Summary
우리는쌀(Oryza sativa L.)을 모형 종으로 사용하여 습지 환경에서 온전한 뿌리와 주변 의체 토양을 시료, 보존 및 섹션화하는 프로토콜을 설명합니다. 일단 보존되면, 시료는 싱크로트론 X선 형광(XRF) 화학적 분석 영상과 같은 원소 이미징 기술을 사용하여 분석될 수 있다.
Abstract
뿌리는 토양 환경과 광범위하게 상호 작용하지만 뿌리와 주변 뿌리 권 사이의 상호 작용을 시각화하는 것은 도전적입니다. 습지 식물의 뿌리 권 화학 은 뿌리에서 대량 토양에 가파른 산소 그라데이션 때문에 캡처특히 도전이다. 여기서 는 슬램 동결 및 동결 건조를 통해 습지 식물의 뿌리 구조와 뿌리 권 화학을 효과적으로 보존하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 액체 질소로 미리 냉각된 구리 블록 사이에 시료가 동결되는 슬램 동결은 화학 적 분석 변화를 최소화하면서 플래시 동결로 발생할 수있는 뿌리 손상 및 샘플 왜곡을 최소화합니다. 샘플 왜곡은 여전히 가능하지만, 비용을 최소화하면 여러 샘플을 신속하게 얻을 수 있는 능력이 만족스러운 샘플을 얻을 수 있는 잠재력을 증가시키고 이미징 시간을 최적화합니다. 데이터는 이 방법이 철 플라크와 관련된 쌀 뿌리와 뿌리 줄기권에서 감소 된 비소 종을 보존하는 데 성공한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 미량 원소 사이클링에서 식물 치료 응용 프로그램에 이르기까지 농도 범위에 걸쳐있는 다양한 습지 환경에서 식물 토양 관계의 연구를 위해 채택 될 수있다.
Introduction
뿌리와 뿌리는 동적, 이질성, 식물이 미네랄 영양소와 오염 물질을 얻는 방법을 이해하는 데 매우 중요합니다1,2,3. 뿌리는 영양분(예를 들어, 인) 및 오염물질(예를 들어, 비소)이 토양에서 식물로 이동하여 이 과정을 이해하는 것이 식품량과 품질, 생태계 기능 및 식물 치료에 영향을 미치는 주요 경로입니다. 그러나, 뿌리는 영양 취득 요구에 대응하여 성장하는 공간과 시간에 역동적이며, 종종 기능, 직경 및 구조(예를 들어, 측면 뿌리, 출현 뿌리, 뿌리)2. 루트 시스템의 이질성은 세포에서 생태계 수준으로 공간 적 척도와 시간당에서 디칼까지의 시간적 척도에서 연구할 수 있습니다. 따라서 뿌리와 주변 토양 또는 뿌리권의 동적이고 이질적인 특성은 시간이 지남에 따라 뿌리 권 화학을 포착하는 데 어려움을 겪습니다. 이 도전에도 불구하고, 이 중요한 식물 토양 관계를 특성화하기 위해 토양 환경에서 뿌리를 연구하는 것이 필수적입니다.
습지 식물의 뿌리 권 화학 때문에 공간과 시간의 변화 뿌리에 대량 토양에서 존재하는 가파른 산소 그라데이션의 조사를 특히 도전한다. 뿌리는 호흡산소가 필요하기 때문에 습지 식물은4,5를생성하여 습지 토양의 낮은 산소 조건에 적응했다. Aerenchyma는 싹에서 뿌리까지 확장되는 속이 빈 피질 조직으로 식물을 통해 뿌리를 통해 공기가 확산될 수 있습니다. 그러나, 이 공기중 일부는 뿌리의 덜 구불 한 부분에서 뿌리의 덜 구불 한 부분에서 뿌리로 누출 특히 측면 루트 접합, 덜 성숙한 루트 팁 및 신장 영역6,7,8,9. 이러한 방사형 산소 손실은 습지 식물의 뿌리 부각에 산화된 영역을 생성하여 뿌리근구(bio-geo) 화학에 영향을 미치고 감소된 벌크토양(10,11,12)과구별된다. 습지 뿌리 부각과 뿌리에서 영양분과 오염 물질의 운명과 수송을 이해하기 위해 화학적으로 감소 된 대량 토양, 산화 된 뿌리 권, 분석을 위한 습지 식물의 뿌리를 보존하는 것이 중요합니다. 그러나, 벌크 토양은 산소에 민감한 감소 된 토양 성분을 포함하기 때문에, 뿌리 및 토양 보존 방법은 뿌리 구조를 보존하고 산소에 민감한 반응을 최소화해야합니다.
식물 조직을 고치고 이미징을 위한 초구조를 보존하는 방법은 존재하지만, 이러한 방법은 습지 토양에서 자라는 뿌리를 화학적으로 보존하기 위해 적용될 수 없습니다. 식물 세포 내의 원소 분포만 원하는 조사를 위해 식물은 일반적으로 수력으로 재배되고 뿌리는 용액에서 쉽게 제거될 수 있으며, 고압 동결 및 동결 치환하에서 고정되어 고해상도 이차 이온 질량 분석법(nanoSIMS), 전자 현미경 검사, 싱크로트론 X선 형광(SRF)을 포함한 다양한 이미징 응용 분야에 대해 단면화될 수 있습니다. 14,15. 습지 뿌리 의 외부에 Fe 플라크를 조사하기 위해, 이러한 수경 연구는 인위적으로 솔루션16에서Fe 플라크 형성을 유도해야 하며, 이는 태아 플라크 형성 및 관련 원소의 분포 및 광물 조성의 이질성을 정확하게 나타내지 않는17,18,19,20. 습지 토양 및 관련 미생물을동결-코링(21)으로보존하는 방법이 존재하지만, 이 기술로 뿌리를 얻기는 어렵다. 토양에서 자라는 뿌리와 그 류강포화학을 시각화하는 현재의 방법은 원소 플럭스와 총 원소 농도(및 표본)의 두 가지 기본 측정 유형으로 구성됩니다. 전자는 전형적으로 토양이 체형 층으로 확산되는 실험실 설정 및 비핵 원소에서 식물 성장을 지원하기 위해 뿌리 줄기상자에 토양을 배치하는 박막(DGT)22,23,24에서확산 그라데이션을 사용하여 측정된다. 그런 다음 이 바인딩 레이어를 이미지하여 관심 있는 음순 요소를 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 뿌리와뿌리 권구(24,25,26,27)사이의 관계를 성공적으로 설명할 수 있지만 뿌리 경계에서 나온 유물은 뿌리 뿌리 상자에서 식물을 재배하여 존재할 수 있으며, 뿌리 내부에 대한 정보는 DGT로 캡처되지 않는다. 후자는 뿌리와 뿌리 부류의 샘플링, 샘플을 보존하고 샘플 섹션의 원소 분포를 직접 분석하는 것을 포함한다. 습지 식물 뿌리와 주변 뿌리의 환경 샘플링을 위해 시료 준비에서 유물을 피하기 위해 신중한 샘플 처리가 필요합니다.
여기서 는 습지 식물의 뿌리 구조와 뿌리 권 화학을 효과적으로 보존하여 건조를 동결하고 동결시키는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 플래시 동결은 산소에 민감한 솔루트의 변형을 크게 늦출 수 있지만 뿌리를 손상시킬 수 있으며 샘플이 건조될 때 동원될 수 있습니다. 그러나 액체 질소로 미리 냉각된 구리 블록 사이에 시료가 동결되는 슬램 동결은 뿌리 손상과 샘플왜곡(28)을최소화한다. 보존된 견본은 그 때20,29로 보존하고 그들의 뿌리의 화상 진찰을 위해 절단되고 연마될 수 있는 에폭시 수지에 내장됩니다. 이 보고서의 샘플은 얇은 단면 후 S-XRF 화학 적 분석 이미징에 의해 분석되었다. 그러나 레이저 절제-유도 결합 된 플라즈마 질량 분광법 (LA-ICP-MS), 입자 유도 X 선 방출 (PIXE), 이차 이온 질량 분광법 (SIMS), 레이저 유도 고장 분광법 (LIBS) 이미징을 포함하여 다른 이미징 기술이 사용될 수 있습니다.
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Protocol
1. 슬램 동결 장비 준비
- 액체 질소를 담을 수 있는 깨끗한 쿨러 내부에 구리 블록 2개(~5cm x 5cm x 15cm)를 수평으로 놓고 블록을 침수하기에 충분한 액체 질소를 붓습니다. 버블링이 가라앉으면 각 끝에 두 개의 스페이서를 하나의 구리 블록 위에 놓습니다.
참고: 스페이서 높이는 동결할 샘플의 높이를 결정합니다. 이 예제에서는 2cm 스페이서를 사용하여 큐브약 3cm x 3cm x 2cm를 만듭니다. 액체 질소의 부피는 쿨러 크기에 따라 달라집니다. 이 예제에서는 약 1 L을 사용하여 약 5개의 큐브를 연중합니다.
주의: 액체 질소가 극저온및 질식제이기 때문에 적절한 개인 보호 장비와 환기를 사용하십시오. - 집게와 극저온 장갑을 사용하여 샘플이 제자리에 있을 때 검색이 더 쉬워지도록 끝에 있는 다른 구리 블록을 일어서십시오.
2. 샘플 수집 및 슬램 동결
- 삽을 사용하여 습식 토양에서 원하는 식물과 뿌리 줄기구를 추출하고 파고 구멍이 원하는 뿌리 부피보다 훨씬 큰지 확인합니다. 토양을 놓고 식물을 용기에 넣고 벤치탑에 놓습니다.
참고: 냄비 연구에서 온화토양과 식물 전체를 사용할 수도 있습니다. - 뿌리를 취해야 할 토양 위치(즉, 촬영에 대한 깊이 및 근접)를 결정합니다. 강철 블레이드를 사용하여 여분의 토양을 잘라 원하는 지역의 토양을 방해하지 않도록주의하십시오. 원하는 영역에 도달하면 약 3cm x 3cm x 2cm의 루트 "큐브"를 자르고 즉시 수평 구리 블록에 두 스페이서 사이에 큐브를 놓습니다. 극저온 장갑을 사용하여 수직 구리 블록을 집어 들고 스페이서 위에 올려 뿌리 줄기 큐브를 슬램 동결시합니다.
- 버블링이 가라 앉은 후(~5분) 구리 블록에서 슬램 냉동 뿌리권 큐브를 회수하고 미리 표지된 알루미늄 호일 사각형 내부를 감싸세요. 원하는 경우 호일에 블록의 방향을 표시합니다. -80°C 냉동고에 보관할 때까지 액체 질소의 두 번째 용기에 넣습니다.
- 필드 사이트 또는 실험에서 원하는 루트 큐브 수를 얻으려면 필요에 따라 반복합니다. 두 구리 블록 모두 시료 간에 냉각할 수 있는 시간이 주어집니다.
3. 동결 건조 및 포함 된 뿌리 줄기 큐브
- 제조업체의 지시에 따라 동결 건조기를 준비합니다. -80°C 냉동고에서 샘플을 제거하기 전에 적절한 진공 압력과 온도를 획득했는지 확인하십시오.
- 동결 건조기는 샘플을 받을 준비가 되면, 깨끗하고 산세척된 50mL 튜브 안에 냉동 된 뿌리 권 큐브 1 개를 넣고 깨끗한 일회용 물티슈로 느슨하게 덮습니다. 고무 밴드로 닦아 고정하십시오. 필요에 따라 반복하여 튜브당 큐브 1개를 확인합니다.
참고: 샘플이 튜브에 너무 큰 경우 알루미늄 호일을 샘플 홀더로 사용하여 동결 건조기 용기에 직접 배치할 수 있습니다. - 동결 건조기 용기에 샘플이 들어있는 튜브를 놓고 며칠 동안 건조하십시오. 정확한 건조 시간은 토양 특성에 따라 달라집니다.
참고: 건조된 샘플을 동결 건조기 또는 건조기에 보관하여 재수화를 방지합니다. - 강철 블레이드를 사용하여 말린 토양 큐브를 크기로 잘라 원하는 형태로 맞도록 하십시오(예: 직경 25mm 형태는 대부분의 용도에 적합). 각 양식에 레이블을 지정하고 토양 큐브를 양식에 배치하고 양식을 진공 건조기 내부에 배치합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 에폭시를 준비하십시오. 선택한 에폭시가 오염되지않고 원하는 요소(20,29,30)의표본 변경을 일으키지 않는지 확인한다.
- 드롭퍼를 사용하여 토양의 한쪽에 에폭시를 추가하여 샘플을 완전히 덮을 때까지 합니다. 에폭시가 토양을 적시면서 토양은 색으로 어두워집니다.
참고: 토양의 공기가 빠져나도록 에폭시를 천천히 추가합니다. - 형태가 에폭시로 채워지면 진공 건조기와 진공 시세이터를 닫습니다. 토양에 갇힌 공기의 양에 따라, 더 많은 에폭시를 주기적으로 양식에 추가해야 할 수도 있습니다. 처음 1-4 h에 대해 30-90분마다 에폭시의 수준을 확인하고 필요에 따라 에폭시를 추가하십시오.
- 에폭시가 경화되면 양식에서 샘플을 제거합니다(~5일).
4. 뿌리 줄기 구체 큐브절단 및 단면
- 다이아몬드 블레이드 정밀 젖은 톱을 사용하여 샘플을 잘라. 이전 컷에서 뿌리가 얻어지지 않으면 다른 위치에서 샘플을 잘라냅니다.
- 수동으로 잘라낸 시료를 ~30s의 절단 측에 점진적으로 미세한 사포(예: 220, 500, 1000 및 1500 그루트)로 모래를 비운다.
- LA-ICP-MS와 같은 기술을 사용하여 샘플의 표면 이미징을 수행합니다.
참고: S-XRF에 대한 얇은 섹션을 준비하려면 샘플을 얇은 섹션(단일 또는 이중 연마)을 준비할 수 있는 회사로 보내거나 아래에 설명된 대로 4.4 -4.6단계를 따릅니다. - 원하는 샘플 측면을 슈퍼 접착제를 사용하여 석영 슬라이드에 접착제와 하룻밤 치료 할 수 있습니다.
- 얇은 단면 기계를 사용하여 슬라이드에서 토양을 2mm 두께로 자른 다음 원하는 두께 (일반적으로 30 μm)로 갈아냅니다. 원하는 경우 샘플 표면을 연마할 수 있습니다.
- 섹션의 S-XRF 이미징을 수행합니다. 원하는 싱크로트론 시설 및 빔라인에서 적절한 단계를 수행하여 이미징 시간을 적용하고 활용합니다.
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Representative Results
이 방법은 습지 식물의 뿌리와 뿌리 줄기권과 대량 토양에 뿌리와 화학 종의 보존을 허용합니다. 이 작품에서, 상기 방법은 쌀의 뿌리근면에서 Fe 및 Mn 산화물 및 식물 영양소와 함께 분화 및 공동 국소화로서 평가하기 위해사용되었다(Oryza sativa L.). 쌀은 델라웨어 대학의 RICE 시설에서 재배되었으며, 30개의 논 메소코솜(각 2m x 2m, 49식물)은 쌀곡물로 섭취하는 것을 목표로 다양한 토양 및 수자원 관리 조건에서 쌀을 재배하는 데 사용됩니다. 이 실험은 1470개의 개별 식물을 제공했으며, 이 식물은 성장 하는 계절 에 걸쳐 뿌리 줄기를 샘플링 할 수 있습니다.
충분한 수의 샘플을 감안할 때 얇은 섹션은 다양한 루트 형태를 캡처할 수 있었습니다. 도 1A는 토양 매트릭스 내에 있는 여러 루트 직경을 가로 단면으로 나타낸다. 그러나 일부 토양 섹션에는 뿌리가 거의 포함될 수 있습니다. 이 작품에서는 63개의 토양 블록을 습식 톱에 한 번 절단하여 얇은 단면에 적합한 시료의 하위 집합을 결정하였다. 63개의 샘플 중 14개에는 뿌리가 없고, 31개뿌리는 1-3개, 뿌리 는 18개 이상이 포함되어 있다. 뿌리는 다양한 수준의 품질에 존재할 수 있습니다. 도 1B는 잘 보존된 뿌리, 동결 건조 공정에 의해 왜곡된 뿌리 및 얇은 단면화 과정에서 뽑아낸 루트를 나타낸다.
루트 씬 섹션은 관심 요소의 위치를 매핑하기 위해 S-XRF를 사용하여 분석되었다. 도 2B는 세로 절개 섹션의 측면 루트가 있는 루트 횡방향 섹션을 보여 주어 있습니다. 도 2C는 Fe, Mn 및 As의 삼색 플롯으로 XRF에 의해 분석된 이 루트 섹션을 보여줍니다. Fe는 토양에 존재하며 Fe 플라크의 뿌리를 둘러싸고 있으며, Fe 플라크는 가벼운 현미경 이미지에서도 볼 수 있습니다. 망간은 측면 뿌리의 피질에 유일하게 존재하지만, 또한 녹색 파란색 색조로 나타나는 Fe 플라크의 일부 영역에서 Fe와 공동 찾습니다. 비소는 주로 측면 뿌리의 혈관에 존재했다, 기본 뿌리의 혈관으로 병합.
화학적 스펙션 이미징은 여러 인시던트 빔 에너지에서 반복된 XRF 맵을 복용하고 표준XANES 스펙트럼에 피팅하는 선형 조합을 사용하여 다양한 관심 종을 분리시켰다. As speciation 맵은 도 2D에 표시되며 종별 의 국소화에서 가변성을 표시합니다. 도 2E는 삼색 플롯과 동일한 데이터를 나타낸다. 삼색 플롯은 혈관에 밀접하게 연관된 아르세니트와 아르세니테 글루타티온을 보여주며, 아상원은 주로 Fe 플라크와 관련된 뿌리의 외부에 위치하고 있습니다.
도 1 - 쌀 뿌리 얇은 섹션은 실티 loam 토양에서 다양한 방법론적 결과를 보여 주며(스케일 바는 0.5 mm). A)수많은 다른 루트 직경 단면 (흰색 상자에)이 분명하다. B)뿌리는 과정에서 손상될 수 있습니다. 흰색 상자의 뿌리는 그대로 원형으로 유지되었으며, 동결 건조 과정에서 주황색 상자의 루트가 압축되었습니다. 빨간색 상자에는 얇은 단면 화 과정에서 루트가 뽑은 위치를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 - 쌀 뿌리의 횡단 구간은 실티 로암 토양에서 측면 뿌리의 세로 절을 가진다. A)흰색 상자에 여러 루트 횡방향 섹션을 보여주는 토양 섹션. 흰색 화살표는 세로 섹션을 나타냅니다. 스케일 바는 2mm. B)패널 A. 화이트 사각형의 왼쪽 상단 모서리에서 루트를 보여주는 토양 섹션은 싱크로트론 XRF에 의해 이미지 영역을 나타냅니다. 스케일 바는 0.5mm C)비소(레드), 철(녹색), 망간(파란색)의 삼색 XRF 이미지입니다. As, Fe 및 Mn의 최대 척도는 1:50:2.5의 비율입니다. 스케일 바는 100 μm. D)아르세닉 XRF 스펙션 맵은 아르세니트 글루타티온, 아르세니트, 아르상원용, 따뜻한 색상이 100μm. E)삼색 플롯의 농도가 높기 때문에 최대 강도가 아르세니트(red) = 아르상원(녹색) =0.5)로 확대된다. 스케일 바는 100 μm입니다.
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Discussion
이 논문은 원소 이미징 및/또는 화학 적 분석 매핑에 사용할 수있는 슬램 동결 기술을 사용하여 습지 식물 뿌리의 보존 된 벌크 토양 + 뿌리 줄기를 얻는 프로토콜을 설명합니다.
기존 메서드에 비해 이 메서드의 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, 이 방법은 뿌리와 주변 뿌리권에 대한 동시 조사를 허용한다. 현재 토양을 씻어내고뿌리(31,32)를 보존하거나 인공 환경(예를 들어, 뿌리 뿌리 상자)에서 식물을 재배하고 DGT 방법을 사용하여 뿌리 자체를 관찰할수 있는 능력이 없는 토양 환경에서 뿌리를 보존하고 화학적으로 이미지화하는 방법이존재하고 있다. 여기에 설명된 방법은 뿌리 토양 관계의 관찰을 위해 그 자리에서 뿌리와 주변 뿌리 권구 토양의 직접 조사를 허용한다. 유사한 기술은 시투 쌀 뿌리와 주변 뿌리에서 검사하는 데 사용되었지만 샘플을 액체 질소11,35,36으로 급락하여 여기에 설명된 슬램 동결이 아닌. 조직이 더 빨리 얼어 붙을수록 얼음 결정37을형성할 가능성이 줄어듭니다. 미리 냉각된 구리 블록 간의 슬램 동결은 시료를 빠르게 냉각시키고, 따라서 주변 온도11,38에서액체 질소를 사용하여 플래시 동결로 발생할 수있는 얼음 결정 및 후속 식물 조직 손상의형성을최소화합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하여, 여러 샘플은 동일한 식물, 필드에서 여러 식물 및/또는 비교적 짧은 기간에 환경에서 채취될 수 있다. 일단 얻어지면 많은 샘플을 동결 건조하고 에폭시에 내장하고 최소한의 비용으로 다이아몬드 블레이드 젖은 톱으로 절단 할 수 있습니다. 이러한 샘플은 경현미경으로 조사하여 직접 적으로 이미지화될 수 있는 유망한 샘플(예를 들어, LA-ICP-MS) 또는 얇은 단면 및 sXRF 이미징을 위해 더 이상 처리될 수 있습니다. 하나의 얇은 단면은 이질적인 뿌리 근위권을 포착하고 기기에서 이미징 시간을 최대화하는 데 도움이 되는 동일한 슬라이드에서 다양한 크기의 여러 뿌리를 캡처할 수 있습니다. 이 방법은 또한 뿌리 부각을 방해하지 않고 Fe 플라크에서 격리와 같은 식물 토양 관계를 직접 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 수경 실험을 이용하여 쌀과 같은 습지 뿌리에 Fe 플라크 형성을 유도하는 기존 방법은토양재배 식물11,18,20,42,43,44에서발생하는 뿌리 커버리지 및 광물 조성물의 관점에서 Fe 플라크의 이질성을포착하지 못한다.
메서드가 성공하려면 몇 가지 주요 단계를 따르는 것이 중요합니다. 먼저 선택한 샘플 위치와 방향이 원하는 질문을 해결하도록 합니다. 둘째, 미량 원소 오염이 없고 관심 요소의 화학적 표본을 보존하기 위해 표시된 에폭시를 사용하여20,29,30. 셋째, 에폭시를 천천히 추가하고 시료의 에폭시 습윤을 용이하게 하고 갇힌 가스의 제거를 용이하게 하기 위해 용진공 아래에 에폭시에 샘플을 배치한다. 다음 단계는 이미지 분석에 사용할 수있는 벌크 토양, 뿌리 및 뿌리의 고품질 샘플을 제공합니다.
메서드의 몇 가지 제한 사항은 고려해야 합니다. 첫째, 동결 건조기에서 냉동 시료를 건조하면 토양의 변형이 발생할 수 있으며 뿌리에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 점토 함량이 높고 따라서 점토가 건조로 붕괴에 대한 경향이 토양에서 특히 어려울 가능성이 높습니다. 예를 들어, 실티 점토로부터 얻은 쌀 뿌리권 샘플이 제조되었고 토양의 균열이 명백한 반면 Fe 플라크 코팅 쌀 뿌리는 영향을 받지않습니다(도 3).
그림 3 - 쌀 뿌리 얇은 부분에서 실티 점토 논 토양. 토양에 수많은 균열이 동결 건조 하는 동안 발생 했습니다., 하지만 이러한 균열 은 흰색 사각형에 의해 묘사 되는 측면 루트 세로 섹션을 왜곡 하지 않았다. 스케일 바는 0.5mm입니다.
데이터는 이 기술이 실트롬(그림 2, 3)에서미크로네 스케일 정보를 성공적으로 얻을 수 있음을 보여주며, 거친 질감토양에서 기술이 성공할 수 있음을 보여준다. 그러나 점토 함량이 높은 토양은 어려움을 겪을 수 있으며 추가 조사를 받아야 합니다. 둘째, 뿌리는 단면에 토양에서 뽑아낼 수 있습니다. 이 문제는 이 백서에 설명된 프로토콜에 만국한되지 않지만 고려해야 합니다. 셋째, 뿌리는 모든 토양 큐브에 존재하지 않을 수 있으므로 원하는 식물의 뿌리 근위를 포착하기 위해 많은 샘플을 획득하고 절단해야합니다. 넷째, 보존 방법은 원격 필드 연구에 어려움을 초래할 수 있는 액체 질소를 필요로 합니다. 여기서 프로토콜은 액체 질소 드와르에서 2 마일 미만인 현장에서 성공적으로 사용되었습니다. 그러나 원격 필드 사이트에서 짧은 드라이브 내에서 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 샘플을 얻기 위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 여기에는 다른 소스를 사용하여 구리 블록을 냉각하거나 대형 PVC 링으로 전체 식물과 주변 토양을 발굴하고, 이를 가스 침투성 물질로 배치하고, 보존을 위해 가장 가까운 액체 질소 원으로 운반하는 것이 포함됩니다. 이를 위해, 식물 싹이 뿌리에서 절단되지 않았는지 확인하는 것이 중요하다. 필요한 경우 샘플을 냉장 보관하고 보존을 위해 실험실로 하룻밤 배송될 수도 있습니다. 실험실에서 접수되면 액체 질소 냉각 구리 블록을 사용하여 섹션을 보존 할 수 있습니다. 마지막으로, 습지 토양과 뿌리 줄기의 보존 방법으로 투기 변화가 가능합니다. 이를 방지하기 위해, 시료를 얻을 수 있어야 하고 산소에 노출을 피하기 위하여 위와 같이 취한 그밖 조치를 빨리 또는 때리기 위하여 동결되어야 합니다. 동결 건조 시료의 가장자리는 산소에 더 높은 노출이 있을 수 있는 가장자리를 피하기 위해 면도할 수 있습니다. 근루 및 뿌리 근위권 샘플에서 감소된 비소종의보존(도 1D,E)및 전작(28)에서는 이러한 슬램 동결 기술이 신중하게 수행될 경우 산소에 민감한 화학종을 보존할 수 있음을 시사한다.
이 방법은 뿌리 부계 과학의 몇 가지 주요 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이들은 Fe 또는 Mn 플라크를 가진 오염 물질 및 양분의 상호 작용을 포함할 수 있는 뿌리 부류에 있는 양분 그리고 오염 물질 상호 작용을 연구하는 것과 관련있는 응용프로그램을 포함합니다. 이 방법을 통해 식물 토양 관계의 시간적 및 공간 이질성에 대한 연구와 뿌리 형태가 시상계의 뿌리 근위권 원소와 상호 작용하는 방법에 대한 검사를 할 수 있습니다. 쌀에 의한 비소 섭취, 뿌리줄기내의 영양역학, 또는 습지 식물로의 금속(loid) 조리와 같은 식물레밍과 관련된 응용과 같은 식품 안보와 관련된 응용 분야에서 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 델라웨어 대학과 브룩헤이븐 국립 연구소 사이의 협력을 지원하기 위해 세이퍼스와 타페로에 공동 종자 보조금을 인정합니다. 이 연구의 일부는 국가 싱크로트론 광원 II의 XFM (4-BM) 빔 라인을 사용, 미국 에너지부 (DOE) 과학 사용자 시설의 사무실은 계약 번호에서 브룩 헤이븐 국립 연구소에 의해 과학의 DOE 사무실을 위해 운영. DE-SC0012704.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
References
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