Summary
Örnek bir tür olarak pirinç(Oryza sativa L.) kullanarak sulak alanlardan bozulmamış kökleri ve çevresindeki rizosfer toprağını örnekleme, koruma ve bölümleme protokolünü açıklıyoruz. Numune korunduktan sonra senkrotron X-ışını floresan (XRF) kimyasal spektrasyon görüntüleme gibi elementel görüntüleme teknikleri kullanılarak analiz edilebilir.
Abstract
Kökler toprak ortamlarıyla yoğun bir şekilde etkileşime girer, ancak kökler ve çevresindeki rizosfer arasındaki bu tür etkileşimleri görselleştirmek zordur. Sulak alan bitkilerinin rizosfer kimyasının, köklerden dökme toprağa dik oksijen gradyanları nedeniyle yakalanması özellikle zordur. Burada, sulak alan bitkilerinin kök yapısını ve rizosfer kimyasını çarpma ve dondurarak kurutma yoluyla etkili bir şekilde koruyan bir protokol açıklanmaktadır. Numunenin sıvı azotla önceden soğutulan bakır bloklar arasında dondurulduğu slam-freeze, kimyasal belirtim değişikliklerini en aza indirirken flaş dondurma ile oluşabilecek kök hasarını ve numune bozulmasını en aza indirir. Numune bozulması hala mümkün olsa da, birden fazla numuneyi hızlı ve minimum maliyetle elde etme yeteneği, tatmin edici örnekler elde etme potansiyelini artırır ve görüntüleme süresini optimize eder. Veriler, bu yöntemin pirinç köklerinde ve demir plaklarla ilişkili rizosferlerde azaltılmış arsenik türlerini korumada başarılı olduğunu göstermektedir. Bu yöntem, iz elementli bisiklet sürmeden fitokilatasyon uygulamalarına kadar konsantrasyon aralıklarını kapsayan çok çeşitli sulak alan ortamlarında bitki-toprak ilişkilerinin çalışmaları için benimsenebilir.
Introduction
Kökler ve rizosferleri dinamik, heterojen ve bitkilerin mineral besin maddelerini ve kirleticileri nasıl elde ettiğini anlamak için kritik öneme sahiptir1,2,3. Kökler, besin maddelerinin (örneğin fosfor) ve kirleticilerin (örneğin arsenik) topraktan bitkilere taşındığı ve böylece bu sürecin anlaşılmasının gıda miktarı ve kalitesi, ekosistemin işleyişi ve fitoremediasyon üzerinde etkileri olduğu birincil yoldur. Bununla birlikte, kökler besin edinme ihtiyaçlarına yanıt olarak büyüyen uzay ve zamanda dinamiktir ve genellikle işlev, çap ve yapı bakımından değişirler (örneğin, yanal kökler, maceracı kökler, kök kılları)2. Kök sistemlerinin heterojenliği hücreselden ekosistem seviyesine kadar mekansal ölçeklerde ve saatlikten dekadale kadar zamansal ölçeklerde incelenebilir. Bu nedenle, köklerin ve çevresindeki toprakların dinamik ve heterojen doğası veya rizosfer, zaman içinde rizosfer kimyasını yakalamak için zorluklar oluşturur. Bu zorluğa rağmen, bu kritik bitki-toprak ilişkisini karakterize etmek için toprak ortamlarındaki kökleri incelemek zorunludur.
Sulak alan bitkilerinin rizosfer kimyası, kütle toprağından köklere kadar uzay ve zamanda değişen dik oksijen gradyanları nedeniyle araştırılması özellikle zordur. Köklerin solunum için oksijene ihtiyacı olduğundan, sulak alan bitkileri aerenchyma4,5oluşturarak sulak alan topraklarının düşük oksijen koşullarınaadapteolmuşlardır. Aerenchyma, sürgünlerden köklere uzanan, bitkiden köklere havanın yayılmasına izin veren içi boş kortikal dokulardır. Bununla birlikte, bu havanın bir kısmı, köklerin daha az bastırılmış kısımlarında, özellikle yanal kök kavşaklarının yakınında, daha az olgun kök uçlarında ve uzama bölgelerinde rizosfere sızar6,7,8,9. Bu radyal oksijen kaybı, sulak alan bitkilerinin rizosferinde rizosfer (biyo-jeo)kimyasını etkileyen ve azaltılmış dökme toprak10 , 11,12'denfarklı bir oksitlenmiş bölge oluşturur. Sulak alan rizosferleri ve köklerindeki besin maddelerinin ve kirleticilerin kaderini ve taşınmasını anlamak için, kimyasal olarak azaltılmış dökme toprağın, oksitlenmiş rizosferin ve sulak alan bitkilerinin köklerinin analiz için korunması önemlidir. Bununla birlikte, dökme toprak oksijene duyarlı azaltılmış toprak bileşenleri içerdiğinden, kök ve toprak koruma yöntemleri kök yapılarını korumalı ve oksijene duyarlı reaksiyonları en aza indirmelidir.
Bitki dokularını düzeltmek ve görüntüleme için ultrayapıyı korumak için yöntemler vardır, ancak bu yöntemler sulak alanda yetişen kökleri kimyasal olarak korumak için uygulanamaz. Sadece bitki hücreleri içindeki element dağılımının istendiği incelemeler için, bitkiler tipik olarak hidroponik olarak yetiştirilir ve kökler çözeltiden kolayca çıkarılabilir, yüksek basınçlı dondurma ve donma ikamesi altında sabitlenebilir ve yüksek çözünürlüklü ikincil iyon kütle spektrometresi (nanoSIMS), elektron mikroskopisi ve senkrotron X-ışını floresan (S-XRF) analizi13dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme uygulamaları içinbölümlenebilir. 14,15. Sulak alan köklerinin dışındaki Fe plaklarını araştırmak için, bu topraksız çalışmalar yapay olarak Fe plak oluşumunu teşvik etmelidir Çözelti16Fe plak oluşumunun dağılımının ve mineral bileşiminin heterojenliğini doğru bir şekilde temsil etmeyen17 , 18,19,20. Sulak alan toprağını ve buna bağlı mikroorganizmaları dondurarak korumak için yöntemler vardır21, ancak bu teknikle kök elde etmek zordur. Toprakta yetişen kökleri ve rizosferik kimyalarını görselleştirmek için mevcut yöntemler iki birincil ölçüm türünden oluşur: elemental akılar ve toplam element konsantrasyonu (ve speciation). Birincisi tipik olarak ince filmlerdeki (DGT)22 , 23,24'tekidifüzif gradyanlar kullanılarak ölçülür, burada toprak bir laboratuvar ortamında bitki büyümesini desteklemek için rhizobox'lara yerleştirilir ve topraktaki labile elemanları bir jel yoluyla bağlayıcı bir katmana yayılır. Bu bağlama katmanı daha sonra ilgi çekici labile öğelerini ölçmek için görüntülenebilir. Bu teknik, kökler ve rizosfer24 , 25,26,27arasındaki ilişkileri başarıyla gösterebilir, ancak kök sınırlayıcı eserler rhizobox'larda bitki yetiştirerek bulunabilir ve kök iç kısmı hakkındaki bilgiler DGT ile yakalanmaz. İkincisi, köklerin ve rizosferin örneklemini, numunenin korunmasını ve örnek bir bölümdeki elementel dağılımın doğrudan analizini içerir. Sulak alan bitki köklerinin ve çevresindeki rizosferin bu çevresel örneklemesi için, numune hazırlamadan elde edilen eserleri önlemek için dikkatli numune işleme gereklidir.
Burada, sulak alan bitkilerinin kök yapılarını ve rizosfer kimyasını çarpma ve dondurarak kurutma yoluyla etkili bir şekilde koruyan bir protokol açıklanmaktadır. Flaş dondurma, oksijene duyarlı solutların dönüşümlerini büyük ölçüde yavaşlatabilir, ancak köklere zarar verebilir ve numuneler kurudığında harekete geçirilmesine neden olabilir. Bununla birlikte, numunenin sıvı nitrojen ile önceden soğutulan bakır bloklar arasında dondurulduğu slam dondurma, kök hasarını ve numune bozulmasını en aza indirir28. Korunmuş numuneler daha sonra speciation20 , 29olarak koruyan verizosfer topraklarındaki köklerin görüntülenmesi için kesilip parlatılabilen bir epoksi reçineye gömülür. Bu rapordaki örnekler ince kesitleme sonrası S-XRF kimyasal spektrasyon görüntülemesi ile analiz edilmiştir. Bununla birlikte, lazer ablasyon-endüktif olarak birbirine bağlı plazma kütle spektrometresi (LA-ICP-MS), parçacık kaynaklı x-ışını emisyonu (PIXE), ikincil iyon kütle spektrometresi (SIMS) ve lazer kaynaklı çöküntü spektroskopisi (LIBS) görüntüleme dahil olmak üzere diğer görüntüleme teknikleri de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Çarpma donduran ekipmanın hazırlanması
- Sıvı nitrojen tutabilen temiz bir soğutucunun içine yatay olarak iki bakır blok (~5 cm x 5 cm x 15 cm) yerleştirin ve blokları batıracak kadar sıvı azot dökün. Köpürtücülük azaldığında, her iki ucundaki bir bakır bloğun üzerine iki ara parçası yerleştirin.
NOT: Aralayıcı yüksekliği, dondurulacak numunenin yüksekliğini belirler; Bu örnek, yaklaşık 3 cm x 3 cm x 2 cm küpler oluşturmak için 2 cm'lik bir aralayıcı kullanır. Sıvı nitrojenin hacmi daha soğuk boyuta bağlı olacaktır. Bu örnek, seri olarak yaklaşık 5 küp için yaklaşık 1 L kullanır.
DİkKAT: Sıvı nitrojen bir kriyojen ve bir boğulma olduğu için uygun kişisel koruyucu ekipman ve havalandırma kullanın. - Maşa ve kriyojenik eldivenler kullanarak, numune yerindeyken geri almayı kolaylaştırmak için ucundaki diğer bakır bloğu ayağa kaldırın.
2. Örnek toplama ve çarpma dondurma
- bir kürek kullanarak ıslak topraktan istenen bitkiyi ve rizosferi çıkarın ve kazılmış deliğin istenen kök hacminden çok daha büyük olduğundan emin olun. Toprağı ve bitkiyi bir kaba yerleştirin ve bir tezgah üzerine yerleştirin.
NOT: Bir saksı çalışmasından elde edilen tüm saksı toprağı ve bitki de kullanılabilir. - Köklerin alınacağı istenen toprak konumunu belirleyin (yani, sürgüne derinlik ve yakınlık). İstenilen alanda toprağı bozmamaya dikkat ederek çelik bir bıçak kullanarak fazla toprağı kesin. İstenilen alana ulaşıldığında, yaklaşık 3 cm x 3 cm x 2 cm kök "küp" kesin ve küpü hemen yatay bakır blok üzerindeki iki ara çubuğun arasına yerleştirin. Kriyojenik eldivenler kullanarak, dikey bakır bloğu alın ve rizosfer küpünü çarpmak için ara bileşenlerin üzerine yerleştirin.
- Köpürme azaldıktan sonra (~5 dk), bakır bloklardan donmuş rizosfer küpünü alın ve önceden etiketlenmiş bir alüminyum folyo karenin içine sarın. İsterseniz folyodaki bloğun yönünü işaretleyin. -80 °C'lik bir dondurucuda depolanınceye kadar ikinci bir sıvı azot kabına yerleştirin.
- Alan alanından veya denemeden istenen sayıda kök küp elde etmek için gerektiği gibi yineleyin. Her iki bakır bloğun da numuneler arasında soğuması için zaman verildiğine emin olun.
3. Rizosfer küplerini dondurarak kurutma ve gömme
- Dondurarak kurutucuyu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. -80 °C dondurucudan numuneleri çıkarmadan önce uygun vakum basıncını ve sıcaklığını elde ettiğine dikkat edin.
- Dondurarak kurutucu numune almaya hazır olduğunda, temiz ve asitle yıkanmış 50 mL tüpün içine bir donmuş rizosfer küpü yerleştirin ve temiz bir tek kullanımlık mendille gevşek bir şekilde örtün. Silme işlemini bir lastik bantla sabitleyin. Tüp başına bir küp sağlamak için gerektiği gibi tekrarlayın.
NOT: Numune bir tüp için çok büyükse, numune tutucu olarak alüminyum folyo kullanılarak doğrudan dondurarak kurutucu kabına yerlenebilir. - Numuneleri içeren tüpleri dondurarak kurutucu kaplara yerleştirin ve birkaç gün boyunca kurutun. Tam kuruma süresi toprak özelliklerine bağlı olacaktır.
NOT: Kurutulmuş numuneleri yeniden sulanmasını önlemek için dondurucuda veya bir kurutucuda saklayın. - Kurutulmuş toprak küplerini istenen forma sığacak şekilde kesmek için çelik bir bıçak kullanın (örneğin, 25 mm çapında form çoğu uygulama için idealdir). Her formu etiketleyin, toprak küplerini formlara yerleştirin ve formları bir vakum kurutucunun içine yerleştirin.
- Epoksiyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Seçilen epoksinin kontamine olmadığından ve istenen elemanların spesifikasyon değişikliklerine neden olmadığından emin olun 20,29,30.
- Numuneyi tamamen kaplayana kadar toprağın bir tarafındaki forma epoksi eklemek için bir damlalık kullanın. Epoksi toprağı ıslattıkça toprak renk olarak kararacak.
NOT: Topraktaki havanın kaçmasını sağlamak için epoksiyi yavaşça ekleyin. - Formlar epoksi ile doldurulduktan sonra vakum kurutucusunu kapatın ve vakumun açın. Toprağa sıkışan hava miktarına bağlı olarak, formlara periyodik olarak daha fazla epoksi eklenmesi gerekebilir. İlk 1-4 saat boyunca her 30-90 dakikada bir epoksi seviyesini kontrol edin ve gerektiğinde epoksi ekleyin.
- Epoksi sertleştikten sonra örneği formdan çıkarın (~5 gün).
4. Rizosfer küplerinin kesilmesi ve bölümlere kesilmesi
- Elmas bıçak hassasiyetinde ıslak testere kullanarak numuneyi kesin. Önceki kesimde kök elde edilirse numuneleri farklı yerlerde kesin.
- Kesilen numuneleri, kesim tarafında ~30 sn için kademeli olarak daha ince zımpara kağıdı (örneğin, 220, 500, 1000 ve 1500 kum) ile manuel olarak zımparalayın.
- LA-ICP-MS gibi teknikleri kullanarak örneklerin yüzey görüntülemesini gerçekleştirin.
NOT: S-XRF için ince bölümler hazırlamak için, numuneleri ince bölümleri (tek veya çift yan parlatma) hazırlayabilecek bir şirkete gönderin veya aşağıda açıklandığı gibi 4.4 - 4.6 adımlarını izleyin. - İstenilen numune tarafını süper tutkal kullanarak kuvars bir slayda yapıştırın ve bir gecede tedaviye izin verin.
- İnce bir kesit makinesi kullanarak, toprağı 2 mm kalınlıkta kaydıraklar üzerinde kesin ve ardından istediğiniz kalınlıkta (tipik olarak 30 μm) öğütün. İstenirse numune yüzeyi parlatılabilir.
- Bölümlerin S-XRF görüntülemesini gerçekleştirin. Görüntüleme süresine başvurmak ve kullanmak için istenen senkrotron tesisinde ve kiriş hattında uygun adımları izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, sulak alan bitkilerinin köklerinde ve rizosferinde ve dökme toprağa köklerin ve kimyasal türlerin korunmasına izin verir. Bu çalışmada yöntem, pirincin rizosferinde(Oryza sativa L.) Fe ve Mn oksitler ve bitki besin maddeleri ile spesifikasyon ve birlikte lokalizasyon olarak değerlendirilmek için kullanılmıştır. Pirinç, Delaware Üniversitesi'ndeki RICE Tesisinde, As ve Cd alımını pirinç tanesine düşürmek amacıyla çeşitli toprak ve su yönetimi koşullarında pirinç yetiştirmek için 30 pirinç çeltik mezokozmunun (her biri 2 m x 2 m, 49 bitki) kullanıldığı pirinç yetiştirildi. Bu deney, büyüme mevsimi boyunca rizosferlerin örneklenebileceği 1470 bireysel bitki sağladı.
Yeterli sayıda örnek verildiğinde, ince bölümler çeşitli kök morfolojilerini yakalayabildi. Şekil 1A, toprak matrisi içinde enine kesitler olarak bulunan birkaç kök çapını göstermektedir. Bununla birlikte, bazı toprak bölümleri varsa çok az kök içerebilir. Bu çalışmada, hangi numune alt kümesinin ince kesit için uygun olduğunu belirlemek için ıslak testere üzerinde 63 toprak blok işlendi ve bir kez kesildi. 63 numuneden 14'ü kök içermİyor, 31'i 1-3 kök, 18'i ise 3'ten fazla kök içeriyordu. Köklerin farklı kalite seviyelerinde bulunabileceğini unutmayın. Şekil 1B iyi korunmuş bir kök, dondurarak kurutma işlemi tarafından bozulmuş bir kök ve ince kesit işlemi sırasında çekilen bir kök göstermektedir.
Kök ince bölümleri, ilgi çekici unsurların yerini haritalamak için S-XRF kullanılarak analiz edildi. Şekil 2B, boyuna bölümde yanal kök içeren bir kök enine bölümü gösterir. Şekil 2C, XRF tarafından fe, Mn ve As üç renkli bir arsa ile analiz edilen bu kök bölümünü göstermektedir. Fe, toprakta bulunur ve Fe plağında kökü çevreler ve Fe plağı ışık mikrografi görüntülerinde de görülebilir. Manganez, yanal kökün korteksinde benzersiz bir şekilde bulunur, aynı zamanda Fe plaktaki bazı bölgelerde Fe ile birlikte bulunur ve yeşil-mavi bir renk tonu olarak görünür. Arsenik çoğunlukla yanal kökün vaskülatında mevcuttu ve birincil kökün vaskülatında birleşti.
Kimyasal spektrasyon görüntüleme, birden fazla olay ışını enerjisinde tekrarlanan XRF haritalarını alarak ve standart As XANES spektrumlarına uyan doğrusal kombinasyon kullanarak çeşitli As ilgi türlerini ayırdı. As belirtimi haritaları Şekil 2D'de gösterilmiştir ve As türlerinin lokalizasyonunda değişkenlik gösterir. Şekil 2E, üç renkli bir çizimle aynı verileri gösterir. Üç renkli arsa, vaskültürde yakından ilişkili arsenit ve arsenit glutatyon gösterirken, arsenat öncelikle Fe plağı ile ilişkili kökün dış kısmında bulunur.
Şekil 1 - Silty tınlı bir toprakta çeşitli metodolojik sonuçları gösteren pirinç kökü ince bölümleri (ölçek çubukları 0,5 mm'dir). A)Çok sayıda farklı kök çapı kesitleri belirgindir (beyaz kutularda). B)İşlem sırasında kökler zarar görmüş olabilir. Beyaz kutudaki kök sağlam ve dairesel kalırken, turuncu kutudaki kök dondurarak kurutma işlemi sırasında sıkıştırılmıştır. Kırmızı kutu, ince kesit işlemi sırasında bir kökün nereden çıkarıldığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 - Silty tınlı bir toprakta yanal bir kökün boyuna bir bölümüne sahip bir pirinç kökünün enine bölümü. A)Beyaz kutularda birkaç kök enine kesitini gösteren toprak bölümü. Beyaz oklar boyuna bölümleri gösterir. Ölçek çubuğu 2 mm'dir. B) Panelin sol üst köşesinden kökü gösteren toprak bölümü A. Beyaz dikdörtgen, senkrotron XRF ile gösterilen alanı gösterir. Ölçek çubuğu 0,5 mm. C) Arsenik (kırmızı), demir (yeşil) ve manganez (mavi) üç renkli XRF görüntüsüdür. As, Fe ve Mn'nin maksimum ölçeği 1:50:2.5 oranındadır. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. D) Arsenit glutatyon, arsenit ve arsenat için arsenik XRF belirtim haritaları, burada daha sıcak renkler as. Ölçek çubuğu daha yüksek konsantrasyonları gösterir 100 μm. E) As türlerinin üç renkli arsa, burada maksimum yoğunluk arsenit (kırmızı) = arsenat (yeşil) = 0.5 arsenit glutatyon (mavi) ölçeklenmiştir. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, elementel görüntüleme ve/veya kimyasal spektasyon haritalaması için kullanılabilecek bir çarpma dondurma tekniği kullanarak sulak alan bitki köklerinin korunmuş dökme toprağı + rizosferlerini elde etmek için bir protokol açıklanmaktadır.
Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre çeşitli yararları vardır. İlk olarak, bu yöntem köklerin ve çevresindeki rizosferlerin eşzamanlı olarak araştırılmasına izin verir. Şu anda, toprağı yıkayarak ve kökleri 31,32veya yapay ortamlarda (örneğin rhizoboxes) bitki yetiştirerek ve kök-toprak etkileşimlerini incelemek için DGT yöntemlerini kullanarak 24 , 33 ,34,ancak kökün kendisini gözlemleme yeteneği olmadan toprak ortamlarından kökleri korumak ve kimyasal olarak görüntü etmek için yöntemler mevcuttur. Burada açıklanan yöntem, kök-toprak ilişkilerinin gözlemlenmesi için kök ve çevresindeki rizosfer toprağının yerinde doğrudan araştırılmasına izin verir. Benzer bir teknik yerinde pirinç kökleri ve çevresindeki rizosfer incelemek için kullanılmıştır, ancak numuneyi burada tarif edilmiş slam-freeze yerine sıvı nitrojen11,35,36'ya daldırmak. Dokular ne kadar hızlı dondurulursa, buz kristalleri oluşturma olasılıkları o kadar azdır37. Önceden soğutulmuş bakır bloklar arasındaki çarpma dondurma, numuneyi hızla soğutur ve bu nedenle ortam sıcaklıklarında sıvı azot kullanılarak flaş dondurma ile oluşabilecek buz kristallerinin oluşumunu ve ardından oluşan bitki dokusu hasarını en aza indirir11,38. Burada açıklanan yöntem kullanılarak, aynı bitkiden, bir tarladan birden fazla bitkiden ve/veya ortamdan nispeten kısa bir süre içinde birkaç numune alınabilir. Elde edildikten sonra, birçok numune dondurularak kurutulabilir, epoksiye gömülebilir ve en az maliyetle elmas bıçak ıslak testere ile kesilebilir. Bu örnekler daha sonra doğrudan görüntülenebilen (örneğin, LA-ICP-MS) veya ince kesitleme ve sXRF görüntüleme için daha fazla işlenebilen umut verici örnekleri tanımlamak için hafif bir mikroskopla incelenebilir. İnce bir bölüm, aynı slaytta çeşitli boyutlarda birden fazla kök yakalayabilir, bu da heterojen rizosferin yakalanmasına ve cihazdaki görüntüleme süresinin en üst düzeye çıkarttırılarak. Bu yöntem, rizosferi bozmadan Fe plaklarında tecrit gibi bitki-toprak ilişkilerini doğrudan gözlemlemek için de kullanılabilir. Topraksız deneyler kullanarak pirinç gibi sulak alan köklerinde Fe plak oluşumunu teşvik etmek için mevcut yöntemler39,40,41 toprakla yetiştirilen bitkilerde meydana gelen kök kapsamı ve mineral bileşimi açısından Fe plağı heterojenliğini yakalayamaz11,18,20,42,43,44.
Yöntemin başarılı olması için birkaç önemli adımı izlemek önemlidir. İlk olarak, seçilen örnek konumun ve yönlendirmenin istenen soruyu ele almasına emin olun. İkinci olarak, iz element kontaminasyonundan arındırılmış ve ilgi çekici as elementlerinin kimyasal spekülasyonunu koruduğu gösterilmiştir20,29,30. Üçüncüsü, epoksiyi yavaşça ekleyin ve numunenin epoksi ıslatmasını ve tuzaklanmış gazın çıkarılmasını kolaylaştırmak için numuneyi vakum altında epoksiye yerleştirin. Bu adımları izleyerek, görüntü analizi için kullanılabilecek yüksek kaliteli bir dökme toprak, rizosfer ve kök örneği sağlayacaktır.
Yöntemin çeşitli sınırlamaları göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, donmuş numunenin bir dondurarak kurutucuda kurutlanması, toprağın deformasyonuna neden olabilir ve bu da kökleri etkileyebilir. Bu, kil içeriği yüksek topraklarda özellikle zor olacaktır ve bu nedenle killer kurudukça çökme eğilimi vardır. Örnek olarak, silty kilden elde edilen bir pirinç rizosfer örneği hazırlanmış ve toprağın çatlaması belirginken, Fe plak kaplı pirinç kökü etkilenmez (Şekil 3).
Şekil 3 - Silty kil çeltik toprağından pirinç kökü ince kesiti. Dondurarak kurutma sırasında toprakta çok sayıda çatlak meydana geldi, ancak bu çatlaklar beyaz dikdörtgen tarafından tasvir edilen yanal kök boyuna bölümünü bozmadı. Ölçek çubuğu 0,5 mm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Veriler, bu tekniğin bir silt tınında mikron ölçeğinde bilgileri başarıyla elde etmenin(Şekil 2, 3) ve tekniğin kaba dokulu topraklarda başarılı olabileceğini göstermektedir; bununla birlikte, daha yüksek kil içeriğine sahip topraklar zorluklar doğurabilir ve daha fazla araştırılmalıdır. İkincisi, kökler kesit üzerine topraktan çekilebilir. Bu zorluk sadece bu makalede açıklanan protokole özgü değildir, ancak dikkate alınmalıdır. Üçüncüsü, her toprak küpte kökler bulunmayabilir, bu nedenle istenen bitkinin rizosferini yakalamak için birçok numunenin elde edilmesi ve kesilmesi gerekir. Dördüncüsü, koruma yöntemi, uzak saha çalışmaları için zorluklar oluşturabilecek sıvı nitrojen gerektirir. Burada, protokol, sıvı nitrojen Dewar'a 3,2 kilometreden daha az mesafedeki alanda başarıyla kullanıldı. Ancak, uzak bir saha bölgesinden kısa bir sürücü içinde sıvı nitrojen mevcut değilse, numuneyi elde etmek için çeşitli seçenekler vardır. Bu, bakır blokları soğutmak için başka bir kaynak kullanmayı veya tüm bitkiyi ve çevresindeki toprağı büyük bir PVC halka ile kazmayı, bunu gaz geçirimsiz malzemeye yerleştirmeyi ve muhafaza için en yakın sıvı azot kaynağına taşımayı içerir. Bunun için, rizosfer örneğini elde etmeden önce bitki sürgününin köklerinden kesilmemesini sağlamak önemlidir. Gerekirse, numune soğutma altına da yerleştirilecek ve muhafaza için laboratuvara bir gecede sevk edilebilir. Laboratuvarda alındıktan sonra, bölümler sıvı azot soğutmalı bakır bloklar kullanılarak korunabilir. Son olarak, sulak alan topraklarının ve rizosferlerin herhangi bir koruma yöntemi ile belirti değişiklikleri mümkündür. Bunu önlemek için, oksijene maruz kalmamak için numuneler alınmalı ve hızlı bir şekilde veya yukarıdaki gibi diğer önlemler alınmalıdır. Dondurularak kurutulmuş numunelerin kenarları daha sonra oksijene daha yüksek maruz kalmamış olabilecek kenarları önlemek için tıraş edilebilir. Buradaki kök ve rizosfer örneklerinde azaltılmış arsenik türlerinin korunması (Şekil 1D, E ) ve önceki çalışmalarda28, bu çarpma dondurma tekniğinin dikkatli bir şekilde yapılması halinde oksijene duyarlı kimyasal türleri koruyabildiğini göstermektedir.
Bu yöntem, rizosfer biliminde birkaç temel soruyu ele almak için kullanılabilir. Bunlar, rizosferdeki besin ve kirletici etkileşimlerinin incelenmesiyle ilgili uygulamaları içerir ve bu uygulamalar, kirleticilerin ve besin maddelerinin Fe veya Mn plaklarıyla etkileşimlerini içerebilir. Yöntem, bitki-toprak ilişkilerinin zamansal ve mekansal heterojenliğinin incelenmesine ve kök morfolojilerinin rizosfer in situ'daki elementlerle nasıl etkileşime girdiğinin incelenmesine izin verir. Pirinç tarafından arsenik alımını anlamak, rizosferdeki besin dinamikleri veya sulak alan bitkilerine metal (loid) alımı gibi fitokreedasyonla ilgili uygulamalar gibi gıda güvenliği ile ilgili uygulamalarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Delaware Üniversitesi ve Brookhaven Ulusal Laboratuvarı arasındaki işbirliğini desteklemek için Seyfferth ve Tappero'ya ortak tohum hibesi verildiğini kabul ediyorlar. Bu araştırmanın bazı bölümlerinde, Brookhaven Ulusal Laboratuvarı tarafından Brookhaven Ulusal Laboratuvarı tarafından DOE Bilim Ofisi için işletilen ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Bilim Kullanıcı Tesisi Ofisi Olan Ulusal Senkrotron Işık Kaynağı II'nin XFM (4-BM) Beamline'ı kullanılmıştır. DE-SC0012704.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
References
- Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
- McNear, D. H. The rhizosphere - roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
- Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
- Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
- Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
- Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
- Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
- Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
- Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
- Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
- Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
- vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
- Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
- Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
- Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
- Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
- Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
- Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
- Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
- Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
- Voegelin, A., Weber, F. -A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
- Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
- Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
- Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
- Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
- Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
- Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
- Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).
