Summary
本研究提出了一种高度可重复的大型动物模型，即猪肾缺血-再灌注损伤，使用暂时皮质双边气球导管将肾脏动脉闭合60分钟，再灌注24小时。
Abstract
急性肾损伤 （AKI） 与术后发病率和死亡率的较高风险相关。缺血-再灌注损伤（IRI）是AKI最常见的原因。为了模拟这种临床场景，本研究使用肾动脉的临时皮质双边导管闭合，在猪中提出了一个高度可重复的大型动物模型肾IRI。肾脏动脉通过通过股骨动脉和胡萝卜动脉引入气球导管并将其推进动脉的近部，被遮挡60分钟。在大动脉中注入异位对比，以评估肾血管的任何不透明化，并确认动脉闭塞的成功。气球导管尖端脉冲波形的扁平进一步证实了这一点。气球在60分钟的双性肾动脉闭塞后被放气并取出，动物们可以恢复24小时。在研究结束时，血浆肌氨酸和血尿素氮显著增加，而eGFR和尿液输出显著减少。对异性对比的需求微乎其微，不影响肾功能。双边肾动脉闭合更好地模拟腹腔内低灌注的临床情况，皮下方法可最大限度地减少炎症反应的影响和通过开放方法（如腹腔切除术）看到的感染风险。能够创建和复制这种临床相关的猪模型，可以简化临床翻译给人类。
Introduction
急性肾损伤 （AKI） 是手术患者中常见的诊断疾病，与重大发病率和死亡率1，2相关。现有数据显示，AKI甚至可影响全球半数住院病人，导致重症监护病房1、3名病人死亡率达50%。尽管其高流行率，目前的AKI治疗仍然仅限于预防策略，如液体管理和透析。因此，人们一直有兴趣探索AKI4，5，6的替代疗法。
AKI通常根据其病因4、5、6分为肾前、内在和肾后。大多数手术患者与肾前原因由于低伏血症，导致缺血-再灌注损伤（IRI）的肾脏2。临床上，尿液输出减少，肌酸水平增加，由于肾功能下降。肾脏是一种高代谢率器官，易患缺血。肾IRI的高度可重复的大型动物模型是必要的，以更好地了解AKI的病理生理学及其潜在的治疗方法5。
为了模拟肾输液的临床场景，双性肾动脉闭合模型被认为是合适的。先前描述的模型涉及单边肾动脉闭合与或没有切除的逆向肾脏不提供足够的临床适用性7，8。虽然这些模型足以引起AKI，但它们与现实生活中的临床场景不同，无论是在伤害类型还是持续时间方面。
本文的目的是提出一个猪模型，通过气管闭合下血管造影术，对肾脏动脉进行皮外双边暂时闭合。双边肾动脉闭合模拟肾输液的临床情景，随后取出气球进行再灌注9、10。介绍了技术步骤，包括导管、导管制导、血管造影和血液学监测。这种方法不仅允许高度控制和可复制的肾脏动脉闭塞，而且皮下的方法通过限制对身体的侮辱量来尽量减少炎症反应的影响，而不是开放的方法。
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Protocol
所有活体研究均根据国家卫生研究院关于动物护理和使用的准则进行，并经波士顿儿童医院动物护理和使用委员会（第18-06-3715号议定书）批准。所有动物都按照《实验室动物护理和使用指南》得到人道护理。 图1 显示了这项研究的主要结果测量的时间表，包括麻醉、手术准备和时间点。
1. 诱导、麻醉和管教
- 为了防止不必要的压力和不适，通过注射血糖胺/佐拉泽帕姆4-6毫克/千克和西拉津1.1-2.2毫克/千克以及使用面罩的异黄酮3%的混合物来使猪安静。
- 用95%乙醇对耳静脉进行消毒后，用20G IV管子对耳静脉进行消毒。开始维护输液（0.9% NaCl，5 mL/kg/h）。
- 一旦麻醉剂充足性得到确认，用内窥镜管（体重为40-50公斤的猪的7号）给猪灌管。执行气球通风，频率为12呼吸/分钟，并将猪运送到手术室。
- 将动物放在手术台上，放在上部位置。立即启动机械正压力通风与FiO2 0.50，10 mL/kg潮汐体积，并在连续封顶下12呼吸/分钟的频率。
- 将脉冲氧计放在耳朵或下唇上进行连续监测。
- 使用空气加热垫保持正常体温 （37°C）。
- 为了保持全身麻醉，通过内窥镜管将异黄素管理保持在0.5-4%。在整个过程中，持续监测心电图、动脉血压、温度和腺造影，以测量麻醉深度。
- 插入Foley导管，检查动物的液体状况，并通过在排水袋中收集尿液来监测尿液输出。
注：雌性猪比雄猪更受欢迎，因为其尿道的解剖特征，使导管更容易。
2. 手术准备和血管进出
- 以无菌的方式拖曳动物。
- 通过涂抹βdine，然后95%乙醇消毒颈部右侧区域3次。
- 执行右胡萝卜动脉和右壶静脉导管的切口。横向收回胸腺瘤肌，将其解剖到右胡萝卜动脉和右壶静脉。
- 在动脉和静脉中插入 5F 血管造影护套。用丝绸 2 - 0 缝合线固定它。
- 使用塞尔丁格技术在左股动脉中插入 5F 血管造影护套。
- 执行塞尔丁格技术使用空心针刺穿股动脉。插入一个软尖导线通过流明，并推进到股动脉。
- 一边取下针头，一边用手固定导线。将导线上的血管皮套穿过进入股动脉，并提取导线。如有必要，请使用超声波指导。
3. 肾缺血-再灌注损伤诱导
- 静脉注射200IU/kg肝素钠，实现全身抗凝（目标活性凝血时间（ACT）>300s）。
- 通过在荧光镜下注射异位对比剂来识别肾脏动脉，进行血管造影。
注：为了降低对比度引起的肾毒性风险，用正常盐水在1：1溶液中稀释碘对比剂。为所有动物列出剂量，以确保等效剂量。 - 识别肾脏动脉，手动推进导管导管。
- 将 5F JL4 导管放置在左肾动脉中，穿过右胡萝卜动脉（图 1A）。
- 将第二个 5F JL4 导管放置在右肾动脉中，穿过左股动脉（图1A）。
- 使用导线在每个肾动脉中引导 5F 皮皮半透明血管成形术 （PTA） 扩张导管。
注：最好将气球放置在近鼻动脉，这样在气球膨胀后，肾动脉的分支或抵押物就不会获得专利。 - 将每个气球导管定位到位，并将压力线连接到每个导管。
- 检查压力监测器中是否有动脉脉冲波形，以确保导管的正确定位。
- 充气每个气球，目标是气球内约2.5 atm的压力（图1B）。
- 为了确认血液流向肾脏的停止，观察气球导管尖端脉冲波形的扁平化。
- 注射碘对比介质（1：1稀释），并检查肾血管的任何不透明。
注：还可以在气球上填充一个碘化对比剂，用于充气气球的可视化。然而，这种方法不像脉冲波形扁平化，以确认肾脏动脉的闭塞敏感。 - 60分钟后，小心地放气，从肾脏动脉中取出气球导管。
- 执行血管造影术（使用1：1稀释对比介质），以确认肾动脉分红和肾复灌（图1C）的建立。
- 从左股动脉取下 5F 血管造影护套。
- 在导管部位施加30分钟的硬性压力。
- 逆转肝素的作用，通过施用蛋白胺（3毫克/千克），直到ACT正常化。
- 要在术后期间对尿液进行取样，使用丝绸 2-0 缝合线将管子固定到 Foley 导管上，在皮肤上缝合中断。
- 将血管造影护套留在右胡萝卜动脉和右壶静脉中，然后用丝绸 2-0 缝合线固定它们，使用中断的缝合线，以便在整个研究过程中进行血液采样。
- 用丝绸 2-0 缝合线用连续缝合 2 层来关闭颈部切口。
- 在切口处施用布皮瓦卡因（3毫克/千克），以尽量减少疼痛。
- 在缺血期结束后，继续以 5 mL/kg/h 的 0.9% NaCl 为动物补充水分，总水合 2 小时。
- 在动物背部放置芬太尼贴片（25-50 μg/h），以尽量减少术后疼痛。
- 实施丁丙诺啡（0.005-0.1毫克/千克）肌肉注射，以尽量减少术后疼痛。
- 监测动物，并保持机械通风，直到醒来。
4. 动物恢复
- 醒来后，将动物安置在温度控制室中。
- 继续将动物从一侧侧转向另一侧，直到它恢复完全的意识和沉着的能力。
- 提供水和食物。
5. 功能评估
- 根据所需的协议收集血液和尿液样本。
注：在这项研究中，指定了以下时间点：基线（水化协议启动后和肾脏动脉闭合前1小时）、缺血末端和再灌注（2小时、6小时、24小时）。 - 收集动脉和静脉血样。将其存放在肝素锂或 EDTA 涂层真空器中，以便进行后续分析。
注：直接从导管中抽血，从导管动脉和血管中抽血。 - 从 Foley 导管中收集尿液样本，并将其存储在 15 mL 管中进行分析。
注：从连接到弗利导管的排水袋中收集尿液。 - 要确定尿液输出，清空排水袋并收集尿液 1 小时。
注：对于排水袋未连接到 Foley 导管的 6 小时时间点，关闭连接到 Foley 导管的管子 30 分钟，然后用 60 mL 注射器收集尿液以确定尿液输出。
6. 安乐死
- 复灌期结束后，进行麻醉和监测，如上所述。
- 继续水化与 0.9% NaCl 在 5 mL/kg/h.
- 使用动脉和静脉导管进行血液采样和佛利导管，以确定尿液输出。收集最后的血液和尿液样本并计算尿液输出。
- 使用从 xiphoid 到中骨盆的 10 刀片执行 15 厘米的中线腹腔切口。
- 使用直横向缩回器缩回腹部皮肤。
- 解剖腹壁的侧腹附件，以暴露左右复古腹腔。
- 识别并直截了当地剖析肾动脉和静脉。
- 用2-0丝绸缝合线将肾动脉和静脉连结，并进行双边肾切除术，收集整个组织标本，进行组织学和代谢分析。
- 用首选的安乐死方法（例如，灭绝、五巴比妥）对动物实施安乐死
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Representative Results
泛函分析
本研究的代表性结果来自6种动物，所显示的数据均值为平均值±标准误差。肾功能通过确定尿液输出、估计球状过滤率（eGFR）、血浆肌酸和血尿素氮（BUN）来评估。肾功能的生物标志物使用便携式化学分析仪进行评估。eGFR 根据以下公式计算： eGFR =1.879 × BW1.092/PCr0.6 （BW： 体重（千克;PCr： 等离子肌氨酸在毫克/dL）10，11。
经过60分钟的双边肾动脉闭合后，尿液输出量从3.6mL/kg/h±0.5mL/kg/h显著下降至0.2 mL/kg/h±0.1mL/kg/h（p <0.01）。在输注后，这一降幅仍然显著，为6小时（1.2 mL/kg/h±0.1 mL/kg/h;p = 0.02 与基线）和 24 h（1.3 mL/kg/h ± 0.4 mL/kg/h;p = 0.02 与基线）。同样，在 eGFR 中也观察到显著减少， 从基准线的 2.5 mL/kg/h ± 0.1 mL/kg/h 下降到缺血期末的 1.7 mL/kg/kg/h ± 0.1 mL/kg/h（p < 0.001）和 1.5 mL/kg/h ± 0.1 mL /千克/小时（<0.001）、1.2 mL/kg/h ± 0.1 mL/kg/h（p <0.001）和0.9mL/kg/h±0.1mL/kg/h（p <0.001）在2h， 6小时和24小时分别（图2A-B）。
等离子肌氨酸显著增加2小时（2.7毫克/分升±0.2毫克/分升;p <0.01），6小时（3.7毫克/分升±0.3毫克/分升： p < 0.001） 和 24 h （5.6 毫克/分升 ± 0.7 毫克/分升; p < 0.001） 的再灌注与基线相比 （1.1 毫克/分升± 0.1 毫克/分升）。BUN 在基线上为 6.5 毫克/分升± 0.8 毫克/分升，± 3.3 毫克/分升（< 17.8 毫克/分升 0.001） 和 36.2 毫克/分升 ± 2.9 毫克/分升 （p < 0.001） 在 6 小时和 24 小时的再灌注， （图2C-D）。
格罗斯解剖学和直学
在60分钟的双边肾缺血和24小时的复灌（图3A）结束时，有明显的坏死和出血区域，在两个肾脏中分布不均匀。马森的三色染色揭示了汇流凝血坏死，它位于肾皮层的近缘管。（图3B）。塑料嵌入部分（1 μm）也进行了评估，因为它们提供了组织学的重要细节（图3C）。所有马森的三色幻灯片都被评估为细胞坏死，刷边的损失，铸形成和管扩张。然后，实施急性管状坏死（ATN）的半定量评分系统：0（如果没有的话：1 如果低于 10%：2 如果介于 11%-25% 之间;3 如果介于 26%- 45% 之间：4 如果在 46%-75% 之间：和 5 如果大于 76%。ATN得分显示肾皮层严重受伤（得分4.5±0.3分）和美杜拉（得分2.7±0.4分）。
图1。实验模型的描述。（A）雌性约克郡猪（40-60公斤）被安热和灌注。左股动脉和右胡萝卜动脉用5F血管造影护套导管。右壶静脉线和福利尿导管也放置。肾动脉的选择性导管使用5F多用途导管进行。（B）肾动脉的闭塞使用在肾动脉近部充气的5F皮下半透明血管成形术（PTA）扩张导管进行，完全渗出血液流向肾脏60分钟。通过在主动脉中注射碘对比介质和检查肾脏血管的任何不透明性来确认闭塞。（C）在60分钟的遮挡后，气球被放气并小心地取出。进行血管造影，以确认肾动脉的轻度和肾复塞的建立。然后，这些动物被允许在接下来的24小时里在生理条件下重新灌输肾脏，然后被安乐死。血液和尿液样本在双边肾缺血前后采集，在闭合后2、6和24小时（用三角形表示的时间点）。这个数字已经从杜拉米斯等人修改了。请单击此处查看此图的较大版本。
图2。肾功能前后肾缺血- 复灌损伤。（A） 尿液输出： （B） 估计球状过滤率： （C） 血浆肌氨酸和 （D） 血尿素氮（BUN）。所有结果均显示为每个时间点的平均值和标准偏差。尿输出和缺血后的eGFR显著减少。因此，血浆肌氨酸和BUN显著增加。数据通过双向重复测量分析 ANOVA 与本杰明尼和霍奇伯格的虚假发现率 （n=6）。*p < 0.05 vs 基线;**p < 0.01 vs 基线;p < 0.001 vs 基线。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。肾缺血-再灌注损伤后24小时肾解剖和肾脏组织损伤。（A）左肾的毛解剖显示苍白区域，表明梗塞和红出血区后，60分钟的双边肾动脉闭塞和24小时的复发。（B）车辆的肾皮质显示主要近体管状结节的广泛凝固坏死，经过60分钟的缺血和24小时的再灌注（马森的三色，原始放大20倍）。（C）这些 1 μm 塑料（环状体同位素）嵌入部分更详细地演示了汇合管坏死，主要由细胞器肿胀和退行变化的基质组成（甲苯蓝色，原始放大 40 倍）。秤杆 = 200 μm。这个数字已经从杜拉米斯等人修改了。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
AKI是一种常见的临床疾病，影响全球6，12名住院成人患者中高达50%。需要临床相关的动物模型来进一步研究该病的病理生理学和潜在的治疗目标。虽然有几个木耳模型复制AKI，这些并没有完全模仿各自的临床场景和人体肾脏的解剖。这项研究提出了一个临床相关的猪模型，允许翻译给人类13。
在这里，协议描述了一种皮下的方法，它不仅在临床上相关，而且还最大限度地减少了炎症反应和伴随开放方法的感染风险。还应强调，一个一致的水化协议应用于所有动物，以实现最佳的血液机能控制，避免肾输液低11。当动物麻醉时，这很容易做到，但在提供脂肪水的恢复期间，这并不总是可以准确执行的。
应谨慎使用异位对比介质，以避免对比引起的肾毒性。这可以通过1：1或1：2稀释与正常的盐水实现。在这项研究中，我们使用的剂量比人类估计的安全阈值（3.33 mL/kg）低10倍。9，14。
其中，该研究使用eGFR评估肾脏功能的基础上，一个公式，占体重和血浆肌酸水平10，11。应当指出，虽然以前已记录过使用胰蛋白来确定GFR，但由于输液后严重低血压血管痉挛反应，在现行议定书中推迟了使用胰蛋白。这可以通过使用类固醇或肾上腺素在胰腺素管理之前避免.然而，根据每个研究设计，使用这些药物可能不合适。为此，使用了基于血浆肌氨酸和体重的验证公式来估计eGFR。确定 GFR 的另一种方法是使用公式： （尿肌氨酸 x 尿流速率） / （血浆肌氨酸 x 肾脏重量） 。
对于ATN评分的评估，使用马森的三色染色比传统的血氧林和欧辛染色更可取，因为它可以更好地跟踪组织损伤。另一种选择可能是使用塑料嵌入部分，这提供了更多的细节，因为它们允许更薄的切片样品11。AKI 的这种临床前模型可用于模拟几个临床场景，如肾脏移植、心力休克后肾低灌注（例如心肌梗塞、动脉瘤破裂、主动脉解剖）、肾缺血高风险的转导程序以及心肺闭合时间延长的心血管程序。
这项研究有一些局限性。这项研究只使用雌性动物。这样做是为了减少与尿导管相关的任何可能的影响，尿导管化在女性中比男性创伤较小。除了这一限制之外，该研究还使用了年轻、健康的动物，从而消除了可能与共存疾病有关的混淆变量。最后，目前的研究描述了一个高度可重复的大型动物模型肾IRI，可用于减轻AKI的负担。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢阿瑟·内德博士的帮助和指导。这项工作得到了理查德·阿和苏珊·史密斯总统创新奖、迈克尔·克莱因和家庭、西德曼家庭基金会、迈克尔·鲁金慈善基金会、肯尼思·格里芬慈善研究基金和波士顿投资委员会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container | Baxter | 2B1302 | For animal hydration |
| Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74% | CARDINAL HEALTH | 133311 | For visualizing the vasculature |
| Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag | BARD Inc | 802001 | For urine collection |
| BD Vacutainer K2 EDTA | BD | 367841 | For blood sample storage |
| BD Vacutainer Lithium Heparin | BD | 366667 | For blood sample storage |
| Betadine | Henry Schein | 6906950 | For skin disinfection |
| Bookwalker retractor | Codman | For skin retraction | |
| Bupivacaine 0.25% | Hospira | Administer at incision site for analgesia | |
| Buprenorphine SR | Zoo Pharm | 10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC | |
| Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4 | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | 7523-21 | For identification of the renal arteries |
| Cuffed endotracheal tube | Emdamed | To establish a secure airway for the duration of the operation | |
| EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor | GE Healthcare Madison WI | For oxygen saturation monitoring | |
| Encore 26 inflator | BOSTON SCIENTIFIC | 710113 | For inflating the balloon catheters |
| Ethanol 95% (Ethyl alcohol) | Henry Schein | For skin disinfection | |
| Fentanyl patch | Mylan | Dose: 25-50mcg/hr, TD | |
| Gold silicone coated Foley | TELEFLEX MEDICAL INC | 180730160 | For urine collection |
| Heparin sodium | LEO Pharma A/S | Dose: 200 IU/kg IV | |
| i33 ultrasound machine | Phillips | Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary | |
| Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | 6609-33 | For guiding the balloon catheters to the renal arteries |
| Intravenous catheter, size 20 gauge | Santa Cruz Biotechnology | Inc SC-360097 | For fluid administration |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supply, Inc. | 21283620 | Dose: 3%, INH |
| Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)" | Rudolf Medical | RU-1311-14M | For tissue dissection and cutting |
| Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring | Argon Medical | 041588505A | For pressure measurement |
| Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm) | CARDINAL HEALTH | 4400602X | For occlusion of the renal arteries |
| Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll | Smiths Medical | B1571/MX571 | For pressure measurement |
| Procedure pack | Molnlycke Health Care | 97027809 | Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc |
| Protamine | Henry Schein | 1044148 | For heparin reversal |
| Scalpel blade - size #10 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-010 | For the skin incisions |
| Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl | Peoplesoft | 1550 | For connecting tubings |
| Straight lateral retractor | Codman | For skin retraction | |
| Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk | CARDINAL HEALTH 1 | A185H | For suturing incision site and securing catheters |
| Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red | MERIT MEDICAL SYSTEM INC | MSS111-R | To administer the contrast agent |
| Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp | CARDINAL HEALTH 1 | BF309653 | For urine collection and flushing of the angiocath |
| Tilzolan (tiletamine/zolazepam) | Patterson Veterinary Supply, Inc. | 07-893-1467 | Dose: 4-6 mg/kg, IM |
| Xylazine | Putney, INC | Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM |
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