Summary
Detta protokoll ger detaljerad vägledning för den initiala och fortsatta generations allotransplantationen av Drosophila-tumörer i buken hos vuxna värdar för att studera olika aspekter av neoplasi. Med hjälp av en autoinjektorapparat kan forskare uppnå förbättrad effektivitet och tumörutbyten jämfört med de som uppnås med traditionella, manuella metoder.
Abstract
Detta protokoll beskriver allotransplantationen av tumörer i Drosophila melanogaster med hjälp av en auto-nanoliter injektionsapparat. Med hjälp av en autoinjektorapparat kan utbildade operatörer uppnå mer effektiva och konsekventa transplantationsresultat jämfört med de som erhållits med hjälp av en manuell injektor. Här täcker vi ämnen på ett kronologiskt sätt: från korsningen av Drosophila-linjer , till induktion och dissektion av den primära tumören, transplantation av den primära tumören till en ny vuxen värd och fortsatt generationstransplantation av tumören för utökade studier. Som en demonstration använder vi här Notch intracellular domain (NICD) överuttrycksinducerad spottkörtel imaginära ringtumörer för generationstransplantation. Dessa tumörer kan först induceras på ett tillförlitligt sätt i en mikromiljö i en övergångszon i larvspottkörtelns imaginära ringar, sedan allograferas och odlas in vivo för att studera fortsatt tumörtillväxt, evolution och metastasering. Denna allotransplantationsmetod kan vara användbar i potentiella läkemedelsscreeningsprogram, liksom för att studera tumör-värdinteraktioner.
Introduction
Detta protokoll ger en steg-för-steg-vägledning för allotransplantation av Drosophila larval spottkörtel (SG) imaginära ringtumörer i buken hos vuxna värdar med hjälp av en auto-nanoliter injektionsapparat (t.ex. Nanoject). Detta protokoll ger också anvisningar för efterföljande omfördelning av tumörer till nya generationer av vuxna värdar, vilket ger möjligheter till fortsatt longitudinell studie av tumöregenskaper, såsom tumörutveckling och tumör-värdinteraktioner. Protokollet kan också tillämpas på läkemedelsscreeningsexperiment.
Denna metod utvecklades för att förbättra effekten av att utföra tumörallotransplantation i Drosophila med manuella injektorer1, som ofta är inkonsekventa i sina sug- och injektionskrafter, vilket leder till suboptimala resultat för tumörallotransplantation. En autoinjektorapparat ger bättre kontroll och kan resultera i lägre flugdödlighet efter allograft. En utbildad operatör kunde uppnå en värdöverlevnad på över 90% med autoinjektorn, jämfört med cirka 80% när den manuella injektorn användes1. Den totala tumörförvärvshastigheten är 60% -80% vid dag 8-12 post-allograft. Den genomsnittliga injektionstiden har också förbättrats från 30-40 s per fluga med en manuell injektor till 20-25 s per fluga med hjälp av autoinjektorn.
Detta protokoll är bland de första protokollen som använder autoinjektorapparaten vid Drosophila tumörallotransplantation. En nyligen genomförd studie använde också autoinjektorn för allotransplantation av tumörösa neurala stamceller2. Tidigare användes autoinjektorapparaten i Drosophila för att studera bakteriell virulens3, parasitinfektioner och värdförsvar4, samt screening för bioaktivitet hos olika föreningar5. Vårt protokoll anpassar autoinjektorapparaten för tumörinjektionsanvändning och syftar till att ge Drosophila-forskare högre kvalitet och mer konsekventa resultat samtidigt som de sparar mycket tid. Detta protokoll kan inte bara användas för allotransplantation av tumörer, utan kan också skräddarsys för allotransplantation av vildtyp och muterade vävnader av liknande kaliber6.
Drosophila NICD-tumören som används i detta protokoll introducerades först av Yang et al.7 i SG-imaginal ringövergångszonen, en "tumör hotspot" som uppvisar höga nivåer av endogen JanusKinas / Signalgivare och aktivatorer av transkription (JAK-STAT) och c-Jun N-terminal Kinase (JNK) aktivitet. Dessutom har övergångszonen höga nivåer av matrismetalloproteinas-1 (MMP1)7, vilket gör denna region särskilt gynnsam för tumorigenes. Hackvägsaktivering genom enbart NICD-överuttryck är tillräckligt för att konsekvent initiera tumörbildning. Dessa tumörer kan därefter allotransplanteras för att möjliggöra undersökning av ett brett spektrum av ämnen, inklusive tumörcellsdelning, invasion och tumör-värdinteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av SG imaginal ringtumör
- Korsa vuxna flugor med genotyper av UAS-NICD (hane: 10-15 flugor) och Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (jungfruhona : 10-15 flugor) och låt dem föda upp i 1 dag vid 18 °C. De valda vuxna flugorna ska vara 5-9 dagar gamla för att säkerställa hög fertilitet.
- Låt de vuxna flugorna lägga ägg i flugmaten i injektionsflaskorna i 24 timmar vid 18 °C och ta sedan bort de vuxna flugorna.
OBS: Flugmat tillagas med standardreceptet för majsmjöl från Drosophila Stock Center8. Varje injektionsflaska bör innehålla cirka 10 ml flugmat. - Låt äggen inkubera i 6 dagar vid 18 °C. Under denna period kommer larverna att kläckas.
- Överför injektionsflaskorna som innehåller larver till en 29 °C kuvös och inkubera i ytterligare 7 dagar.
OBS: Detta inkubationssteg är valfritt beroende på den specifika experimentella designen.
2. Beredning av vuxen vild typ Drosophila för allotransplantation
- Bedöva vilda typer eller lämpliga muterade vuxna flugor med 100% CO2 och sortera flugor baserat på kön. Både manliga och kvinnliga flugor kan användas som tumörvärdar.
- Fäst en 5 cm lång bit flugtejp i ett mikroskopglas med den klibbiga sidan uppåt genom att fästa den med två mindre tejpbitar, en i varje ände.
- Immobilisera flugorna genom att fästa sina vingar på tejpen. Använd pincett när du manövrerar flugorna.
- Upprepa ovanstående steg för 60-80 vuxna flugor som används som allograft acceptorer.
OBS: Det är bäst att organisera flugor i snygga rader, med deras kroppsaxel inriktad parallellt med varandra för en mer tidseffektiv injektionsprocess senare. Figur 1 visar rader av värdflugor tejpade på detta sätt.
- Upprepa ovanstående steg för 60-80 vuxna flugor som används som allograft acceptorer.
3. Montering av autoinjektorapparaten
- Anslut både autoinjektorapparaten och nätsladden till styrboxen.
- Ställ in injektionsvolymen på 59,8 ml. Detta hjälper till att upprätthålla lämplig mängd sug- och injektionskrafter under allotransplantation.
- Placera kontrollboxen och autoinjektorn på motsatta sidor av ljusmikroskopet.
OBS: För högerhänta operatörer ska kontrollboxen placeras på vänster sida av mikroskopet med injektorn på höger sida. Vice versa för vänsterhänta operatörer. - Förbered 3,5'' glaskapillären för användning genom att klippa av den slutna änden med pincett.
- Bearbeta ena änden av glaskapillären med en fyrstegs mikropipettdragare och värm till en smal, sluten ände med följande specifikationer i instrumentet: Värme = 650, Kraft = 200 och Avstånd = 8. Placera kapillärerna snyggt i avdragsapparaten och kör programmet efter att du har matat in ovanstående inställningar.
- Använd pincett för att klämma kapillären i en cirka 60 ° vinkel för att göra en skarpare ände för enkel inträde i den vuxna flugbuken1. Se figur 2 för ett exempel på en välklippt kapillär.
- Skruva lätt av locket på injektorn. Håll ned knappen Töm för att flytta fram injektornålen tills 70%-80% av dess totala längd visas. För att påskynda kapillärutvecklingen, tryck på Fyll-knappen en gång samtidigt som du håller ner tomknappen .
- Använd en spruta för att fylla glaskapillären med mineralolja. Sätt sedan försiktigt in glaskapillären på injektornålen tills den förra är ordentligt fastsatt på injektorns gummipropp. Skruva nu injektorlocket tätt.
- Torka av mineraloljeresterna på utsidan av glaskapillärhöljet för att undvika att förorena mediet under allotransplantation.
4. Dissektion av SG-imaginär ringtumör
- Välj en av larverna och överför den till en dissektionsplatta fylld med 100 μL Schneiders Medium för att förbereda sig för SG-imaginär ringtumördissektion.
OBS: Endast de exemplar som hyser tumören kommer att förbli som larver. Detta beror på att tumörtillväxt försenar larvutveckling och progression9. Två tredjedelar av proverna kommer inte att hysa tumören och kommer därmed att ha utvecklats till puppor/vuxna.- För dissektion och allotransplantation, använd ett stereomikroskop med ett 10x-20x förstoringsområde.
- Använd ett par pincett för att hålla mittsektionen av larvkroppen, nyp larvhuvudet med ett annat par pincett och applicera en sträckkraft på längden.
- Leta reda på larvernas Y-formade SG och isolera den från resten av larvvävnaden10.
- Dissekera och isolera SG-imaginär ringtumör genom att ta bort den intilliggande vävnaden. Se figur 3 för en skildring av denna dissektionsprocess.
- Upprepa steg 4.1-4.4 för ytterligare 10 till 20 SG imaginära ringtumörer baserat på forskningsbehov.
5. Allograft av primär SG imaginal ring tumör
- Sänk ner kapillären i Schneiders medium som innehåller de primära SG-imaginära ringtumörerna. Håll fyllningsknappen intryckt för att fylla glaskapillären med Schneiders Medium hela vägen till det övre 0,5 cm-segmentet. Detta toppsegment bör förbli fyllt med mineralolja.
OBS: Påskynda denna process genom att trycka på Tom-knappen en gång samtidigt som du håller ned Fyll-knappen . - Leta reda på en primär tumör och tryck på Fyll-knappen tills tumören sugs in i kapillären.
- Se till att tumören sitter vid spetsen av kapillären eller flera millimeter från kapillärspetsen. Detta hjälper till att undvika att tumören driver och går vilse i lösningen i kapillären. Se figur 4A för en demonstration av lämplig tumörplats när den sitter i kapillären.
- Leta reda på en vuxen fluga immobiliserad till tejpen på mikroskopglaset. Håll försiktigt ner underlivet med pincett. Genomborra sedan bukets nedre laterala nagelband med kapillären. Tryck på den tomma knappen tills tumören kommer in i den nya värdbuken. Se figur 4B för en demonstration av denna teknik.
- Använd pincett och nyp försiktigt upp värdens vingar för att ta bort den från tejpen. Placera värden i en ny injektionsflaska med färsk mat. Det är bäst att placera injektionsflaskan i sidled under de första 24 timmarna efter injektionen. Varje injektionsflaska bör endast innehålla upp till högst 20 flugor.
OBS: Vissa värdflugor kommer att ha saknade vingar och andra sår på kroppen efter injektion och kan hålla fast vid flugmaten om injektionsflaskan placeras upprätt. - Upprepa steg 5.2 till 5.4 för att transplantera de återstående primära tumörerna till sina nya vuxnavärdar.
- Kassera kapillärerna i behållaren för vassa föremål och rengör mineraloljeresterna från autoinjektorns utsida innan du byter ut apparaten i lådan igen.
- Förvara injektionsflaskan med värdar vid rumstemperatur i 1 dag och överför sedan injektionsflaskan till en inkubationskammare vid 29 °C. Överför flygvärdar till nya injektionsflaskor var 2-3: e dag.
- Övervaka flugvärdarna dagligen och beräkna överlevnadsgraden. Efter en vecka bör tumörer vara synliga under ett stereomikroskop med fluorescensadapter och kan kontinuerligt övervakas för deras storlek och progression.
6. Re-allograft av transplanterade tumörer
- Runt 10-14 dagar efter allograft, screena för tumörer som har vuxit i värdlivet med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
- Bedöva en värd med CO2 och placera den i en dissektionsplatta fylld med 100 μL Schneiders Medium. Dissekera den odlade allograferade tumören ur värden med två par pincett.
- Använd ett par pincett för att hålla ner buken och det andra paret för att skära upp bukkutikeln och exponera den allograferade tumören1.
- Isolera försiktigt tumören från de bifogade värdvävnaderna så mycket som möjligt med fluorescensmarkörer som vägledning.
- Upprepa steg 6.2 för att förbereda för ytterligare två till tre allograferade tumörer.
- Överför dissektionsplattan som innehåller de skördade tumörerna till scenen i ett ljusmikroskop.
- Använd sterila nålar och dissekera tumörerna i mindre bitar som är lämpliga för kapillärstorleken.
- Upprepa steg 4.1-4.5 för att förbereda den nya generationen vuxna värdar och upprepa steg 5.1-5.7 för att slutföra allotransplantationen av tumörerna.
OBS: Framgångsgraden är i allmänhet högre för icke-primära tumörer jämfört med primära tumörer. - Upprepa steg 6.1-6.6 för varje efterföljande generation flugor som används i studien.
OBS: Välj Drosophila värdlinjer som är lämpliga för de experimentella behoven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här genomförde vi generations allotransplantation av SG-imaginära ringtumörer med hjälp av nanoliterinjektionsautoinjektorapparaten och genomförde efterföljande tumör-live-avbildning med ett konfokalt laserscanningsmikroskop, vilket möjliggjorde ett djupare dyk i ämnen av tumörtillväxt, tumörcellmigration och tumör-värdinteraktioner. När du monterar flugor, lim dem på ett mikroskopglas och håll fast dem via ett polydimetylsiloxanblock (PDMS)11.
Figur 5A har en levande avbildning av en 1: a generationens (G1) SG-imaginära ringtumör som växer i en vuxen värdbuk på dag 10 efter allotransplantation. Denna nivå av avbildning kan användas för att spåra processen för tumördelning. Figur 5B visar en 6: e generationens (G6) SG imaginala ringtumör som upptar en stor del av värdlivet på dag 10 efter allotransplantation. Avbildning i detta skede kan hjälpa till att avslöja tumörtillväxtmönster, liksom dess migrations- och invasionsbeteenden. Det är viktigt att notera att även om den här bilden togs med ett konfokalt laserscanningsmikroskop, kan ett stereomikroskop med en GFP-fluorescensadapter också användas vid 2x till 5x förstoring, beroende på tumörstorleken.
Figur 1: Värdflugor tejpade och säkrade för allotransplantation. Värdflugorna tejpas ner av sina vingar och orienteras snyggt för att förbereda sig för det efterföljande transplantationsförfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En välklippt injektionskapillär. Den röda pilen pekar på en skarp kant som behövs för att effektivt genomborra bukkutikeln hos vuxna Drosophila-värdar . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dissektion av den primära spottkörteln ImR-tumör. Processen att dissekera och isolera två primära spottkörtel ImR-tumörer demonstreras kronologiskt från Panel (A) till Panel (B), med hjälp av två separata snitt. Panel (A) visar spottkörteln före tumördissektion. De röda pilspetsarna indikerar de första snittpunkterna. De blå pilspetsarna indikerar de andra snittpunkterna. Tumören ligger mellan de röda och blå pilspetsarna. Panel (B) visar den isolerade ImR-tumören efter att de två snitten är gjorda för att separera den från normal spottkörtelvävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Lämplig tumörplats i kapillären och injektion av tumör i Drosophila värd buk. Panel (A) visar den lämpligaste tumörplatsen i kapillären. Tumören uttrycker eGFP (488 nm). Panel (B) visar injektionsprocessen. Den röda pilen indikerar tumörinjektionsstället. Den blå pilen visar placeringen av pincett för att hålla ner flugans terminalia för enklare injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: En G1- och G6 ImR-tumör som ses i WT Drosophila-värdlivet på dag 10 efter allotransplantation. Dessa är ventrala vyer av flugbuken med de transplanterade tumörerna i grönt. Panel (A) visar en G1-tumör på dag 10 efter allotransplantation som uttrycker eGFP (488 nm). Panel (A) fångas med ett konfokalmikroskop med en 20x lins med 0,8 NA och 3x zoom. Panel (B) visar en G6-tumör på dag 10 efter allotransplantation som uttrycker eGFP (488 nm). Panel (B) fångas med ett konfokalmikroskop med en 5x lins med 0,25 NA och 1x skanningszoom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumör allotransplantation kan hjälpa forskare att ta itu med vissa problem som uppstår under Drosophila tumörtillväxt och progression. En sådan utmaning är kringgåendet av för tidig död hos tumörbärande larver eller vuxna under primär tumörkultur12. I detta sammanhang tillåter fortsatt tumörallotransplantation tumörer att växa på obestämd tid, vilket underlättar longitudinella studier av tumörtillväxt, metastasering och evolution. Tumörallotransplantation är också användbar för att bedöma olika aspekter av värd-tumörinteraktioner 7,13. Värdgenotyper kan manipuleras före tumörallograft för att möjliggöra utvärdering av värdeffekten på tumörtillväxt och migration och på tumörinducerad kakexi14,15. Flugvärdar med olika genotyper kan uppvisa distinkta manifestationer av kakexiliknande slöseri som svar på samma tumör. Efter allotransplantation kan tumörvärdarna monteras som förberedelse för in vivo-avbildning med hjälp av ett protokoll anpassat från Koyama et al.
Appliceringen av autoinjektorapparaten mot Drosophila tumör allotransplantation ger ett bekvämt och enkelt protokoll som har förbättrad effektivitet. Jämfört med den manuella injektorn1 möjliggör denna metod reproducerbara och storskaliga allotransplantationer, vilket kan påskynda och standardisera tumörbeteendestudier och läkemedelsscreeningsförfaranden. Denna förbättrade metod ger imponerande värdöverlevnad och tumörutbyteshastigheter. En utbildad forskare kan uppnå post-allograft värdöverlevnad på >90%. Tumörutbyteshastigheter kan variera beroende på om tumören är primär eller re-allografted. Forskare kan förvänta sig att uppnå tumöravkastningshastigheter på >50% för primära tumörer och >70% för re-allografted tumörer. Dessutom minskar denna metod injektionstiden per värdfluga med nästan 50% jämfört med den manuella injektormetoden.
Denna procedur har dock sina begränsningar, främst på grund av inkonsekvens av tumörsnitt, injektionsplats och sårstorlek. Om de primära tumörerna inte skärs i enhetligt stora fragment före allotransplantation kan vissa flugvärdar få större fragment än andra. Detta är en förvirrande faktor som påverkar studier som syftar till att spåra graden av tumörtillväxt. Detta kan potentiellt mildras genom att mäta differentiell hastighet för tumörtillväxt med två dagars intervall post-allograft. Dessutom bör operatören under injektionen välja en konsekvent plats i bukkutikeln över alla värdflugor. Detta hjälper till att mildra en annan förvirrande variabel som kan påverka flygvärdens överlevnad och den slutliga platsen för tumörfäste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga intressekonflikter att deklarera bland författarna.
Acknowledgments
Vi tackar tidigare labbmedlemmar Dr. Sheng-An Yang och Juan-Martin Portilla för deras bidrag till utvecklingen av detta protokoll. Vi är tacksamma för Dr. Yan Songs laboratorium vid Peking University School of Life Sciences för att ha delat sitt protokoll om manuell allotransplantation. Vi tackar också Calder Ellsworth och Everest Shapiro för kritisk läsning av manuskriptet.
WMD fick finansiering (GM072562, CA224381, CA227789) för detta arbete från National Institute of Health (https://www.nih.gov/) och finansiering (IOS-155790) från National Science Foundation (htps://nsf.gov/). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. Pseudomonas Methods and Protocols. , Springer. 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).
