元素イメージングのための湿地根と根層圏を保存する方法

Summary

我々は、米(Oryza sativa L.)をモデル種として使用して湿地環境から無傷の根と周囲の根球土壌をサンプリング、保存、および切除するためのプロトコルを記述する。保存後、このサンプルは、放射光蛍光X線(XRF)化学種分イメージングなどの元素イメージング技術を使用して分析することができます。

Abstract

根は土壌環境と幅広く相互作用しますが、根と周囲の根層の相互作用を視覚化することは困難です。湿地植物の根圏化学は、根からバルク土壌への急激な酸素勾配のために捕獲することが特に困難である。ここでは、スラム凍結と凍結乾燥を通じて湿地植物の根構造と根圏化学を効果的に保存するプロトコルが記載されています。液体窒素であらかじめ冷却された銅ブロック間でサンプルを凍結するスラム凍結は、化学種分化の変化を最小限に抑えながら、フラッシュフリーズで発生する可能性のある根の損傷とサンプル歪みを最小限に抑えます。サンプルの歪みは引き続き可能ですが、複数のサンプルを迅速かつ最小限のコストで取得できるため、満足のいくサンプルを得ることができ、イメージング時間が最適化されます。このデータは、この方法が鉄のプラークに関連する米の根および根層圏の減少ヒ素種を保存することに成功したことを示している。この方法は、微量元素循環から植物修復用途まで、濃度範囲に及ぶ広範囲の湿地環境における植物と土壌の関係の研究に採用することができます。

Introduction

根とそれらの根球は、植物がミネラル栄養素と汚染物質を得る方法を理解するために、動的、異種、および非常に重要です^1,2,3.根は、栄養素(例えば、リン)と汚染物質(例えば、ヒ素)が土壌から植物に移動し、このプロセスを理解することは、食品の量と質、生態系機能、植物修復に影響を与える一次経路です。しかし、根は栄養摂取のニーズに応じて空間および時間が成長する動きであり、それらはしばしば機能、直径、および構造(例えば、横根、外見的な根、根毛⁾²で変化する。根系の異質性は、細胞から生態系レベルまでの空間スケールと、時間単位から10年までの時間スケールで研究することができます。したがって、根とその周囲の土壌、または根圏のダイナミックで不均一な性質は、時間の経過とともに根圏化学を捕捉するための課題を提起する。この課題にもかかわらず、この重要な植物と土壌の関係を特徴付けるために、土壌環境の根を研究することが不可欠です。

湿地植物の根圏化学は、バルク土壌から根まで存在する急激な酸素勾配が存在し、空間と時間が変化するため、特に調査が困難です。根は酸素を吸い込む必要があるため、湿地植物は、アエレンチマ^4,5を作り出すことで湿地土壌の低酸素状態に適応している。アエレンチマは、芽から根まで広がる空洞化皮質組織であり、植物を通して根に空気を拡散させる。しかし、この空気の一部は、根の根のあまり茎に漏れ、特に根の根の接合部の近くで、成熟した根の先端と伸び帯^{6、7、8、9}が^少ない。この放射状酸素損失は、根層圏(生物ジオ)化学に影響を与える湿地植物の根層に酸化されたゾーンを作り出し、還元バルク土壌^10、11、12とは異なる。湿地の根球や根の栄養成分や汚染物質の運送と輸送を理解するためには、化学的に還元されたバルク土壌、酸化された根球、湿地植物の根を分析するために保存することが重要です。しかし、バルク土壌には酸素感受性の還元土壌成分が含まれているため、根および土壌の保存方法は根構造を維持し、酸素感受性反応を最小限に抑える必要があります。

植物組織を固定し、イメージングのための超構造を維持する方法が存在しますが、これらの方法は、湿地土壌に成長している根を化学的に保存するために適用することはできません。植物細胞内の元素分布のみが望まれる調査では、植物は一般的に水耕的に成長し、根を溶液から容易に除去し、高圧凍結および凍結置換下で固定し、高解像度二次イオン質量分析(nanoSIMS)、電子顕微鏡、シンクロトロンX線蛍光(S-XRF)^分析を含む様々なイメージングアプリケーションに切除することができる^{。 14、15.}湿地根の外側にあるFeプラークを調査するために、これらの水耕栽培研究は、溶液¹⁶においてFeプラーク形成を人工的に誘導しなければならないが、^{これは、Fe}プラーク形成および関連元素の分布および鉱物組成の不均一性を正確に表^さない。凍結採点²¹で湿地土および関連微生物を保存する方法が存在するが、この技術では根を得ることは困難である。土壌中に生育する根を可視化する現在の方法とその根茎圏化学は、元素束と全元素濃度(および種分化)の2つの主要な測定タイプで構成されています。前者は、通常、薄膜(DGT)22、23、24の拡散勾配を使用して測定され、土壌は実験室での植物の成長を支えるために根茎に入れられ^、土壌中の不安定な元素はゲルを介して結合層に拡散する。この結合層は、その後、対象の陰唇要素を定量化するために画像化することができます。この技術は根と根茎^{24、25、26、27}との関係をうまく示すことができますが^、根の境界からのアーティファクトは根茎の植物を育てることによって存在し、根内部の情報はDGTでは捕捉されません。後者は、根と根圏のサンプリング、サンプルを保存し、サンプルセクション上の元素分布を直接分析することを含みます。湿地植物の根とその周囲の根層のこの環境サンプリングのために、サンプル調製からアーティファクトを避けるために慎重なサンプル処理が必要です。

ここでは、スラム凍結と凍結乾燥によって湿地植物の根構造と根圏化学を効果的に保存するプロトコルが記載されています。フラッシュフリーズは酸素感受性の溶質の変換を劇的に遅くすることができますが、根を損傷し、サンプルが乾燥すると動員を引き起こす可能性があります。しかしながら、液体窒素であらかじめ冷却された銅ブロック間で試料が凍結されたスラム凍結は、根の損傷およびサンプル歪みを最小限に抑^える28。保存されたサンプルは、その後、種分化^20、29を保存するエポキシ樹脂に埋め込まれ^、根茎の土壌内の根のイメージングのために切断および研磨することができます。このレポートのサンプルは、薄い断面化後のS-XRF化学種分イメージングによって分析された。しかし、レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析(LA-ICP-MS)、粒子誘導X線放出(PIXE)、二次イオン質量分析(SIMS)、レーザー誘導分解分光法(LIBS)イメージングなど、他のイメージング技術も使用できます。

Protocol

1. スラム凍結装置の準備

1. 液体窒素を保持できるクリーンクーラーの内側に2つの銅ブロック(約5cm x 5 cm x 15 cm)を水平に置き、ブロックを水没させるのに十分な液体窒素を注ぎます。バブリングが沈静化したら、両端の1つの銅ブロックの上に2つのスペーサーを置きます。
   注: スペーサーの高さによって、凍結するサンプルの高さが決まります。この例では、2 cm のスペーサーを使用して、約 3 cm x 3 cm x 2 cm のキューブを作成します。液体窒素の体積は、クーラーサイズに依存します。この例では、約 5 つのキューブに対して約 1 L を使用します。
   注意:液体窒素は凍結剤と窒息剤であるため、適切な個人用保護具と換気を使用してください。
2. トングと極低温手袋を使用して、サンプルが所定の位置にあるときに検索を容易にするために、その端に他の銅ブロックを立たせます。

2. サンプル収集とスラム凍結

1. シャベルを使用して湿った土壌から所望の植物と根圏を抽出し、掘られた穴が所望の根の体積よりもはるかに大きいことを確認します。土と植栽を容器に入れ、ベンチトップに置きます。
   注:ポットスタディから全体の鉢植えの土壌や植物を使用することができます。
2. 根を取る所で所望の土壌位置(すなわち、深さと撮影への近接性)を決定します。鋼鉄刃を使用して余分な土を切り取り、所望の区域の土を邪魔しないように注意してください。目的の領域に達したら、約3 cm x 3 cm x 2 cmのルート「立方体」をカットし、水平銅ブロック上の2つのスペーサーの間に直ちに立方体を配置します。極低温手袋を使用して、垂直銅ブロックをピックアップし、根茎立方体をスラム凍結するためにスペーサーの上に置きます。
3. バブリングが沈静化した後(約5分)、銅ブロックからスラム冷凍根茎球立方体を取り出し、あらかじめラベル付けされたアルミホイルスクエアの内側にラップします。必要に応じて、ホイル上のブロックの方向をマークします。-80°Cの冷凍庫に貯蔵するまで、液体窒素の第二の容器に入れます。
4. 必要に応じて繰り返し、フィールド サイトまたは実験から必要な数のルート キューブを取得します。両方の銅ブロックがサンプル間で冷却する時間を与えられていることを確認します。

3. 凍結乾燥と埋め込み根球キューブ

1. メーカーの指示に従って、凍結乾燥機を準備します。80°Cの冷凍庫からサンプルを取り出す前に、適切な真空圧と温度を得たか確認してください。
2. 凍結乾燥機がサンプルを受け取る準備ができたら、清潔で酸洗いした50 mLチューブの中に凍結根球キューブを1つ置き、きれいな使い捨てワイプでゆるく覆います。ゴムバンドで拭き取りを固定します。必要に応じて繰り返し、チューブごとに1つの立方体を確保します。
   注:サンプルがチューブに対して大きすぎる場合は、サンプルホルダーとしてアルミホイルを使用して凍結乾燥機容器に直接配置することができます。
3. サンプルを含むチューブを凍結乾燥機の容器に入れ、数日間凍結乾燥します。正確な乾燥時間は土壌特性に依存します。
   注:水分補給を避けるために、乾燥したサンプルを凍結乾燥機またはデシケータに保管してください。
4. 鋼鉄刃を使用して乾燥した土立方体を適切な形に収まるようにサイズに切り取ります(例えば、直径25mmの形はほとんどの用途に最適です)。各フォームにラベルを付け、フォームに土壌キューブを配置し、真空デシケーターの中にフォームを配置します。
5. メーカーの指示に従ってエポキシを準備します。選択したエポキシが汚染されていないことを確認し、所望の要素^20、29、30の種分化変更を引き起こさないようにしてください。
6. ドロッパーを使用して、土壌の片側のフォームにエポキシを加え、サンプルを完全に覆うまで使用します。エポキシが土壌を濡らすと、土壌は色が暗くなります。
   注:土壌中の空気が逃げるためにゆっくりとエポキシを追加します。
7. フォームにエポキシが充填されたら、真空デシケータを閉じて真空をオンにします。土壌中に閉じ込められた空気の量に応じて、より多くのエポキシを定期的にフォームに追加する必要があります。最初の1-4時間のエポキシのレベルを30〜90分ごとに確認し、必要に応じてエポキシを加えます。
8. エポキシが硬化したら、サンプルをフォームから取り出します(〜5日)。

4. 根球立方体の切断と切除

1. ダイヤモンドブレード精密ウェットソーを使用してサンプルをカットします。前のカットで根が得られない場合は、異なる場所でサンプルをカットします。
2. カット側のカット側に、徐々に細かいサンドペーパー(例えば、220、500、1000、1500グリット)を使用して、カットサンプルを手動でサンドします。
3. LA-ICP-MSなどの技術を用いてサンプルの表面イメージングを行います。
   注:S-XRF用の薄いセクションを準備するには、薄いセクションを準備できる会社にサンプルを送るか(シングルまたはダブルサイド研磨)か、または以下に説明する 手順4.4から4.6 に従ってください。
4. スーパーグルーを使用して石英スライドに所望のサンプル側を接着し、一晩硬化させます。
5. 薄い切削機を使用して、スライドの土を2mmの厚さにカットし、希望の厚さ(通常は30μm)に粉砕します。サンプル表面は、必要に応じて研磨することができる。
6. セクションのS-XRFイメージングを実行します。目的のシンクロトロン施設とビームラインで適切な手順に従って、イメージング時間を適用し、利用します。

Representative Results

この方法は、湿地植物の根と根層の根と化学種の保存とバルク土壌を可能にします。本研究では、この方法を用いて、米の根層圏におけるFeおよびMn酸化物および植物栄養素(オリザ・サティバ L.)との種分化および共局在化を評価した。米はデラウェア大学のRICE施設で栽培され、30個の水田メソコム(それぞれ2m x 2m、49植物)を使用して、AsとCdの取り込み量を米粒に下げることを目標に、様々な土壌や水管理条件下で米を栽培しています。この実験は、成長期を通じて根球をサンプリングできる1470の個々の植物を提供した。

十分な数のサンプルを与えられた薄いセクションは、様々な根形形態を捕捉することができた。 図1Aは 、横断部として土マトリックス内に存在するいくつかの根径を示す。しかし、一部の土壌セクションには、根が含まれていない場合があります。この研究では、63個の土壌ブロックを処理し、ウェットソーで1回切断し、薄い切断に適したサンプルのサブセットを決定しました。63個のサンプルのうち、14個は根を含み、31は1〜3根を含み、18は3以上の根を含んでいた。根は、品質の様々なレベルで存在することができることに注意してください。 図1B は、よく保存されたルート、凍結乾燥プロセスによって歪んだ根、および薄い断面プロセス中に引き出されたルートを示しています。

ルート薄いセクションをS-XRFを用いて分析し、対象の要素の位置をマッピングした。 図2B は、縦方向のセクションに横方向のルートを有するルート横断部を示す。 図 2C は、このルート セクションを、Fe、Mn、および As の三色プロットを使用して XRF で分析した図です。Feは、Feプラークの土壌と根の周囲に存在し、Feプラークは光顕微鏡写真画像にも見える。マンガンは、側根の皮質に一意に存在するが、また、緑青の色合いとして現れるFeプラークの一部の領域でFeと共に位置付ける。ヒ素は主に側面根の血管系に存在し、原根の血管構造にマージされた。

化学種分化イメージングは、複数の入射ビームエネルギーで繰り返しXRFマップを取り、標準As XANESスペクトルに合わせた線形組み合わせを使用して、様々なAsの対象種を分離しました。As 種分化マップを図 2D に示し、As 種のローカライズにおける変動性を示しています。 図2E は、トリコロールプロットと同じデータを示しています。トリコロールプロットは、脈管構造に密接に関連するアルセイン酸およびアルセイン酸グルタチオンを示し、アルニセルは主にFeプラークに関連付けられた根の外側に位置する。

図1 - 稲根薄い部分は、シルティローム土壌における様々な方法論的結果を示す (スケールバーは0.5mm)。 A) 多数の異なる根径の断面が明らかである(白いボックスで)。 B)プロセス中にルートが破損する場合があります。白い箱の根はそのままで円形のままですが、オレンジ色の箱の根は凍結乾燥プロセス中に圧縮されています。赤いボックスは、薄い切断プロセス中にルートが引き出された場所を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2 -シルティローム土の横根の縦断面を有する米根の横切り部。白い箱の中のいくつかの根の横断セクションを示す)土セクション。白い矢印は縦方向のセクションを示します。スケールバーは 2mmB)パネルAの左上隅から根を示す土壌セクション。白い長方形はシンクロトロンXRFで画像化された領域を示す。スケールバーは0.5 mm)C)トリコロールXRFイメージのヒ素(赤)、鉄(緑)、マンガン(青)です。As、Fe、および Mn の最大スケールは 1:50:2.5 の比率です。スケールバーは100 μm. D)アルセニート・グルタチオン、アルセニット、アーセン酸、アーセンチのヒ素XRFスペシエーションマップで、暖かい色はAs.Scale bar. 100 μm. E)Aのトリカラープロットで、最大強度はアーセニテ(赤)=アニエレント(緑)にスケーリングされます。スケールバーは100 μmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

本論文では、元素イメージングや化学種分マッピングに使用できるスラム凍結技術を用いて、湿地植物根の保存バルク土壌+根球を得るためのプロトコルについて説明する。

既存の方法よりも、この方法のいくつかの利点があります。まず、この方法により、根と周囲の根層圏を同時に調査することが可能となる。土壌を洗い流し、根^31、32を保存したり、人工環境(例えば根茎)で植物を栽培したり^、DGT法を用いて根と土壌の相互作用を調べることによって、土壌環境から根を保存し、化学的にイメージングする^{方法が現在}存在するが^、根自体を観察する能力がない。ここで説明する方法は根土と土の関係を観察するためにその場で根および周囲の根層の土を直接調査することを可能にする。同様の技術は、その場の稲根とその周辺の根茎を調べるために使用されていますが、ここで説明するスラム凍結ではなく、液体窒素^11、35、36にサンプルを突っ込んでいます。より速い組織が凍結され、氷の結晶³⁷を形成する可能性が低くなる。事前冷却された銅ブロック間のスラム凍結は、サンプルを急速に冷却し、したがって、周囲温度^11、38で液体窒素を使用してフラッシュ凍結で起こり得る氷の結晶およびその後の植物組織損傷の形成^を最小限に抑^える。ここで説明する方法を使用すると、比較的短期間で、同じプラント、複数のプラント、および/または環境から複数のサンプルを採取できます。一度得られると、多くのサンプルを凍結乾燥し、エポキシに埋め込み、最小限のコストでダイヤモンドブレードのウェットソーで切断することができます。これらのサンプルは、直接画像化することができる有望なサンプル(例えば、LA-ICP-MS)を同定するために、または薄い切断およびsXRFのイメージングのためにさらに処理することができるサンプルを調査することができる。1つの薄いセクションは同じスライド上のさまざまなサイズの複数の根を捕獲することができ、異種の根球を捕獲し、器械のイメージ投射時間を最大にするのに役立つ。この方法はまた、根茎を乱すことなく、Feプラークの隔離のような植物と土壌の関係を直接観察するために使用することができます。水耕栽培実験39,40,41を用いて水耕期の根にFeプラーク形成を誘導する既存の方法39,40,41は、土壌栽培植物^{11,18,20,42,43,44}に生じる根のカバレッジと鉱物組成の観点からFeプラークの不均一性^を捕捉することができない。

メソッドを成功させるには、いくつかの重要な手順に従う必要があります。まず、選択したサンプルの位置と方向が目的の質問に対応していることを確認します。第二に、微量元素汚染がなく、対象のAs要素^20、29、30の化学種分を保存することが示されているエポキシ^を使用^する。第三に、エポキシをゆっくりと加え、真空下でエポキシにサンプルを入れて、試料のエポキシ湿潤と閉じ込められたガスの除去を容易にする。これらの手順に従うと、バルク土壌、根層、および画像解析に使用できる根の高品質サンプルが提供されます。

メソッドのいくつかの制限を考慮する必要があります。まず、凍結したサンプルを凍結乾燥機で乾燥させることで、土壌の変形を引き起こし、根に影響を与える可能性があります。これは、粘土含有量が高い土壌では特に困難であり、粘土が乾燥するにつれて崩壊する傾向があります。例として、シルティ粘土から得られた米根球試料を調製し、土壌の割れ目が明らかであるのに対し、Feプラークコーティングされた稲根は影響を受けない(図3)。

図 3  -シルティ粘土水田土から稲根薄い部分.凍結乾燥中に土壌に多数の亀裂が発生したが、これらの亀裂は、白い長方形によって描かれている横根縦断を歪めなかった。スケールバーは0.5 mmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

データは、この技術がシルトローム(図2、3)でミクロンスケールの情報を正常に得ることができることを示しており、この技術は粗いテクスチャ土壌で成功する可能性が高い。しかし、粘土分が高い土壌は課題を引き起こす可能性があり、さらに調査する必要があります。第二に、根は、切断時に土壌から引き出すことができます。この課題は、このペーパーで説明されているプロトコルに固有のものではありませんが、考慮する必要があります。第三に、根はすべての土壌キューブに存在するわけではないので、所望の植物の根圏を捕捉するために多くのサンプルを得て切断する必要があります。第四に、保存方法には液体窒素が必要であり、遠隔現場研究に課題を提起する可能性がある。ここでは、このプロトコルは、液体窒素デュワーから2マイル未満であったフィールドで正常に使用されています。しかし、液体窒素がリモートフィールドサイトから車ですぐの範囲内で利用できない場合、サンプルを得るためのいくつかのオプションがあります。これには、別のソースを使用して銅ブロックを冷却したり、植物全体と周囲の土壌を大きなPVCリングで発掘したり、これをガス不浸透性材料に入れたり、保存のために最寄りの液体窒素源に輸送したりすることが含まれます。このためには、根球試料を得る前に、植物の芽が根から切り離されないようにすることが重要です。必要に応じて、サンプルを冷凍の下に置き、保存のために実験室に一晩出荷することができます。実験室で受け取られると、セクションは液体窒素冷却銅ブロックを使用して保存することができる。最後に、湿地土壌や根層圏の保存方法で種分化の変化が可能です。これを避けるために、サンプルを得て、すぐにスラム凍結するか、酸素への暴露を避けるために上記のように他の手段を取る必要があります。凍結乾燥サンプルの端は、酸素へのより高い暴露を持っていた可能性のあるエッジを避けるために剃ることができます。根および根球試料中の還元ヒ素種の保存(図1D、E)および前の研究²⁸では、このスラム凍結技術は、慎重に行えば酸素感受性の化学種を保存することができることを示唆している。

この方法は、根圏科学のいくつかの重要な問題に対処するために使用することができます。これらには、FeまたはMnプラークとの汚染物質および栄養素の相互作用を含む可能性のある根球における栄養素および汚染物質相互作用の研究に関連するアプリケーションが含まれる。この方法は、植物と土壌の関係の時間的および空間的不均一性の研究と、根型の形態がその場の根圏の元素とどのように相互作用するかを調べることができる。米によるヒ素の取り込み、根圏の栄養力学、湿地への金属(loid)取り込みなどの植物性に関連する用途など、食品の安全性に関するアプリケーションで使用できます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper blocks	McMaster Carr	89275K42
Diamond blade	Buehler	15 LC, 102 mm x 0.3 mm	operation speed: 225 rpm
Epoxy forms	Struers	40300085	FixiForm
Epoxy	Epotek	301-2FL
Superglue	Loctite	404
Thin sectioning machine	Buehler	PetroThin
Wet saw	Buehler	IsoMet 1000