doi:10.3791/62227 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter