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मौलिक इमेजिंग के लिए वेटलैंड रूट्स और राइजोस्फीयर को संरक्षित करने की एक विधि

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62227
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Plant and Soil Sciences, University of Delaware, 2National Synchrotron Radiation Lightsource-II, Brookhaven National Laboratory

Summary

हम एक मॉडल प्रजाति के रूप में चावल(Oryza sativa एल.) का उपयोग कर वेटलैंड वातावरण से नमूना, संरक्षण, और अनुभाग बरकरार जड़ों और आसपास के राइजोस्फीयर मिट्टी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक बार संरक्षित होने के बाद, नमूने का विश्लेषण मौलिक इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसे सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस (एक्सआरएफ) रासायनिक नमूना इमेजिंग।

Abstract

जड़ें बड़े पैमाने पर अपनी मिट्टी के वातावरण के साथ बातचीत करते हैं लेकिन जड़ों और आसपास के राइजोसस्फेयर के बीच ऐसी बातचीत की कल्पना करना चुनौतीपूर्ण है। वेटलैंड पौधों का राइजोस्पेयर रसायन विशेष रूप से जड़ों से थोक मिट्टी तक खड़ी ऑक्सीजन ढाल के कारण कब्जा करना चुनौतीपूर्ण है। यहां एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो स्लैम-फ्रीजिंग और फ्रीज सुखाने के माध्यम से वेटलैंड पौधों की जड़ संरचना और राइजोस्फेयर रसायन को प्रभावी ढंग से संरक्षित करता है। स्लैम-फ्रीजिंग, जहां नमूना तरल नाइट्रोजन के साथ पूर्व-ठंडा तांबे के ब्लॉकों के बीच जमे हुए है, जड़ क्षति और नमूना विरूपण को कम करता है जो फ्लैश-फ्रीजिंग के साथ हो सकता है, जबकि अभी भी रासायनिक विशिष्टता परिवर्तनों को कम करता है। जबकि नमूना विरूपण अभी भी संभव है, कई नमूनों को जल्दी से और न्यूनतम लागत के साथ प्राप्त करने की क्षमता संतोषजनक नमूने प्राप्त करने और इमेजिंग समय को अनुकूलित करने की क्षमता बढ़ाती है। आंकड़े बताते हैं कि यह विधि चावल की जड़ों और लोहे के सजीले टुकड़े से जुड़े राइजोस्फीयर में कम आर्सेनिक प्रजातियों के संरक्षण में सफल है। इस विधि को विभिन्न प्रकार के आर्द्रभूमि वातावरण में पौधे-मिट्टी संबंधों के अध्ययन के लिए अपनाया जा सकता है जो ट्रेस-एलिमेंट साइकिलिंग से लेकर फाइटोरेमेडिएशन अनुप्रयोगों तक एकाग्रता की अवधि है।

Introduction

जड़ें और उनके राइजोस्फेयर गतिशील, विषम और गंभीर रूप से यह समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि पौधे खनिज पोषक तत्वों और संदूषकों को कैसे प्राप्त करते हैं1,2,3। जड़ें प्राथमिक मार्ग हैं जिसके द्वारा पोषक तत्व (जैसे, फास्फोरस) और संदूषक (जैसे, आर्सेनिक) मिट्टी से पौधों की ओर जाते हैं और इस प्रकार इस प्रक्रिया को समझने से खाद्य मात्रा और गुणवत्ता, पारिस्थितिकी तंत्र के कामकाज और फाइटोरेमेडिएशन के निहितार्थ होते हैं। हालांकि, जड़ें पोषक तत्वों के अधिग्रहण की जरूरतों के जवाब में बढ़ते हुए अंतरिक्ष और समय में गतिशील होती हैं और वे अक्सर कार्य, व्यास और संरचना (जैसे, पार्श्व जड़ें, साहसिक जड़ें, रूट बाल)2में भिन्न होती हैं। रूट सिस्टम की विषमता का अध्ययन सेलुलर से पारिस्थितिकी तंत्र स्तर तक और लौकिक तराजू पर प्रति घंटा से दशकीय तक स्थानिक तराजू पर किया जा सकता है। इस प्रकार, जड़ों और उनके आसपास की मिट्टी, या राइजोसस्फीयर की गतिशील और विषम प्रकृति, समय के साथ राइजोस्फेयर रसायन पर कब्जा करने के लिए चुनौतियां बन गई है। इस चुनौती के बावजूद, इस महत्वपूर्ण पौधे-मिट्टी संबंधों की विशेषता के लिए उनकी मिट्टी के वातावरण में जड़ों का अध्ययन करना अनिवार्य है।

वेटलैंड पौधों की राइजोफेयर रसायन विशेष रूप से जांच करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि थोक मिट्टी से जड़ों तक मौजूद ऑक्सीजन ढाल, जो अंतरिक्ष और समय में बदलते हैं। क्योंकि जड़ों को फिर से उड़ने के लिए ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है, वेटलैंड के पौधों ने एरेन्चिमा4,5बनाकर आर्द्र भूमि मिट्टी की कम ऑक्सीजन स्थितियों के अनुकूल हो गए हैं। एरेन्चिमा कॉर्टिकल ऊतकों को खोखला कर दिया जाता है जो शूटिंग से जड़ों तक फैलते हैं, जिससे पौधे के माध्यम से हवा के प्रसार को जड़ों में ले जाया जाता है। हालांकि, इस हवा में से कुछ जड़ों के कम उप-र्णित भागों में राइजोस्पेयर में लीक हो जाते हैं, विशेष रूप से पार्श्व रूट जंक्शनों के पास, कम परिपक्व रूट टिप्स और विस्तार क्षेत्र6,7,8,9। यह रेडियल ऑक्सीजन लॉस वेटलैंड पौधों के राइजोसिस्फीयर में एक ऑक्सीकृत क्षेत्र बनाता है जो राइजोसिफेयर (बायो-जियो) रसायन विज्ञान को प्रभावित करता है और कम थोक मिट्टी10,11,12से अलग है। वेटलैंड राइजोस्फेयर और जड़ों में पोषक तत्वों और संदूषकों के भाग्य और परिवहन को समझने के लिए, विश्लेषण के लिए रासायनिक रूप से कम थोक मिट्टी, ऑक्सीकृत राइजोस्फीयर और आर्द्रभूमि पौधों की जड़ों को संरक्षित करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, क्योंकि थोक मिट्टी में कम मिट्टी के घटक होते हैं जो ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील होते हैं, जड़ और मिट्टी संरक्षण के तरीकों को जड़ संरचनाओं को संरक्षित करना चाहिए और ऑक्सीजन-संवेदनशील प्रतिक्रियाओं को कम करना चाहिए।

पौधों के ऊतकों को ठीक करने और इमेजिंग के लिए अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करने के लिए विधियां मौजूद हैं, लेकिन उन तरीकों को वेटलैंड मिट्टी में बढ़ती जड़ों को रासायनिक रूप से संरक्षित करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है। जांच के लिए जहां केवल संयंत्र कोशिकाओं के भीतर मौलिक वितरण वांछित है, पौधों को आम तौर पर हाइड्रोपोनिक रूप से उगाया जाता है और जड़ों को आसानी से समाधान से हटाया जा सकता है, उच्च दबाव ठंड के तहत तय किया जा सकता है और प्रतिस्थापन को फ्रीज किया जा सकता है और उच्च-संकल्प माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नैनोसिम्स), इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लूसेंस (एस-एक्सआरएफ) विश्लेषण13, विश्लेषण 13,सहित विभिन्न इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए अनुभागित किया जा सकता है 14,15. वेटलैंड की जड़ों के बाहर फे पट्टिका की जांच करने के लिए, इन हाइड्रोपोनिक अध्ययनों को कृत्रिम रूप से समाधान 16 में फे पट्टिका गठन को प्रेरित करना चाहिए, जो सीटू17,18,19,20में फे पट्टिका गठन और संबद्ध तत्वों के वितरण और खनिज संरचना की विषमता का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं करता है। वेटलैंड मिट्टी और जुड़े सूक्ष्मजीवों को फ्रीज-स्कोरिंग21के साथ संरक्षित करने के लिए विधियां मौजूद हैं, लेकिन इस तकनीक के साथ जड़ें प्राप्त करना मुश्किल है। मिट्टी और उनके राइजोस्फेरिक रसायन में बढ़ती जड़ों की कल्पना करने के लिए वर्तमान तरीकों में दो प्राथमिक माप प्रकार होते हैं: मौलिक प्रवाह और कुल मौलिक एकाग्रता (और विशिष्टता)। पूर्व को आम तौर पर पतली फिल्मों (डीजीटी)22, 23, 24में डिफ्यूरिव ग्रेडिएंट का उपयोग करके मापाजाताहै, जिसमें मिट्टी को एक प्रयोगशाला सेटिंग में पौधों के विकास का समर्थन करने के लिए राइजोबॉक्स में रखाजाताहै और मिट्टी में प्रयोगशाला में प्रयोगशाला तत्वों को एक बाध्यकारी परत में फैलाना होता है। इस बाध्यकारी परत को ब्याज के प्रयोगशाला तत्वों को निर्धारित करने के लिए चित्रित किया जा सकता है। यह तकनीक जड़ों और राइजोसस्फीयर24, 25, 26, 27केबीच संबंधों को सफलतापूर्वक चित्रित कर सकती है, लेकिन रूट-बाउंडिंग से कलाकृतियां राइजोबॉक्स में पौधों को उगाने से मौजूद हो सकती हैं, और रूट इंटीरियर के बारे में जानकारी डीजीटी के साथ कैप्चर नहीं की जाती है। उत्तरार्द्ध में जड़ों और राइजोस्पायर का नमूना शामिल है, नमूने को संरक्षित करना, और सीधे नमूना अनुभाग पर मौलिक वितरण का विश्लेषण करना शामिल है। वेटलैंड संयंत्र की जड़ों और उनके आसपास के राइजोस्पीयर के इस पर्यावरणीय नमूने के लिए, नमूना तैयार करने से कलाकृतियों से बचने के लिए सावधानीपूर्वक नमूना हैंडलिंग की आवश्यकता होती है।

यहां एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो स्लैम-फ्रीजिंग और फ्रीज सुखाने द्वारा वेटलैंड पौधों की जड़ संरचनाओं और राइजोस्फीयर रसायन को प्रभावी ढंग से संरक्षित करता है। फ्लैश-फ्रीजिंग ऑक्सीजन संवेदनशील सॉल्यूट्स के परिवर्तनों को काफी धीमा कर सकता है लेकिन जड़ों को नुकसान पहुंचा सकता है और जब नमूने सूख जाते हैं तो जुड़ाव हो सकता है। हालांकि, स्लैम-फ्रीजिंग जहां नमूना तांबे के ब्लॉकों के बीच जमे हुए है तरल नाइट्रोजन के साथ पूर्व ठंडा जड़ क्षति और नमूना विरूपण28को कम करता है । संरक्षित नमूनों को तब एक एपॉक्सी राल में एम्बेडेड किया जाता है जो20,29 के रूप में संरक्षित करता है और उनके राइजोसस्फेयर मिट्टी के भीतर जड़ों की इमेजिंग के लिए काटा और पॉलिश किया जा सकता है। इस रिपोर्ट में नमूनों का विश्लेषण एस-एक्सआरएफ केमिकल स्पेक्सेशन इमेजिंग ने पतली सेक्शनिंग के बाद किया । हालांकि, अन्य इमेजिंग तकनीकों का भी उपयोग किया जा सकता है, जिसमें लेजर एब्लेशन-प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला-आईसीपी-एमएस), कण प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन (PIXE), माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सिम्स), और लेजर प्रेरित ब्रेकडाउन स्पेक्ट्रोस्कोपी (LIBS) इमेजिंग शामिल हैं।

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Protocol

1. स्लैम-फ्रीजिंग उपकरणों की तैयारी

  1. तरल नाइट्रोजन रखने में सक्षम एक साफ कूलर के अंदर दो तांबे ब्लॉक (~ 5 सेमी x 5 सेमी x 15 सेमी) क्षैतिज रखें और ब्लॉक को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त तरल नाइट्रोजन डालें। एक बार बुदबुदाती कम हो जाती है, प्रत्येक छोर पर एक कॉपर ब्लॉक के शीर्ष पर दो स्पेसर रखें।
    नोट: स्पेसर ऊंचाई जमे हुए नमूने की ऊंचाई निर्धारित करती है; यह उदाहरण क्यूब्स बनाने के लिए 2 सेमी स्पेसर का उपयोग करता है लगभग 3 सेमी x 3 सेमी x 2 सेमी। तरल नाइट्रोजन की मात्रा कूलर के आकार पर निर्भर करेगी। यह उदाहरण श्रृंखला में लगभग 5 क्यूब्स के लिए लगभग 1 एल का उपयोग करता है।
    सावधानी: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और वेंटिलेशन का उपयोग करें क्योंकि तरल नाइट्रोजन एक क्रायोजेन और एक एस्फिक्सियंट है।
  2. चिमटे और क्रायोजेनिक दस्ताने का उपयोग करना, इसके अंत में अन्य तांबे के ब्लॉक को खड़ा करें, ताकि नमूना होने पर पुनर्प्राप्ति को आसान बनाया जा सके।

2. नमूना संग्रह और स्लैम-फ्रीजिंग

  1. फावड़ा का उपयोग करके गीली मिट्टी से वांछित पौधे और राइजोस्पीयर निकालें और यह सुनिश्चित करें कि खोदा गया छेद वांछित जड़ मात्रा से बहुत बड़ा है। मिट्टी और पौधे को एक कंटेनर में रखें और इसे एक बेंचटॉप पर रखें।
    नोट: एक बर्तन अध्ययन से पूरी कमरों की मिट्टी और पौधे का भी उपयोग किया जा सकता है।
  2. वांछित मिट्टी स्थान निर्धारित करें जहां जड़ों को लिया जाना है (यानी, गहराई और शूट के निकटता)। स्टील ब्लेड का उपयोग करके अतिरिक्त मिट्टी को काट दें, ध्यान रखें कि वांछित क्षेत्र में मिट्टी को परेशान न करें। जब वांछित क्षेत्र पहुंच जाता है, तो एक रूट "घन" लगभग 3 सेमी x 3 सेमी x 2 सेमी काटें और तुरंत क्षैतिज तांबे के ब्लॉक पर दो स्पेसर्स के बीच घन रखें। क्रायोजेनिक दस्ताने का उपयोग करके, ऊर्ध्वाधर कॉपर ब्लॉक उठाएं और इसे राइजोस्फेयर क्यूब को स्लैम-फ्रीज करने के लिए स्पेसर्स के शीर्ष पर रखें।
  3. बुदबुदाती के बाद (~ 5 मिनट), तांबे के ब्लॉक से स्लैम-फ्रोजन राइजोफेयर क्यूब को पुनः प्राप्त करें और एक पूर्व-लेबल एल्यूमीनियम फॉइल स्क्वायर के अंदर लपेटें। यदि वांछित हो तो पन्नी पर ब्लॉक के अभिविन्यास को चिह्नित करें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में भंडारण तक तरल नाइट्रोजन के दूसरे कंटेनर में रखें।
  4. क्षेत्र स्थल या प्रयोग से रूट क्यूब्स की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यकतानुसार दोहराएं। सुनिश्चित करें कि दोनों तांबे के ब्लॉक नमूनों के बीच ठंडा करने के लिए समय दिया जाता है ।

3. फ्रीज-सुखाने और एम्बेडिंग राइजोस्पेयर क्यूब्स

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्रीज ड्रायर तैयार करें। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखें कि यह -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूनों को हटाने से पहले उचित वैक्यूम दबाव और तापमान प्राप्त किया है।
  2. जब फ्रीज ड्रायर नमूने प्राप्त करने के लिए तैयार है, एक साफ और एसिड धोया ५० एमएल ट्यूब के अंदर एक जमे हुए राइजोस्फेयर घन जगह है और एक साफ डिस्पोजेबल पोंछ के साथ शिथिल कवर । एक रबर बैंड के साथ पोंछ सुरक्षित। प्रति ट्यूब एक घन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यकतानुसार दोहराएं।
    नोट: नमूना एक ट्यूब के लिए बहुत बड़ा है, तो इसे सीधे एक नमूना धारक के रूप में एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके फ्रीज ड्रायर पोत में रखा जा सकता है।
  3. फ्रीज ड्रायर जहाजों में नमूने युक्त ट्यूब रखें और कई दिनों के लिए सूखी फ्रीज । सही सुखाने का समय मिट्टी के गुणों पर निर्भर करेगा।
    नोट: रिहाइड्रेशन से बचने के लिए फ्रीज ड्रायर या एक desiccator में सूखे नमूनों को स्टोर करें ।
  4. सूखे मिट्टी के क्यूब्स को आकार में काटने के लिए स्टील ब्लेड का उपयोग करें ताकि वे वांछित रूप में फिट हों (उदाहरण के लिए, 25 मिमी व्यास फॉर्म अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए आदर्श है)। प्रत्येक रूप को लेबल करें, मिट्टी के क्यूब्स को रूपों में रखें और रूपों को वैक्यूम डेसिकेटर के अंदर रखें।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एपॉक्सी तैयार करें। यह सुनिश्चित करें कि चुने हुए एपॉक्सी दूषित न हों और वांछित तत्वों के विशिष्ट परिवर्तन न हों 20,29,30.
  6. मिट्टी के एक तरफ फॉर्म में एपॉक्सी जोड़ने के लिए एक ड्रॉपर का उपयोग करें, जब तक कि यह पूरी तरह से नमूने को कवर न करे। मिट्टी के रंग में अंधेरा हो जाएगा के रूप में एपॉक्सी मिट्टी गीला ।
    नोट: मिट्टी में हवा से बचने के लिए अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे एपॉक्सी जोड़ें।
  7. एक बार फॉर्म एपॉक्सी से भर जाने के बाद वैक्यूम डिजिकेटर बंद कर दें और वैक्यूम चालू कर दें। मिट्टी में फंसी हवा की मात्रा के आधार पर, समय-समय पर रूपों में अधिक एपॉक्सी को जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है। पहले 1-4 घंटे के लिए हर 30-90 मिनट में एपॉक्सी के स्तर की जांच करें और आवश्यकतानुसार एपॉक्सी जोड़ें।
  8. एपॉक्सी के कठोर होने के बाद फॉर्म से नमूना निकालें (~ 5 दिन)।

4. राइजोस्पायर क्यूब्स को काटना और सेक्शन करना

  1. एक हीरे ब्लेड परिशुद्धता गीला देखा का उपयोग कर नमूना काटें। यदि पिछले कट में कोई जड़ें प्राप्त नहीं की जाती हैं तो नमूनों को विभिन्न स्थानों में काट लें।
  2. मैन्युअल रूप से ~ 30 एस के लिए कट साइड पर उत्तरोत्तर महीन सैंडपेपर (जैसे, 220, 500, 1000, और 1500 धैर्य) के साथ कटौती नमूनों को रेत दें।
  3. ला-आईसीपी-एमएस जैसी तकनीकों का उपयोग करके नमूनों की सतह इमेजिंग करें।
    नोट: एस-एक्सआरएफ के लिए पतले अनुभाग तैयार करने के लिए, या तो नमूनों को पतले वर्गों (एकल या डबल साइड पॉलिशिंग) तैयार करने में सक्षम कंपनी को भेजें या नीचे वर्णित चरणों 4.4 - 4.6 का पालन करें।
  4. सुपर गोंद का उपयोग कर एक क्वार्ट्ज स्लाइड करने के लिए वांछित नमूना पक्ष गोंद और रात भर इलाज करने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. एक पतली खंडित मशीन का उपयोग करना, स्लाइड पर मिट्टी को 2 मिमी मोटी तक काटें और फिर वांछित मोटाई (आमतौर पर 30 माइक्रोन) को पीस लें। यदि वांछित हो तो नमूना सतह को पॉलिश किया जा सकता है।
  6. वर्गों की एस-एक्सआरएफ इमेजिंग करें। इमेजिंग समय के लिए आवेदन करने और उपयोग करने के लिए वांछित सिंक्रोट्रॉन सुविधा और बीमलाइन पर उचित चरणों का पालन करें।

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Representative Results

यह विधि जड़ों और वेटलैंड पौधों के राइजोसस्फीयर और थोक मिट्टी में जड़ों और रासायनिक प्रजातियों के संरक्षण के लिए अनुमति देती है। इस काम में, विधि का उपयोग चावल(ओरिज़ा सतीवा एल) के राइजोसस्फीयर में फे और एमएन ऑक्साइड और पौधे के पोषक तत्वों के साथ विशिष्टता और सह-स्थानीयकरण के रूप में मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। चावल को डेलावेयर विश्वविद्यालय में चावल की सुविधा में उगाया गया था जहां चावल के अनाज में 30 चावल धान मेसोकोस्म (2 मीटर x 2 मीटर, 49 पौधे प्रत्येक) का उपयोग विभिन्न मिट्टी और जल प्रबंधन स्थितियों के तहत चावल उगाने के लिए किया जाता है। इस प्रयोग में 1470 व्यक्तिगत पौधे दिए गए जिनसे बढ़ते मौसम में राइजोस्फीयर का नमूना लिया जा सकता था।

नमूनों की पर्याप्त संख्या को देखते हुए, पतली धाराओं जड़ morphologies की एक किस्म पर कब्जा करने में सक्षम थे । चित्रा 1A ट्रांसवर्स सेक्शन के रूप में मिट्टी मैट्रिक्स के भीतर मौजूद कई रूट व्यास दिखाता है। हालांकि, कुछ मिट्टी वर्गों में कुछ, यदि कोई हो, जड़ें हो सकती हैं। इस कार्य में, 63 मिट्टी ब्लॉकों को संसाधित किया गया था और गीले देखा पर एक बार कटौती की गई थी ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि नमूनों का कौन सा सबसेट पतली खंड के लिए उपयुक्त था। ६३ नमूनों में से 14 में कोई जड़ें नहीं थीं, 31 में 1-3 जड़ें थीं और 18 में 3 से अधिक जड़ें थीं । ध्यान दें कि जड़ें गुणवत्ता के अलग-अलग स्तरों में मौजूद हो सकती हैं। चित्रा 1B एक अच्छी तरह से संरक्षित जड़, फ्रीज सुखाने की प्रक्रिया से विकृत एक जड़, और एक जड़ है कि पतली खंड प्रक्रिया के दौरान बाहर निकाला गया था दिखाता है ।

रूट पतले वर्गों एस-XRF का उपयोग कर ब्याज के तत्वों के स्थान को मैप करने के लिए विश्लेषण किया गया । चित्रा 2B देशांतर अनुभाग में एक पार्श्व जड़ के साथ एक रूट ट्रांसवर्स सेक्शन दिखाता है। चित्रा 2C इस रूट एफ, एमएन, और के रूप में एक तिरंगा साजिश के साथ XRF द्वारा विश्लेषण अनुभाग से पता चलता है । Fe मिट्टी में मौजूद है और फे पट्टिका में जड़ के आसपास है, और Fe पट्टिका भी प्रकाश माइक्रोग्राफ छवियों पर दिखाई दे रहा है । मैंगनीज पार्श्व जड़ के प्रांतस्था में विशिष्ट रूप से मौजूद है, लेकिन यह भी सह Fe पट्टिका में कुछ क्षेत्रों में Fe के साथ पता लगाता है, एक हरे नीले रंग के रूप में प्रदर्शित होने । आर्सेनिक ज्यादातर पार्श्व जड़ के वाक्यूलेचर में मौजूद था, जो प्राथमिक जड़ के वाक्यूलेचर में विलय करते थे।

रासायनिक नमूना इमेजिंग ने कई घटना बीम ऊर्जा पर दोहराया XRF नक्शे लेने और XANES स्पेक्ट्रा के रूप में मानक के लिए रैखिक संयोजन फिटिंग का उपयोग करके ब्याज की प्रजातियों के रूप में विभिन्न अलग । जैसा कि विशिष्ट मानचित्र चित्र 2 डी में दिखाए गए हैं और रूप प्रजातियों के स्थानीयकरण में परिवर्तनशीलता दिखाते हैं। चित्रा 2E एक तिरंगे की साजिश के रूप में एक ही डेटा से पता चलता है । तिरंगा प्लॉट आर्सेनिट और आर्सेनिट ग्लूटाथिएक को वेक्यूलेचर में बारीकी से जुड़ा दिखाता है, जबकि आर्सेनेट मुख्य रूप से फे पट्टिका से जुड़े रूट के बाहरी हिस्से पर स्थित है।

Figure 1
चित्रा 1 - चावल रूट पतली वर्गों एक सिल्टी दोमट मिट्टी में पद्धतिगत परिणामों की एक किस्म दिखा (पैमाने पर सलाखों 0.5 मिमी हैं) । A)कई अलग-अलग रूट व्यास क्रॉस-सेक्शन (सफेद बक्से में) स्पष्ट हैं। B) प्रक्रिया के दौरान जड़ें क्षतिग्रस्त हो सकती हैं। सफेद बॉक्स में जड़ बरकरार और गोलाकार बनी हुई है, जबकि फ्रीज सुखाने की प्रक्रिया के दौरान नारंगी बॉक्स में जड़ को संकुचित किया गया है। लाल बॉक्स से पता चलता है जहां पतली खंड प्रक्रिया के दौरान एक जड़ बाहर निकाला गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 - एक चावल की जड़ के ट्रांसवर्स अनुभाग एक सिल्टी लोम मिट्टी में एक पार्श्व जड़ के एक देशांतर खंड के साथ। A)मिट्टी अनुभाग सफेद बक्से में कई रूट ट्रांसवर्स सेक्शन दिखाता है। सफेद तीर देशांतर खंडों को दर्शाते हैं। स्केल बार 2 मिमी बी है)मृदा अनुभाग पैनल के ऊपरी बाएं कोने से जड़ दिखाता है ए सफेद आयत सिंक्रोट्रॉन एक्सआरएफ द्वारा इमेज किए गए क्षेत्र को दर्शाता है। स्केल बार 0.5 मिमी सी)आर्सेनिक (लाल), लोहा (हरा), और मैंगनीज (नीला) की तिरंगा XRF छवि है। आसॅ्डे, फे और एमएन का अधिकतम पैमाना 1:50:2.5 के अनुपात में है। स्केल बार 100 माइक्रोन है डी)आर्सेनिक एक्सआरएफ स्पेकेशन मैप्स फॉर आर्सेनिट ग्लूटाथिएक, आर्सेनिट और आर्सेनेट के लिए, जहां गर्म रंग आसॅ्मर की उच्च सांद्रता का संकेत देते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन है। ई)एएस प्रजाति का तिरंगा प्लॉट, जहां अधिकतम तीव्रता आर्सेनिट (लाल) = आर्सेनेट (ग्रीन) = 0.5 आर्सेन स्केल बार 100 माइक्रोन है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह पत्र एक स्लैम-फ्रीजिंग तकनीक का उपयोग करके वेटलैंड संयंत्र जड़ों के संरक्षित थोक मिट्टी + राइजोस्फीयर प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उपयोग मौलिक इमेजिंग और/या रासायनिक नमूना मानचित्रण के लिए किया जा सकता है ।

मौजूदा तरीकों पर इस विधि के कई लाभ हैं। सबसे पहले, यह विधि जड़ों और आसपास के राइजोस्फेयर की एक साथ जांच की अनुमति देती है। वर्तमान में मिट्टी को धोकर और जड़ों को संरक्षित करके31, 32या कृत्रिम वातावरण (जैसे, राइजोबॉक्स) में पौधों को उगाने और जड़-मिट्टी की बातचीत24,33,34 की जांच करने के लिए डीजीटी विधियों का उपयोग करके, लेकिन जड़ का पालन करने की क्षमता के बिना, मिट्टी के वातावरण से बाहर निकालने और रासायनिक रूप से छवि जड़ों कोसंरक्षित करने के लिए मौजूद हैं। यहां वर्णित विधि जड़-मिट्टी संबंधों के अवलोकन के लिए सीटू में जड़ और आसपास के राइजोसस्फेयर मिट्टी की सीधी जांच के लिए अनुमति देती है। इसी तरह की तकनीक का उपयोग सीटू चावल की जड़ों और आसपास के राइजोसिस्फेयर में जांच करने के लिए किया गया है, लेकिन यहां वर्णित स्लैम-फ्रीजिंग के बजाय तरल नाइट्रोजन11,३५,३६ में नमूना जल्दी से आगे बढ़नेवाला है । तेजी से ऊतक जमे हुए हैं, कम संभावना है कि वे बर्फ क्रिस्टल३७फार्म कर रहे हैं । पूर्व-कूल्ड कॉपर ब्लॉकों के बीच स्लैम-फ्रीजिंग तेजी से नमूने को ठंडा करता है और इसलिए बर्फ क्रिस्टल और बाद में पौधे के ऊतकों के नुकसान के गठन को कम करता है जो परिवेश के तापमान11,38पर तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके फ्लैश-फ्रीजिंग के साथ हो सकता है। यहां वर्णित विधि का उपयोग करते हुए, एक ही पौधे से कई नमूने लिए जा सकते हैं, एक क्षेत्र से कई पौधे, और/या पर्यावरण अपेक्षाकृत कम समय में । एक बार प्राप्त होने के बाद, कई नमूनों को फ्रीज-सूखे, एपॉक्सी में एम्बेडेड किया जा सकता है, और न्यूनतम लागत के साथ हीरे के ब्लेड गीले के साथ काटा जा सकता है। इन नमूनों की जांच एक हल्के माइक्रोस्कोप के साथ की जा सकती है ताकि आशाजनक नमूनों की पहचान की जा सके जो सीधे इमेज्ड (जैसे, ला-आईसीपी-एमएस) या पतली खंड और एसएक्सआरएफ इमेजिंग के लिए आगे संसाधित किए जा सकते हैं। एक पतला खंड एक ही स्लाइड पर विभिन्न आकारों की कई जड़ों को कैप्चर कर सकता है, जो विषम राइजोसस्फेयर को पकड़ने और उपकरण पर इमेजिंग समय को अधिकतम करने में मदद करता है। इस विधि का उपयोग सीधे पौधे-मिट्टी संबंधों जैसे कि राइजोस्पायर को परेशान किए बिना फे सजीले टुकड़े में ज़ब्ती के रूप में भी किया जा सकता है। हाइड्रोपोनिक प्रयोगों का उपयोग करके चावल जैसी आर्द्रभूमि जड़ों पर फे पट्टिका गठन को प्रेरित करने के मौजूदा तरीके39,40,41 मिट्टी में उगाए जाने वाले पौधों में होने वाले रूट कवरेज और खनिज संरचना के संदर्भ में फे पट्टिका की विषमता को पकड़ने में विफल रहते हैं11,18,20,42 ,43,43,44.

विधि सफल होने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण चरणों का पालन करना महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि नमूना स्थान और अभिविन्यास चयनित वांछित प्रश्न को संबोधित करता है। दूसरा, एक एपॉक्सी का उपयोग करें जो तत्व संदूषण का पता लगाने से मुक्त है और ब्याज20 , 29, 30के रूप में तत्वों के रासायनिक विशिष्टता को संरक्षित करने के लिए दिखाया गया है। तीसरा, एपॉक्सी को धीरे-धीरे जोड़ें और नमूने के एपॉक्सी गीला होने और फंसे हुए गैस को हटाने की सुविधा के लिए वैक्यूम के तहत एपॉक्सी में नमूना रखें। इन चरणों के बाद थोक मिट्टी, राइजोस्फेयर और जड़ों का एक उच्च गुणवत्ता वाला नमूना प्रदान करेगा जिसका उपयोग छवि विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

विधि की कई सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, फ्रीज-ड्रायर पर जमे हुए नमूने को सुखाने से मिट्टी की विकृति हो सकती है, जो जड़ों को प्रभावित कर सकती है। यह मिट्टी की उच्च सामग्री के साथ मिट्टी में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होने की संभावना है और इस प्रकार मिट्टी सूखी के रूप में पतन के लिए प्रवृत्ति । उदाहरण के रूप में, एक गाद मिट्टी से प्राप्त चावल राइजोस्फीयर नमूना तैयार किया गया था और मिट्टी का टूटना स्पष्ट है जबकि फे पट्टिका-लेपित चावल की जड़ अप्रभावित है(चित्र 3)।

Figure 3
अंक 3   - चावल की जड़ एक गाद मिट्टी धान की मिट्टी से पतली धारा। फ्रीज-सुखाने के दौरान मिट्टी में कई दरारें हुई हैं, लेकिन इन दरारों ने पार्श्व जड़ देशांतर खंड को विकृत नहीं किया, जिसे सफेद आयत द्वारा चित्रित किया गया है। स्केल बार 0.5 मिमी है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

आंकड़ों से पता चलता है कि यह तकनीक सफलतापूर्वक एक गाद दोम(आंकड़े 2, 3)में माइक्रोन-स्केल जानकारी प्राप्त कर सकती है, और यह संभावना है कि तकनीक मोटे बनावट वाली मिट्टी में सफल हो सकती है; हालांकि, उच्च मिट्टी की सामग्री के साथ मिट्टी चुनौतियों का सामना कर सकते है और आगे की जांच की जानी चाहिए । दूसरा, जड़ों को खंड पर मिट्टी से बाहर निकाला जा सकता है। यह चुनौती इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनूठी नहीं है लेकिन इस पर विचार किया जाना चाहिए । तीसरा, जड़ें हर मिट्टी के घन में मौजूद नहीं हो सकती हैं, इसलिए वांछित पौधे के राइजोसस्फेयर पर कब्जा करने के लिए कई नमूनों को प्राप्त करने और काटने की आवश्यकता होती है। चौथा, संरक्षण विधि तरल नाइट्रोजन की आवश्यकता है, जो दूरदराज के क्षेत्र के अध्ययन के लिए चुनौतियां पैदा कर सकता है । यहां खेत में प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, जो लिक्विड नाइट्रोजन देवर से 2 मील से भी कम दूरी पर था। हालांकि, यदि एक दूरस्थ क्षेत्र साइट से एक छोटी ड्राइव के भीतर तरल नाइट्रोजन उपलब्ध नहीं है, तो नमूना प्राप्त करने के लिए कई विकल्प मौजूद हैं। इसमें तांबे के ब्लॉकों को ठंडा करने या एक बड़े पीवीसी रिंग के साथ पूरे पौधे और आसपास की मिट्टी की खुदाई करने, इसे गैस-अभेद्य सामग्री में रखने और संरक्षण के लिए निकटतम तरल नाइट्रोजन स्रोत तक परिवहन करने के लिए एक और स्रोत का उपयोग करना शामिल है। इसके लिए यह सुनिश्चित करना जरूरी है कि राइजोस्पफेयर सैंपल प्राप्त करने से पहले प्लांट शूट को उसकी जड़ों से न काटा जाए । यदि आवश्यक हो, तो नमूने को प्रशीतन के तहत भी रखा जा सकता है और संरक्षण के लिए प्रयोगशाला में रात भर भेज दिया जा सकता है। एक बार प्रयोगशाला में प्राप्त होने के बाद, तरल नाइट्रोजन-कूल्ड कॉपर ब्लॉकों का उपयोग करके वर्गों को संरक्षित किया जा सकता है। अंत में, वेटलैंड मिट्टी और राइजोस्फेयर के किसी भी संरक्षण विधि के साथ विशिष्टता परिवर्तन संभव हैं। इससे बचने के लिए, नमूनों को प्राप्त किया जाना चाहिए और ऑक्सीजन के संपर्क में आने से बचने के लिए जल्दी से या ऊपर किए गए अन्य उपायों को खाली किया जाना चाहिए। फ्रीज-सूखे नमूनों के किनारों को फिर उन किनारों से बचने के लिए मुंडा जा सकता है जो ऑक्सीजन के लिए अधिक जोखिम हो सकते हैं। यहां जड़ और राइजोसस्फीयर नमूनों में कम आर्सेनिक प्रजातियों के संरक्षण(चित्रा 1D,ई)और पिछले काम28 में पता चलता है कि यह स्लैम-फ्रीजिंग तकनीक ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील रासायनिक प्रजातियों को संरक्षित करने में सक्षम है यदि सावधानी से किया जाता है ।

इस विधि का उपयोग राइजोस्पाफेयर विज्ञान में कई प्रमुख प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। इनमें राइजोसिफेयर में पोषक तत्वों और संदूषक बातचीत का अध्ययन करने से संबंधित अनुप्रयोग शामिल हैं जिनमें संदूषकों और Fe या एमएन सजीले टुकड़े के साथ पोषक तत्वों की बातचीत शामिल हो सकती है। विधि पौधे-मिट्टी संबंधों की लौकिक और स्थानिक विषमता के अध्ययन और सीटू में राइजोस्फेयर में तत्वों के साथ रूट मोरफोलोजी कैसे बातचीत करती है, इसकी परीक्षा के लिए अनुमति देती है। इसका उपयोग खाद्य सुरक्षा से संबंधित अनुप्रयोगों में किया जा सकता है जैसे चावल द्वारा आर्सेनिक तेज को समझना, राइजोस्फीयर में पोषक तत्व गतिशीलता, या फाइटोरेमेडेशन से संबंधित अनुप्रयोग जैसे धातु (लॉयड) वेटलैंड पौधों में तेज।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को डेलावेयर विश्वविद्यालय और Brookhaven राष्ट्रीय प्रयोगशाला के बीच सहयोग का समर्थन करने के लिए Seyfferth और Tappero के लिए एक संयुक्त बीज अनुदान स्वीकार करते हैं । इस शोध के कुछ हिस्सों में नेशनल सिंक्रोट्रॉन लाइट सोर्स II के एक्सएफएम (4-बीएम) बीमलाइन का इस्तेमाल किया गया, जो कॉन्ट्रैक्ट नंबर एक के तहत ब्रुकहेवन नेशनल लेबोरेटरी द्वारा विज्ञान के डीओ कार्यालय के लिए संचालित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा के अमेरिकी ऊर्जा विभाग (डीओई) कार्यालय है । डीई-एससी0012704।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Copper blocks McMaster Carr 89275K42
Diamond blade Buehler 15 LC, 102 mm x 0.3 mm operation speed: 225 rpm
Epoxy forms Struers 40300085 FixiForm
Epoxy Epotek 301-2FL
Superglue Loctite 404
Thin sectioning machine Buehler PetroThin
Wet saw Buehler IsoMet 1000

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पर्यावरण विज्ञान अंक १६८ स्लैम-ठंड फ्रीज सुखाने नमूना मानचित्रण एक्स-रे फ्लोरेसेंस ला-आईसीपी-एमएस रूट पट्टिका
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Seyfferth, A. L., Limmer, M. A.,… More

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A., Tappero, R. A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62227, doi:10.3791/62227 (2021).

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