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Eine Methode zur Erhaltung von Feuchtgebietswurzeln und Rhizosphären für die Elementarbildgebung

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62227
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Plant and Soil Sciences, University of Delaware, 2National Synchrotron Radiation Lightsource-II, Brookhaven National Laboratory

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Probenahme, Erhaltung und Sektionierung intakter Wurzeln und des umgebenden Rhizosphärenbodens aus Feuchtgebieten unter Verwendung von Reis(Oryza sativa L.) als Modellart. Nach der Konservierung kann die Probe mit elementaren bildgebungstechnischen Verfahren wie der chemischen Synchrotron-Röntgenfluoreszenz (RFA) analysiert werden.

Abstract

Wurzeln interagieren intensiv mit ihrer Bodenumgebung, aber die Visualisierung solcher Wechselwirkungen zwischen Wurzeln und der umgebenden Rhizosphäre ist eine Herausforderung. Die Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen ist aufgrund steiler Sauerstoffgradienten von den Wurzeln zum Massenboden besonders schwierig einzufangen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die Wurzelstruktur und Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen durch Slam-Freezing und Gefriertrocknung effektiv bewahrt. Slam-Freezing, bei dem die Probe zwischen Kupferblöcken eingefroren wird, die mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt sind, minimiert Wurzelschäden und Probenverzerrungen, die beim Schockgefrieren auftreten können, während gleichzeitig chemische Artbildungsänderungen minimiert werden. Während Probenverzerrungen immer noch möglich sind, erhöht die Fähigkeit, mehrere Proben schnell und mit minimalen Kosten zu erhalten, das Potenzial, zufriedenstellende Proben zu erhalten, und optimiert die Bildgebungszeit. Die Daten zeigen, dass diese Methode erfolgreich ist, um reduzierte Arsenarten in Reiswurzeln und Rhizosphären, die mit Eisenplaques assoziiert sind, zu erhalten. Diese Methode kann für Studien von Pflanzen-Boden-Beziehungen in einer Vielzahl von Feuchtgebieten eingesetzt werden, die Konzentrationsbereiche vom Spurenelementkreislauf bis hin zu Phytoremediationsanwendungen umfassen.

Introduction

Wurzeln und ihre Rhizosphären sind dynamisch, heterogen und von entscheidender Bedeutung für das Verständnis, wie Pflanzen mineralische Nährstoffe und Verunreinigungen erhalten1,2,3. Wurzeln sind der primäre Weg, über den Nährstoffe (z. B. Phosphor) und Verunreinigungen (z. B. Arsen) vom Boden zu den Pflanzen gelangen, und daher hat das Verständnis dieses Prozesses Auswirkungen auf die Quantität und Qualität der Nahrung, die Funktionsweise des Ökosystems und die Phytoremediation. Wurzeln sind jedoch in Raum und Zeit dynamisch und wachsen als Reaktion auf den Nährstoffaufnahmebedarf und variieren oft in Funktion, Durchmesser und Struktur (z. B. Seitenwurzeln, zufällige Wurzeln, Wurzelhaare)2. Die Heterogenität von Wurzelsystemen kann auf räumlichen Skalen von zellulärer bis Ökosystemebene und auf zeitlichen Skalen von stündlich bis dekadisch untersucht werden. Daher stellt die dynamische und heterogene Natur der Wurzeln und ihres umgebenden Bodens oder der Rhizosphäre eine Herausforderung für die Erfassung der Rhizosphärenchemie im Laufe der Zeit dar. Trotz dieser Herausforderung ist es unerlässlich, Wurzeln in ihrer Bodenumgebung zu untersuchen, um diese kritische Pflanzen-Boden-Beziehung zu charakterisieren.

Die Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen ist aufgrund steiler Sauerstoffgradienten, die vom Massenboden bis zu den Wurzeln bestehen und sich räumisch und zeitweise verändern, besonders schwierig zu untersuchen. Da Wurzeln Sauerstoff zum Atmen benötigen, haben sich Feuchtgebietspflanzen an die sauerstoffarmen Bedingungen von Feuchtgebieten angepasst, indem sie Aerenchym4,5geschaffen haben. Aerenchyme sind ausgehöhlte kortikale Gewebe, die sich von Trieben bis zu Wurzeln erstrecken und die Diffusion von Luft durch die Pflanze in die Wurzeln ermöglichen. Ein Teil dieser Luft tritt jedoch in weniger suberisierten Teilen der Wurzeln in die Rhizosphäre aus, insbesondere in der Nähe von seitlichen Wurzelverbindungen, weniger reifen Wurzelspitzen und Dehnungszonen6,7,8,9. Dieser radiale Sauerstoffverlust erzeugt eine oxidierte Zone in der Rhizosphäre von Feuchtgebietspflanzen, die die Rhizosphäre (Bio-Geo)Chemie beeinflusst und sich von dem reduzierten Massenboden10,11,12unterscheidet. Um das Schicksal und den Transport von Nährstoffen und Schadstoffen in Feuchtgebietsrhizosphären und -wurzeln zu verstehen, ist es wichtig, den chemisch reduzierten Massenboden, die oxidierte Rhizosphäre und die Wurzeln von Feuchtgebietspflanzen für die Analyse zu erhalten. Da der Massenboden jedoch reduzierte Bodenbestandteile enthält, die sauerstoffempfindlich sind, müssen Wurzel- und Bodenerhaltungsmethoden Wurzelstrukturen erhalten und sauerstoffempfindliche Reaktionen minimieren.

Es gibt Methoden, um Pflanzengewebe zu fixieren und die Ultrastruktur für die Bildgebung zu erhalten, aber diese Methoden können nicht angewendet werden, um Wurzeln, die in Feuchtgebieten wachsen, chemisch zu erhalten. Für Untersuchungen, bei denen nur die Elementverteilung innerhalb von Pflanzenzellen erwünscht ist, werden Pflanzen typischerweise hydroponisch gezüchtet und Wurzeln können leicht aus der Lösung entfernt, unter Hochdruckgefrier- und Gefriersubstitution fixiert und für eine Vielzahl von bildgebenden Anwendungen unterteilt werden, einschließlich hochauflösender Sekundärionen-Massenspektrometrie (NanoSIMS), Elektronenmikroskopie und Synchrotron-Röntgenfluoreszenzanalyse (S-RFA)13. 14,15. Um Fe-Plaque an der Außenseite von Feuchtgebietswurzeln zu untersuchen, müssen diese hydroponischen Studien die Fe-Plaque-Bildung in Lösung16künstlich induzieren, was die Heterogenität der Verteilung und Mineralzusammensetzung der Fe-Plaque-Bildung und der zugehörigen Elemente in situ nicht genau darstellt17,18,19,20. Es gibt Methoden, um Feuchtgebiete und zugehörige Mikroorganismen mit Gefrierkernung21zu erhalten, aber es ist schwierig, mit dieser Technik Wurzeln zu erhalten. Aktuelle Methoden zur Visualisierung von Wurzeln, die im Boden wachsen, und ihre rhizosphärische Chemie bestehen aus zwei primären Messtypen: Elementflussen und Gesamtelementkonzentration (und Artbildung). Ersteres wird typischerweise mit diffusiven Gradienten in dünnen Schichten (DGT)22,23,24)gemessen,in denen Erde in Rhizoboxen gelegt wird, um das Pflanzenwachstum in einer Laborumgebung zu unterstützen, und labile Elemente im Boden durch ein Gel in eine Bindungsschicht diffundieren. Diese Bindungsschicht kann dann abgebildet werden, um die labilen Elemente von Interesse zu quantifizieren. Diese Technik kann erfolgreich Beziehungen zwischen Wurzeln und der Rhizosphäre24,25,26,27veranschaulichen, aber Artefakte aus der Wurzelbindung können durch das Wachstum von Pflanzen in Rhizoboxen existieren, und Informationen über das Wurzelinnere werden mit DGT nicht erfasst. Letzteres beinhaltet die Probenahme der Wurzeln und der Rhizosphäre, die Konservierung der Probe und die direkte Analyse der Elementverteilung auf einem Probenabschnitt. Für diese Umweltprobenahme von Feuchtgebietspflanzenwurzeln und ihrer umgebenden Rhizosphäre ist ein sorgfältiger Probenhandling erforderlich, um Artefakte aus der Probenvorbereitung zu vermeiden.

Hier wird ein Protokoll beschrieben, das Wurzelstrukturen und Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen durch Slam-Freezing und Gefriertrocknung effektiv erhält. Das Schockgefrieren kann die Umwandlung sauerstoffempfindlicher gelöster Stoffe drastisch verlangsamen, kann jedoch die Wurzeln schädigen und eine Mobilisierung verursachen, wenn die Proben austrocknen. Das Slam-Freezing, bei dem die Probe zwischen kupfergekühlten, mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Kupferblöcken eingefroren wird, minimiert jedoch Wurzelschäden und Probenverzerrungen28. Die konservierten Proben werden dann in ein Epoxidharz eingebettet, das die Artbildung20,29 konserviert und für die Abbildung von Wurzeln in ihrem Rhizosphärenboden geschnitten und poliert werden kann. Die Proben in diesem Bericht wurden mittels S-RFA-Bildgebung der chemischen Artbildung nach Dünnschnitt analysiert. Es könnten jedoch auch andere bildgebende Verfahren verwendet werden, darunter Laserablations-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS), partikelinduzierte Röntgenemission (PIXE), Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS) und laserinduzierte Durchbruchsspektroskopie (LIBS).

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Protocol

1. Herstellung von Slam-Freezing-Geräten

  1. Legen Sie zwei Kupferblöcke (~ 5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontal in einen sauberen Kühler, der flüssigen Stickstoff halten kann, und gießen Sie genug flüssigen Stickstoff, um die Blöcke unterzutauchen. Sobald das Sprudeln nachlässt, platzieren Sie zwei Abstandshalter auf einem Kupferblock an jedem Ende.
    HINWEIS: Die Abstandhalterhöhe bestimmt die Höhe der einzufrierenden Probe. In diesem Beispiel wird ein Abstandshalter von 2 cm verwendet, um Würfel von ca. 3 cm x 3 cm x 2 cm zu erstellen. Das Volumen des flüssigen Stickstoffs hängt von der Kühlergröße ab. In diesem Beispiel wird ungefähr 1 L für ca. 5 Würfel in Reihe verwendet.
    VORSICHT: Verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung und Belüftung, da flüssiger Stickstoff ein Kryogen und ein Erstickungsmittel ist.
  2. Stellen Sie mit einer Zange und kryogenen Handschuhen den anderen Kupferblock an seinem Ende auf, um die Entnahme zu erleichtern, wenn die Probe an Ort und Stelle ist.

2. Probenentnahme und Slam-Freezing

  1. Extrahieren Sie die gewünschte Pflanze und Rhizosphäre mit einer Schaufel aus dem nassen Boden und stellen Sie sicher, dass das gegrabene Loch viel größer ist als das gewünschte Wurzelvolumen. Legen Sie den Boden und die Pflanze in einen Behälter und legen Sie ihn auf eine Tischplatte.
    HINWEIS: Die gesamte Topferde und Pflanze aus einer Topfstudie kann ebenfalls verwendet werden.
  2. Bestimmen Sie die gewünschte Bodenposition, an der Wurzeln genommen werden sollen (d.h. Tiefe und Nähe zum Trieb). Schneiden Sie überschüssigen Boden mit einer Stahlklinge weg und achten Sie darauf, den Boden im gewünschten Bereich nicht zu stören. Wenn der gewünschte Bereich erreicht ist, schneiden Sie einen Wurzelwürfel ca. 3 cm x 3 cm x 2 cm und legen Sie den Würfel sofort zwischen den beiden Abstandshaltern auf den horizontalen Kupferblock. Nehmen Sie mit kryogenen Handschuhen den vertikalen Kupferblock auf und legen Sie ihn auf die Abstandshalter, um den Rhizosphärenwürfel einzufrieren.
  3. Nachdem das Sprudeln nachgelassen hat (~ 5 min), holen Sie den slam-gefrorenen Rhizosphärenwürfel aus den Kupferblöcken und wickeln Sie ihn in ein vorbeschriftetes Aluminiumfolienquadrat. Markieren Sie bei Bedarf die Ausrichtung des Blocks auf der Folie. In einen zweiten Behälter mit flüssigem Stickstoff geben, bis er in einem Gefrierschrank mit -80 °C gelagert wird.
  4. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, um die gewünschte Anzahl von Stammwürfeln von der Feldseite oder dem Experiment zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass beide Kupferblöcke Zeit zum Abkühlen zwischen den Proben haben.

3. Gefriertrocknung und Einbettung von Rhizosphärenwürfeln

  1. Bereiten Sie den Gefriertrockner gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Achten Sie darauf, dass der richtige Vakuumdruck und die richtige Temperatur erreicht wurden, bevor Sie Proben aus dem -80 °C-Gefrierschrank entfernen.
  2. Wenn der Gefriertrockner bereit ist, Proben zu empfangen, legen Sie einen gefrorenen Rhizosphärenwürfel in ein sauberes und säuregewaschenes 50-ml-Röhrchen und decken Sie es lose mit einem sauberen Einwegtuch ab. Befestmen Sie das Tuch mit einem Gummiband. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, um sicherzustellen, dass ein Würfel pro Tube Würfel aussteht.
    HINWEIS: Wenn die Probe zu groß für ein Röhrchen ist, kann sie mit der Aluminiumfolie als Probenhalter direkt in das Gefriertrocknergefäß gegeben werden.
  3. Röhrchen mit Proben in Gefriertrocknerbehälter legen und mehrere Tage gefriertrocken. Die genaue Trocknungszeit hängt von den Bodeneigenschaften ab.
    HINWEIS: Lagern Sie getrocknete Proben im Gefriertrockner oder in einem Trockenmittel, um eine Rehydratation zu vermeiden.
  4. Verwenden Sie eine Stahlklinge, um getrocknete Bodenwürfel so zu schneiden, dass sie in die gewünschte Form passen (z. B. ist die Form mit einem Durchmesser von 25 mm ideal für die meisten Anwendungen). Beschriften Sie jede Form, legen Sie die Bodenwürfel in die Formen und legen Sie die Formen in einen Vakuumaustrocknungsmittel.
  5. Bereiten Sie Epoxidharz gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Stellen Sie sicher, dass das gewählte Epoxid nicht mit den gewünschten Elementen 20 , 29,30kontaminiert ist und keine Artbildungsänderungen verursacht.
  6. Verwenden Sie einen Tropfer, um Epoxidharz in die Form auf einer Seite des Bodens hinzuzufügen, bis sie die Probe vollständig bedeckt. Der Boden verdunkelt sich in der Farbe, wenn das Epoxid den Boden benetzt.
    HINWEIS: Fügen Sie das Epoxid langsam hinzu, damit die Luft im Boden entweichen kann.
  7. Sobald die Formulare mit Epoxidharz gefüllt sind, schließen Sie den Vakuumaussauger und schalten Sie das Vakuum ein. Abhängig von der Im Boden eingeschlossenen Luftmenge muss den Formen möglicherweise regelmäßig mehr Epoxidharz zugesetzt werden. Überprüfen Sie den Epoxidgehalt alle 30-90 Minuten für die ersten 1-4 h und fügen Sie Epoxid nach Bedarf hinzu.
  8. Entfernen Sie die Probe aus der Form, sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist (~ 5 Tage).

4. Schneiden und Schneiden der Rhizosphärenwürfel

  1. Schneiden Sie die Probe mit einer Diamantklingen-Präzisions-Nasssäge. Schneiden Sie die Proben an verschiedenen Stellen, wenn im vorherigen Schnitt keine Wurzeln erhalten wurden.
  2. Schleifen Sie die geschnittenen Proben manuell mit zunehmend feinerem Schleifpapier (z. B. 220, 500, 1000 und 1500 Körnung) auf der Schnittseite für ~ 30 s.
  3. Führen Sie Oberflächenbildgebung der Proben mit Techniken wie LA-ICP-MS durch.
    HINWEIS: Um dünne Profile für S-RFA vorzubereiten, senden Sie die Proben entweder an ein Unternehmen, das in der Lage ist, die dünnen Abschnitte vorzubereiten (ein- oder doppelseitiges Polieren) oder befolgen Sie die Schritte 4.4 - 4.6 wie unten beschrieben.
  4. Die gewünschte Probenseite mit Sekundenkleber auf einen Quarzschlitten kleben und über Nacht aushärten lassen.
  5. Schneiden Sie mit einer Dünnschnittmaschine Erde auf Schlitten auf einer Dicke von 2 mm und schleifen Sie sie dann auf die gewünschte Dicke (typischerweise 30 μm). Die Probenoberfläche kann auf Wunsch poliert werden.
  6. Führen Sie eine S-RFA-Bildgebung der Schnitte durch. Befolgen Sie die entsprechenden Schritte in der gewünschten Synchrotronanlage und Beamline, um die Bildgebungszeit zu beantragen und zu nutzen.

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Representative Results

Diese Methode ermöglicht die Erhaltung von Wurzeln und chemischen Arten in den Wurzeln und der Rhizosphäre von Feuchtgebietspflanzen und im Massenboden. In dieser Arbeit wurde die Methode verwendet, um As-Artbildung und Co-Lokalisation mit Fe- und Mn-Oxiden und Pflanzennährstoffen in der Rhizosphäre von Reis(Oryza sativa L.) zu bewerten. Reis wurde in der RICE-Anlage an der University of Delaware angebaut, wo 30 Reisfeld-Mesokosmen (2 m x 2 m, jeweils 49 Pflanzen) verwendet werden, um Reis unter verschiedenen Boden- und Wassermanagementbedingungen anzubauen, mit dem Ziel, die Aufnahme von As und Cd in Reiskorn zu senken. Dieses Experiment lieferte 1470 einzelne Pflanzen, aus denen während der gesamten Vegetationsperiode Rhizosphären entnommen werden konnten.

Bei ausreichender Anzahl von Proben konnten dünne Schnitte eine Vielzahl von Wurzelmorphologien erfassen. Abbildung 1A zeigt mehrere Wurzeldurchmesser, die innerhalb der Bodenmatrix als Querschnitte vorhanden sind. Einige Bodenabschnitte können jedoch nur wenige, wenn überhaupt, Wurzeln enthalten. Bei dieser Arbeit wurden 63 Bodenblöcke verarbeitet und einmal auf der Nasssäge geschnitten, um festzustellen, welche Teilmenge von Proben für den Dünnschnitt geeignet war. Von den 63 Proben enthielten 14 keine Wurzeln, 31 enthielten 1-3 Wurzeln und 18 enthielten mehr als 3 Wurzeln. Beachten Sie, dass die Wurzeln in unterschiedlicher Qualität vorhanden sein können. Abbildung 1B zeigt eine gut erhaltene Wurzel, eine durch den Gefriertrocknungsprozess verzerrte Wurzel und eine Wurzel, die während des Dünnschnittprozesses herausgezogen wurde.

Wurzeldünne Schnitte wurden mit S-RFA analysiert, um die Position von Elementen von Interesse abzubilden. Abbildung 2B zeigt einen Wurzeltransversalschnitt mit einer seitlichen Wurzel im Längsschnitt. Abbildung 2C zeigt diesen von RFA analysierten Wurzelabschnitt mit einem dreifarbigen Diagramm von Fe, Mn und As. Das Fe ist im Boden vorhanden und umgibt die Wurzel in der Fe-Plaque, und Fe-Plaque ist auch auf den Lichtmikroskopischen Bildern sichtbar. Mangan ist einzigartig im Kortex der lateralen Wurzel vorhanden, kosiediert aber auch mit Fe in einigen Bereichen der Fe-Plaque und erscheint als grün-blauer Farbton. Arsen war hauptsächlich im Gefäßsystem der Seitenwurzel vorhanden und verschmolz mit dem Gefäßsystem der Primärwurzel.

Die chemische Spektrationsbildgebung trennte die verschiedenen As-Spezies von Interesse, indem wiederholte RFA-Karten bei mehreren einfallenden Strahlenergien und lineare Kombinationen verwendet wurden, die an die Standard-As XANES-Spektren passten. Die As-Artbildungskarten sind in Abbildung 2D dargestellt und zeigen die Variabilität in der Lokalisierung von As-Arten. Abbildung 2E zeigt die gleichen Daten wie ein dreifarbiges Diagramm. Das dreifarbige Diagramm zeigt Arsenit und Arseniterglutathion, die eng im Gefäßsystem verbunden sind, während sich Arsenat hauptsächlich an der Außenseite der Wurzel befindet, die mit Fe-Plaque verbunden ist.

Figure 1
Abbildung 1 - Reiswurzel-Dünnschnitte, die eine Vielzahl von methodischen Ergebnissen in einem schlammigen Lehmboden zeigen (Schuppenbalken sind 0,5 mm). A) Zahlreiche Verschiedene Wurzeldurchmesserquerschnitte sind erkennbar (in weißen Kästchen). B) Wurzeln können während des Prozesses beschädigt werden. Die Wurzel in der weißen Box ist intakt und kreisförmig geblieben, während die Wurzel in der orangefarbenen Box während des Gefriertrocknungsprozesses komprimiert wurde. Das rote Kästchen zeigt, wo während des Dünnschnitts eine Wurzel herausgezogen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 - Querausschnitt einer Reiswurzel mit einem Längsschnitt einer Seitenwurzel in einem schlammigen Lehmboden. A) Bodenabschnitt mit mehreren Wurzel quer durch abschnitte in weißen Kästen. Weiße Pfeile kennzeichnen Längsschnitte. Der Maßstabsbalken beträgt 2 mm. B) Bodenausschnitt mit Wurzel aus der oberen linken Ecke des Bedienfelds A. Weißes Rechteck bezeichnet den von Synchrotron RFA aufgenommenen Bereich. Der Maßstabsbalken beträgt 0,5 mm. C) Dreifarbiges RFA-Bild von Arsen (rot), Eisen (grün) und Mangan (blau). Die maximale Skala von As, Fe und Mn liegt im Verhältnis 1:50:2,5. Maßstabsbalken ist 100 μm. D) Arsen-RFA-Speziationskarten für Arsenitglutathion, Arsenit und Arsenat, wobei wärmere Farben höhere Konzentrationen von As anzeigen. Maßstabsbalken ist 100 μm. E) Dreifarbiges Diagramm von As-Arten, wobei die maximale Intensität auf Arsenit (rot) = Arsenat (grün) = 0,5 Arsenitglutathion (blau) skaliert wird. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Gewinnung von konserviertem Massenboden + Rhizosphären von Feuchtgebietspflanzenwurzeln mit einer Slam-Freezing-Technik, die für elementare Bildgebung und / oder chemische Artbildungskartierung verwendet werden kann.

Es gibt mehrere Vorteile dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden. Erstens ermöglicht diese Methode die gleichzeitige Untersuchung von Wurzeln und den umgebenden Rhizosphären. Derzeit gibt es Methoden, um Wurzeln aus ihrer Bodenumgebung zu erhalten und chemisch abbilden, indem der Boden weggespült und die Wurzeln31,32 erhalten werden oder indem Pflanzen in künstlichen Umgebungen (z. B. Rhizoboxen) wachsen und DGT-Methoden verwendet werden, um Wurzel-Boden-Wechselwirkungen zu untersuchen24,33,34, aber ohne die Fähigkeit, die Wurzel selbst zu beobachten. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die direkte Untersuchung der Wurzel und des umgebenden Rhizosphärenbodens in situ zur Beobachtung von Wurzel-Boden-Beziehungen. Eine ähnliche Technik wurde verwendet, um In-situ-Reiswurzeln und die umgebende Rhizosphäre zu untersuchen, jedoch mit Eintauchen der Probe in flüssigen Stickstoff11,35,36 anstelle des hier beschriebenen Slam-Freezings. Je schneller Gewebe eingefroren werden, desto unwahrscheinlicher ist es, dass sie Eiskristalle bilden37. Slam-Freezing zwischen vorgekühlten Kupferblöcken kühlt die Probe schnell ab und minimiert daher die Bildung von Eiskristallen und nachfolgende Schäden an Pflanzengewebe, die beim Schockgefrieren mit flüssigem Stickstoff bei Umgebungstemperaturen auftreten können11,38. Mit der hier beschriebenen Methode können in relativ kurzer Zeit mehrere Proben aus derselben Pflanze, mehrere Pflanzen von einem Feld und/oder der Umwelt entnommen werden. Einmal erhalten, können viele Proben gefriergetrocknet, in Epoxidharz eingebettet und mit einer Diamantklingen-Nasssäge mit minimalen Kosten geschnitten werden. Diese Proben können dann mit einem Lichtmikroskop untersucht werden, um vielversprechende Proben zu identifizieren, die direkt abgebildet (z. B. LA-ICP-MS) oder für dünnschnitt- und RFA-Bildgebung weiterverarbeitet werden können. Ein dünner Schnitt kann mehrere Wurzeln unterschiedlicher Größe auf demselben Objektträger erfassen, was dazu beiträgt, die heterogene Rhizosphäre zu erfassen und die Bildgebungszeit auf dem Instrument zu maximieren. Diese Methode kann auch verwendet werden, um Pflanzen-Boden-Beziehungen wie die As-Sequestrierung in Fe-Plaques direkt zu beobachten, ohne die Rhizosphäre zu stören. Bestehende Methoden zur Induktion der Fe-Plaquebildung an Feuchtgebietswurzeln wie Reis mit hydroponischen Experimenten39,40,41 können die Heterogenität der Fe-Plaque in Bezug auf Wurzelbedeckung und Mineralzusammensetzung, die in bodengewachsenen Pflanzenauftritt,nicht erfassen11,18,20,42,43,44.

Damit die Methode erfolgreich ist, ist es wichtig, einige wichtige Schritte zu befolgen. Stellen Sie zunächst sicher, dass der ausgewählte Probenort und die ausgewählte Ausrichtung die gewünschte Frage beantwortet. Zweitens, verwenden Sie ein Epoxidharz, das frei von Spurenelementkontamination ist und nachweislich die chemische Artbildung von As Elementen von Interessebewahrt 20,29,30. Drittens, fügen Sie Epoxid langsam hinzu und legen Sie die Probe in Epoxid unter Vakuum, um die Epoxidbenetzung der Probe und die Entfernung von eingefangenem Gas zu erleichtern. Wenn Sie diese Schritte ausführen, erhalten Sie eine qualitativ hochwertige Probe von Bulk-Boden, Rhizosphäre und Wurzeln, die für die Bildanalyse verwendet werden kann.

Mehrere Einschränkungen der Methode sollten berücksichtigt werden. Erstens kann das Trocknen der gefrorenen Probe auf einem Gefriertrockner zu einer Verformung des Bodens führen, die sich auf die Wurzeln auswirken kann. Besonders herausfordernd dürfte dies in Böden mit hohem Tongehalt und damit Kollapsneigung bei trockenem Ton sein. Als Beispiel wurde eine Reisrhizosphärenprobe aus einem schlammigen Ton hergestellt und Risse des Bodens sind sichtbar, während die Fe-Plaque-beschichtete Reiswurzel nicht betroffen ist (Abbildung 3).

Figure 3
Abbildung 3   - Reiswurzel dünner Abschnitt aus einem schlammigen Tonfeldboden. Während der Gefriertrocknung sind zahlreiche Risse im Boden aufgetreten, aber diese Risse haben den seitlichen Wurzelsehnenabschnitt, der durch das weiße Rechteck dargestellt wird, nicht verzerrt. Der Maßstabsbalken beträgt 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Daten zeigen, dass diese Technik erfolgreich Informationen im Mikrometerbereich in einem Schlufflehm erhalten kann (Abbildungen 2, 3), und es ist wahrscheinlich, dass die Technik in gröberen strukturierten Böden erfolgreich sein kann; Böden mit höherem Tongehalt können jedoch Herausforderungen darstellen und sollten weiter untersucht werden. Zweitens können Wurzeln beim Schneiden aus dem Boden gezogen werden. Diese Herausforderung besteht nicht nur in dem in diesem Dokument beschriebenen Protokoll, sondern sollte berücksichtigt werden. Drittens sind Wurzeln möglicherweise nicht in jedem Bodenwürfel vorhanden, so dass viele Proben gewonnen und geschnitten werden müssen, um die Rhizosphäre der gewünschten Pflanze zu erfassen. Viertens erfordert die Konservierungsmethode flüssigen Stickstoff, was für Entfernte feldexperimentelle Studien eine Herausforderung darstellen könnte. Hier wurde das Protokoll erfolgreich im Feld eingesetzt, das weniger als 2 Meilen von einem flüssigen Stickstoff Dewar entfernt war. Wenn jedoch flüssiger Stickstoff nicht innerhalb einer kurzen Fahrt von einem abgelegenen Feldstandort verfügbar ist, gibt es mehrere Möglichkeiten, die Probe zu erhalten. Dazu gehört die Verwendung einer anderen Quelle zur Kühlung der Kupferblöcke oder das Ausheben der gesamten Pflanze und des umgebenden Bodens mit einem großen PVC-Ring, das Einbringen in gasdurchlässiges Material und der Transport zur nächsten flüssigen Stickstoffquelle zur Konservierung. Dazu ist es wichtig sicherzustellen, dass der Pflanzentrieb nicht von seinen Wurzeln geschnitten wird, bevor die Rhizosphärenprobe erhalten wird. Bei Bedarf kann die Probe auch unter Kühlung gestellt und über Nacht zur Konservierung ins Labor geschickt werden. Nach dem Empfang im Labor können die Abschnitte dann mit flüssigstickstoffgekühlten Kupferblöcken konserviert werden. Schließlich sind Artbildungsänderungen mit jeder Konservierungsmethode von Feuchtgebieten und Rhizosphären möglich. Um dies zu vermeiden, müssen Proben entnommen und schnell eingefroren oder andere Maßnahmen wie oben beschrieben ergriffen werden, um eine Exposition gegenüber Sauerstoff zu vermeiden. Die Ränder gefriergetrockneter Proben können dann rasiert werden, um Kanten zu vermeiden, die möglicherweise einer höheren Sauerstoffbelastung ausgesetzt waren. Die Konservierung reduzierter Arsenspezies in den Wurzel- und Rhizosphärenproben hier (Abbildung 1D, E) und in früheren Arbeiten28 legt nahe, dass diese Slam-Freezing-Technik in der Lage ist, sauerstoffempfindliche chemische Spezies zu erhalten, wenn sie sorgfältig durchgeführt wird.

Diese Methode kann verwendet werden, um mehrere Schlüsselfragen in der Rhizosphärenforschung zu beantworten. Dazu gehören Anwendungen im Zusammenhang mit der Untersuchung von Nährstoff- und Schadstoffinteraktionen in der Rhizosphäre, die Wechselwirkungen von Verunreinigungen und Nährstoffen mit Fe- oder Mn-Plaques umfassen können. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der zeitlichen und räumlichen Heterogenität von Pflanzen-Boden-Beziehungen und die Untersuchung, wie Wurzelmorphologien mit Elementen in der Rhizosphäre in situ interagieren. Es kann in Anwendungen im Zusammenhang mit der Ernährungssicherheit verwendet werden, z. B. zum Verständnis der Arsenaufnahme durch Reis, der Nährstoffdynamik in der Rhizosphäre oder Anwendungen im Zusammenhang mit der Phytoremedierung wie der Aufnahme von Metall (Loid) in Feuchtgebietspflanzen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Die Autoren würdigen einen gemeinsamen Seed-Grant für Seyfferth und Tappero, um die Zusammenarbeit zwischen der University of Delaware und dem Brookhaven National Laboratory zu unterstützen. Teile dieser Forschung verwendeten die XFM (4-BM) Beamline der National Synchrotron Light Source II, einer U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science User Facility, die für das DOE Office of Science vom Brookhaven National Laboratory unter Vertragsnummer betrieben wird. DE-SC0012704.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Copper blocks McMaster Carr 89275K42
Diamond blade Buehler 15 LC, 102 mm x 0.3 mm operation speed: 225 rpm
Epoxy forms Struers 40300085 FixiForm
Epoxy Epotek 301-2FL
Superglue Loctite 404
Thin sectioning machine Buehler PetroThin
Wet saw Buehler IsoMet 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Eine Methode zur Erhaltung von Feuchtgebietswurzeln und Rhizosphären für die Elementarbildgebung
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Seyfferth, A. L., Limmer, M. A., Tappero, R. A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62227, doi:10.3791/62227 (2021).

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