Summary
このプロトコルは、新生物形成の様々な側面を研究するための成体宿主の腹部への ショウジョウバエ 腫瘍の初期および継続的な世代間他家移植のための詳細なガイダンスを提供する。オートインジェクター装置を使用すると、研究者は従来の手動の方法によって達成されたものと比較して、効率と腫瘍収量を改善することができます。
Abstract
このプロトコルは、自動ナノリットル注射装置を用いたショウ ジョウバエメラノガスター における腫瘍の他家移植を記載している。 オートインジェクター装置を使用することにより、訓練を受けたオペレータは、手動インジェクターを使用して得られたものと比較して、より効率的で一貫した移植結果を達成することができる。ここでは、 ショウジョウバエ の系統の交差から、原発腫瘍の誘導と解剖、原発腫瘍の新しい成人宿主への移植、および拡張研究のための腫瘍の世代移植の継続まで、時系列的にトピックをカバーします。実証として、ここではNotch細胞内ドメイン(NICD)過剰発現誘導唾液腺虚環腫瘍を世代移植に用いた。これらの腫瘍は、まず幼虫唾液腺虚環内の遷移帯微小環境で確実に誘導され、次いでインビボで同種移植および培養され、継続的な腫瘍成長、進化、および転移を研究することができる。この他家移植法は、潜在的な薬物スクリーニングプログラム、ならびに腫瘍 - 宿主相互作用の研究に有用であり得る。
Introduction
このプロトコルは、自動ナノリットル注入装置(例えば、Nanoject)を用いて、 ショウジョウバエ 幼虫唾液腺(SG)想像上の環腫瘍を成体宿主の腹部に同種移植するための段階的なガイダンスを提供する。このプロトコルはまた、腫瘍を新世代の成体宿主に再同種移植するための指示も提供し、腫瘍の進化や腫瘍と宿主の相互作用などの腫瘍特性の継続的な縦断的研究の機会を提供する。このプロトコールは、薬物スクリーニング実験にも適用することができる。
この方法は、 ショウジョウバエ に腫瘍他家移植を行う有効性を改善するために開発されたもので、吸引力と注射力に一貫性がないことが多い手動注射器1を使用して、腫瘍同種移植の最適でない結果をもたらす。オートインジェクター装置は、より良い制御を提供し、同種移植後のハエ死亡率の低下をもたらし得る。訓練を受けたオペレータは、手動注射器を使用した場合の約80%と比較して、オートインジェクターで90%以上の宿主生存率を達成することができた1。全体的な腫瘍獲得率は、同種移植後8〜12日目に60%〜80%である。平均噴射時間も、手動インジェクタを使用した1フライあたり30〜40秒から、オートインジェクターを使用した1フライあたり20〜25秒に改善されました。
このプロトコルは、 ショウジョウバエ 腫瘍同種移植において自己注射器装置を使用する最初のいくつかのプロトコルの1つである。最近の研究では、腫瘍性神経幹細胞の他家移植にも自己注射器が使用されました2。以前は、 ショウジョウバエ で自己注射器装置を使用して、細菌病原性3、寄生虫感染および宿主防御4を研究し、ならびに異なる化合物5の生理活性をスクリーニングした。当社のプロトコルは、腫瘍注射用に自己注射装置を適応させ、 ショウジョウバエ の研究者に、かなりの時間を節約しながら、より高品質でより一貫した結果を提供することを目指しています。このプロトコルは、腫瘍の他家移植に使用することができるだけでなく、同様の口径6の野生型および変異組織の同種移植にも合わせることができる。
このプロトコールで使用された ショウジョウバエ NICD腫瘍は、Yangら7 によってSG虚環移行帯、すなわち高レベルの内因性ヤヌスキナーゼ/シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子(JAK-STAT)、およびc-Jun N末端キナーゼ(JNK)活性を示す「腫瘍ホットスポット」に最初に導入された。さらに、遷移帯は高レベルのマトリックスメタロプロテイナーゼ-1(MMP1)7を有し、この領域を特に腫瘍形成に資する。NICD過剰発現のみによるノッチ経路活性化は、腫瘍形成を一貫して開始するのに十分である。これらの腫瘍は、その後、腫瘍細胞分裂、浸潤、および腫瘍-宿主相互作用を含む幅広いトピックの調査を可能にするために、同種移植することができる。
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Protocol
1. SG虚環腫瘍の作製
- 成虫のハエを UAS-NICD (オス:10-15匹のハエ)と Act-Gal4、UAS-GFP/CyO;tub-Gal80ts (処女メス:10-15匹のハエ)の遺伝子型と交配し、18°Cで1日間繁殖させる。 選択された成虫のハエは、高い繁殖力を確保するために5〜9日齢でなければなりません。
- 成虫のハエがバイアルに含まれるハエの餌に18°Cで24時間卵を産むのを許し、成虫のハエを取り除きます。
注:フライフードは、 ショウジョウバエ ストックセンター8の標準的なコーンミールフードレシピを使用して調製されます。各バイアルには約10mLのフライフードが含まれている必要があります。 - 卵を18°Cで6日間孵化させます。 この期間中、幼虫は孵化します。
- 幼虫を含むバイアルを29°Cのインキュベーターに移し、さらに7日間インキュベートする。
注:このインキュベーションステップは、特定の実験計画に応じてオプションです。
2. 他家移植のための成体野生型 ショウジョウバエ の調製
- 野生型または適切な変異成虫のハエを100%CO2で麻酔し、性別に基づいてハエを分類する。オスとメスの両方のハエを腫瘍宿主として使用することができます。
- 長さ5cmのフライテープを顕微鏡スライドに固定し、粘着性のある面を上にして、両端に1本ずつ、2つの小さなテープで固定します。
- 翼をテープに接着してハエを固定する。ハエを操縦しながら鉗子を使用してください。
- 同種移植片アクセプターとして使用される60〜80匹の成体ハエについて、上記のステップを繰り返す。
注:後でより時間効率の良い注入プロセスのために、体軸を互いに平行に揃えて、ハエをきちんとした列に整理するのが最善です。 図 1 は、この方法でテーピングされた宿主ハエの列を示しています。
- 同種移植片アクセプターとして使用される60〜80匹の成体ハエについて、上記のステップを繰り返す。
3. オートインジェクター装置の組み立て
- オートインジェクタ装置と電源コードの両方をコントローラボックスに接続します。
- 注入量を 59.8 nL に設定します。これは、他家移植中に適切な量の吸引力および注射力を維持するのに役立つ。
- コントローラーボックスとオートインジェクターを光学顕微鏡の反対側に置きます。
注:右利きのオペレータの場合、コントロールボックスは顕微鏡の左側に置き、インジェクタは右側に配置する必要があります。左利きのオペレータの場合は逆も同様です。 - 3.5インチのガラスキャピラリーを、閉じた端を鉗子で切り取って準備します。
- ガラスキャピラリーの一端を4段階のマイクロピペットプーラーを使用して処理し、機器の次の仕様を使用して狭い閉じた端に加熱します:熱= 650、力= 200、および距離= 8。毛細血管をプーラー装置にきれいに置き、上記の設定を入力した後にプログラムを実行します。
- 鉗子を使用して毛細血管を約60°の角度でクリップし、大人のフライ腹部に簡単に入ることができるようにより鋭い端を作ります1。よく切り取られたキャピラリーの例については、 図2 を参照してください。
- インジェクタのキャップを軽く緩めます。 Empty ボタンを押したままにして、全長の70%〜80%が表示されるまでインジェクタニードルを進めます。毛細血管の進行を加速するには、[ 塗りつぶし ] ボタンを 1 回押しながら 、[空] ボタンを同時に押し続けます。
- シリンジを使用して、ガラスキャピラリーを鉱物油で満たします。次に、ガラスキャピラリーをインジェクタの針に慎重に挿入し、前者がインジェクタのゴム栓にしっかりと取り付けられるまでします。次に、インジェクタキャップをしっかりとねじ込みます。
- ガラスキャピラリーカバーの外面にある鉱物油の残留物を拭き取り、他家移植中に培地を汚染しないようにします。
4. SG虚環腫瘍の解剖
- 幼虫の1つを選択し、100μLのシュナイダー培地で満たされた解剖プレートに移して、SG想像環腫瘍解剖の準備をする。
注:腫瘍を保有する標本のみが幼虫として残る。これは、腫瘍の成長が幼虫の発生と進行を遅らせるためである9。標本の3分の2は腫瘍を抱かず、したがって蛹/成虫に進行するであろう。- 解剖および他家移植の目的で、倍率10倍~20倍の実体顕微鏡を使用してください。
- 1対の鉗子を使用して幼虫体の中央部を保持し、別の一対の鉗子を使用して幼虫の頭をつまみ、縦方向に伸張力を加える。
- 幼虫のY字型SGを見つけ、それを幼虫組織の残りの部分から単離する10。
- 隣接する組織を除去することによってSG想像上の環腫瘍を解剖し、単離する。この解剖プロセスの描写については、 図 3 を参照してください。
- 研究ニーズに基づいて、追加の10〜20 SGの想像上の環腫瘍について、ステップ4.1〜4.4を繰り返します。
原発性SG虚環腫瘍の同種移植片
- 毛細血管を原発性SG想像上の環腫瘍を含むシュナイダー培地に沈める。 塗りつぶし ボタンを押したままにすると、ガラスキャピラリーをシュナイダーのミディアムで上部の0.5 cmセグメントまで満たします。このトップセグメントは、鉱物油で満たされたままにする必要があります。
メモ: [ 空] ボタンを 1 回押しながら [ 塗りつぶし] ボタンを同時に押して、このプロセスを高速化します。 - 原発腫瘍を見つけ、腫瘍が毛細血管に吸引されるまで フィル ボタンを押します。
- 腫瘍が毛細血管の先端または毛細血管の先端から数ミリメートル離れていることを確認してください。これは、腫瘍が漂流し、毛細血管内に含まれる溶液中で失われるのを防ぐのに役立ちます。毛細血管内に座っている腫瘍の適切な位置のデモンストレーションについては、 図4A を参照してください。
- 顕微鏡スライド上のテープに固定された成虫のハエを見つけます。鉗子を使用して、下腹部を静かに押さえます。次に、毛細血管で腹部の下側キューティクルを突き刺す。腫瘍が新しい宿主の腹部に入るまで Empty ボタンを押します。この手法のデモンストレーションについては、 図 4B を参照してください。
- 鉗子を使用して、ホストの翼をそっとつまんでテープから取り外します。新鮮な食べ物を入れた新しいバイアルに宿主を置きます。注射後最初の24時間、バイアルを横向きに置くのが最善です。各バイアルには最大20匹のハエしか含まれていなければなりません。
注:一部の宿主ハエは、注射後に体に翼やその他の傷が欠けており、バイアルを直立させるとフライフードに固執することがあります。 - 手順5.2~5.4を繰り返して、残りの原発腫瘍を新しい成人宿主に移植します。
- 毛細血管をシャープの容器に処分し、オートインジェクターの外側から鉱物油の残留物を清掃してから、装置を箱に戻します。
- 宿主のバイアルを室温で1日間保存し、次いでバイアルを29°Cのインキュベーションチャンバーに移す。フライホストを2〜3日ごとに新しいバイアルに移動します。
- フライホストを毎日監視し、生存率を計算します。1週間後、腫瘍は蛍光アダプターを備えた実体顕微鏡下で見えるようにし、そのサイズと進行を継続的に監視することができます。
6. 移植腫瘍の再同種移植
- 同種移植後10〜14日後に、蛍光顕微鏡を用いて宿主腹部で増殖した腫瘍をスクリーニングする。
- 宿主をCO2 で麻酔し、100μLのシュナイダー培地で満たされた解剖プレートに入れます。増殖した同種移植腫瘍を2対の鉗子を用いて宿主から解剖する。
- 1対の鉗子を使用して腹部を押さえ、もう1対を使用して腹部キューティクルを切開し、同種移植腫瘍1を露出させる。
- 蛍光マーカーをガイダンスとして使用して、付着した宿主組織から腫瘍をできるだけ慎重に単離する。
- ステップ6.2を繰り返して、2〜3個の追加の同種移植腫瘍を準備する。
- 採取した腫瘍を含む解剖プレートを光学顕微鏡のステージに移す。
- 滅菌針を使用し、腫瘍を毛細血管のサイズに適した小さな断片に解剖します。
- ステップ4.1~4.5を繰り返して新世代の成体宿主を調製し、ステップ5.1~5.7を繰り返して腫瘍の他家移植を完了します。
注:成功率は、原発性腫瘍のものと比較して、非原発性腫瘍の方が一般的に高い。 - 研究で使用されたハエの後続の世代ごとにステップ6.1-6.6を繰り返します。
注:実験のニーズに適した ショウジョウバエ の宿主系統を選択してください。
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Representative Results
ここでは、ナノリットル注射オートインジェクター装置を用いてSG想像環腫瘍の世代的他家移植を行い、その後、共焦点レーザー走査顕微鏡による腫瘍ライブイメージングを実施し、腫瘍増殖、腫瘍細胞移動、腫瘍-宿主相互作用のトピックをより深く掘り下げることができました。ハエを装着するときは、顕微鏡スライドに接着し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロック11を介して拘束する。
図5Aは 、他家移植後10日目に成人宿主腹部に増殖する第 1世代(G1)SG想像環腫瘍のライブイメージングキャプチャを特徴とする。このレベルのイメージングは、腫瘍分裂のプロセスを追跡するために使用することができる。 図5B は、他家移植後10日目に宿主腹部の大部分を占める第 6世代(G6)SG虚環腫瘍を描いている。この段階でのイメージングは、腫瘍の成長パターン、ならびにその移動および浸潤行動を明らかにするのに役立つ可能性がある。この画像は共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して撮影されましたが、GFP蛍光アダプターを備えた実体顕微鏡は、腫瘍サイズに応じて2倍から5倍の倍率でも使用できることに注意することが重要です。
図1:宿主のハエは、他家移植のためにテープで固定されています。 宿主のハエは、羽によってテープで留められ、その後の移植手順の準備のためにきれいに向き付けられます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:よくクリップされた注射用毛細血管。 赤い矢印は、成体の ショウジョウバエ 宿主の腹部キューティクルを効果的に突き刺すために必要な鋭いエッジを指しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:原発性唾液腺ImR腫瘍の解剖。 2つの原発性唾液腺ImR腫瘍を解剖および単離するプロセスは、2つの別々の切開を用いて、パネル(A)からパネル(B)まで時系列的に実証される。パネル(A)は、腫瘍解剖前の唾液腺を示す。赤い矢印は、最初の切開点を示す。青色の矢印は、第2の切開点を示す。腫瘍は赤と青の矢じりの間にあります。パネル(B)は、正常な唾液腺組織からそれを分離するために2つの切開がなされた後に単離されたImR腫瘍を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:毛細血管内の適切な腫瘍位置および ショウジョウバエ 宿主腹部への腫瘍の注射。パネル(A)は、毛細血管内の最も適切な腫瘍位置を示す。腫瘍はeGFP(488nm)を発現する。パネル(B)は、注入工程を示す。赤い矢印は腫瘍注射部位を示す。青い矢印は、注射を容易にするためにハエの末端を保持するのに役立つ鉗子の配置を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:他家移植後10日目にWT ショウジョウバエ 宿主腹部に見られるG1およびG6 ImR腫瘍。 これらは、移植された腫瘍を緑色にしたハエの腹部の腹側図である。パネル(A)は、eGFP(488nm)を発現する他家移植後10日目のG1腫瘍を示す。パネル(A)は、0.8NAの20倍レンズと3倍ズームを用いた共焦点顕微鏡を用いて撮影される。パネル(B)は、eGFP(488nm)を発現する他家移植後10日目のG6腫瘍を示す。パネル(B)は、0.25NAの5倍レンズ、および1倍スキャンズームを用いた共焦点顕微鏡を用いて撮影される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
腫瘍他家移植は、ショウジョウバエの腫瘍の成長と進行の間に生じる特定の問題に研究者が対処するのに役立ちます。そのような課題の1つは、原発性腫瘍培養中の担癌幼虫または成虫の早期死亡の回避である12。この文脈において、腫瘍同種移植を継続することは、腫瘍が無期限に成長することを可能にし、腫瘍の成長、転移、および進化の縦断的研究を容易にする。腫瘍他家移植は、宿主-腫瘍間相互作用の様々な態様を評価するのにも有用である7,13。宿主遺伝子型は、腫瘍同種移植片の前に操作して、腫瘍の成長および遊走、ならびに腫瘍誘発性悪液質に対する宿主効果の評価を可能にすることができる14、15。異なる遺伝子型を有するハエ宿主は、同じ腫瘍に応答して悪液質様消耗の明確な症状を示し得る。他家移植後、腫瘍宿主は、KoyamaらおよびJiらから適合されたプロトコールを用いてin vivoイメージングの準備としてマウントすることができる11,16。
ショウジョウバエ腫瘍同種移植に向けた自己注射器装置の適用は、強化された効率を有する便利で簡単なプロトコルを提供する。手動注射器1と比較して、この方法は、再現可能で大規模な他家移植を可能にし、腫瘍挙動研究および薬物スクリーニング手順を迅速化および標準化することができる。この改善された方法は、印象的な宿主生存率および腫瘍収量率をもたらす。訓練を受けた研究者は、同種移植後の宿主生存率>90%を達成することができます。腫瘍収量は、腫瘍が原発性であるか再同種移植であるかによって異なり得る。研究者らは、原発性腫瘍で>50%、再同種移植腫瘍で>70%の腫瘍収量率を達成することが期待できます。さらに、この方法は、手動インジェクタ法と比較して、ホストフライあたりの噴射時間を約50%短縮します。
しかし、この手順には限界があり、主に腫瘍切開、注射位置および創傷サイズの不一致に起因する。原発腫瘍が他家移植の前に均一なサイズの断片に切断されない場合、特定のハエ宿主は他の宿主よりも大きな断片を受け取ることができる。これは、腫瘍増殖速度を追跡することを目的とした研究に影響を与える交絡因子である。これは、同種移植後の2日間隔で腫瘍増殖の微分速度を測定することによって潜在的に緩和することができる。さらに、注射中に、オペレータは、すべての宿主ハエにわたって腹部キューティクル内の一貫した部位を選択するべきである。これは、ハエ宿主の生存および腫瘍付着の最終位置に影響を与える可能性のある別の交絡変数を緩和するのに役立つ。
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Disclosures
著者の間で宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
私たちは、このプロトコルの開発に貢献してくれた元研究室メンバーのSheng-An Yang博士とJuan-Martin Portilla氏に感謝します。北京大学生命科学院のYan Song博士の研究室が、手動の他家移植に関するプロトコルを共有してくれたことに感謝しています。また、原稿を批判的に読んでくれたカルダー・エルスワース氏とエベレスト・シャピロ氏にも感謝します。
WMDは、国立衛生研究所(https://www.nih.gov/)からこの研究のための資金提供(GM072562、CA224381、CA227789)を受け、国立科学財団(htps://nsf.gov/)から資金提供(IOS-155790)を受けました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も持っていませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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