Summary
Detta protokoll beskriver kirurgiska och tekniska förfaranden som möjliggör realtid in vivo multiphoton fluorescence imaging av gnagare hjärnan under fokuserade ultraljud och microbubble behandlingar för att öka blod -hjärnbarriären permeabilitet.
Abstract
Blod- hjärnbarriären (BBB) är en viktig utmaning för framgångsrik leverans av läkemedel till hjärnan. Ultraljud exponering i närvaro av microbubbles har dykt upp som en effektiv metod för att tillfälligt och lokalt öka permeabiliteten av BBB, underlätta para- och transcellulär transport av droger över BBB. Imaging vaskulaturen under ultraljud-microbubble behandling kommer att ge värdefulla och nya insikter om mekanismerna och dynamiken i ultraljud-microbubble behandlingar i hjärnan.
Här presenterar vi ett experimentellt förfarande för intravital multiphoton mikroskopi med hjälp av ett hjärnskålen fönster i linje med en ring givare och en 20x objektiv. Denna uppsättning möjliggör hög rumslig och tidsupplösning av bilden av hjärnan under ultraljud-microbubble behandlingar. Optisk tillgång till hjärnan erhålls via ett kranialfönster med öppen skalle. Kort avlägsnas en 3-4 mm diameter bit av skallen, och det exponerade området i hjärnan förseglas med ett glastäcke. En 0,82 MHz ringgivare, som är fäst vid ett andra glasöverdrag, är monterad ovanpå. Agaros (1% w/v) används mellan givarens täckslip och täckslipet som täcker kranialfönstret för att förhindra luftbubblor, vilket hindrar ultraljudsutbredning. När sterila kirurgiska ingrepp och antiinflammatoriska åtgärder vidtas kan ultraljud-mikrobubblebehandlingar och bildbehandlingssessioner utföras upprepade gånger under flera veckor. Fluorescerande dextrankonjugat injiceras intravenöst för att visualisera kärlet och kvantifiera ultraljud-mikrobubble inducerade effekter (t.ex. läckagekinetik, kärlförändringar). Detta dokument beskriver kranial fönster placering, ringgivare placering, imaging förfarande, vanliga felsökning steg, samt fördelar och begränsningar av metoden.
Introduction
En viktig utmaning för att behandla neurologiska störningar är närvaron av blod - hjärnbarriären (BBB). BBB begränsar hydrofila, laddade, polära och stora (> 400 Da) molekyler från att komma in i hjärnan parenkyma1. En metod som för närvarande används för att leverera terapier över BBB i hjärnan parenkym är att använda stereotaktiska intrakraniell injektioner2. Andra mindre invasiva metoder som undersöks hindras av komplexiteten i de tekniker som används, såsom att utforma läkemedel för receptormedierad leverans över BBB3, eller är begränsade i den rumsliga precisionen hos riktade områden, såsom intranasala injektioner4 eller administrering av hyperosmotiska lösningar5.
Användningen av ultraljud i samband med systemiskt injicerade mikrobubblor, ett ultraljud kontrastmedel, har utvecklats som ett icke-invasivt sätt att tillfälligt öka permeabiliteten hos BBB6. Genom att använda en fokuserad givare7 eller en styrbar fasad av givare8,9, ultraljud kan riktas till utvalda områden i hjärnan med millimeter nivå precision, minimera off-target effekter. Ultraljud-mikrobubble behandlingar kan anpassas till varje ämnes hjärnans anatomi genom att använda magnetisk resonans imaging vägledning7,10,11,12,13,14 eller stereotaktiska ramar15. Dessutom kan omfattningen av ökningen av BBB:s permeabilitet kontrolleras i realtid genom att övervaka akustiska utsläpp från mikrobubblor16,17,18. Kliniska prövningar som undersöker säkerheten och genomförbarheten av ultraljudsmikrobubblebehandlingar pågår för närvarande över hela världen (t.ex. ClinicalTrials.gov identifierare NCT04118764).
Ultraljud-microbubble BBB behandlingar utvärderas vanligtvis genom att bekräfta behandling inducerad ökningar i BBB permeabilitet, visualiseras i kontrast-förbättrad magnetisk resonans imaging, eller genom färg extravasation i in vivo imaging eller ex vivo histologi. De flesta mikroskopiska analyser har dock utförts ex vivo, efter slutförandet av ultraljud-microbubble behandlingar11,19, och därmed saknar dynamiska biologiska svar under, och omedelbart efter, ultraljud exponering. Realtidsavbildning utförs under ultraljud exponering kan bidra till att förstå mekanismerna som driver ultraljud-microbubble BBB behandlingar samt nedströms svar, vilket kan öka vår förståelse för dess terapeutiska tillämpningar. Dessutom skulle användningen av kroniska hjärnskålen fönster med in vivo imaging tekniker göra det möjligt för longitudinella studier att utvärdera tidsmässiga aspekter av ultraljud-microbubble behandlingar.
Målet med detta protokoll är att beskriva de kirurgiska och tekniska förfaranden som krävs för att genomföra multifoton-avbildning i realtid av ultraljud-mikrobubblebehandlingar för akuta och kroniska studier på gnagare (figur 1). Detta uppnås i två delar: för det första att skapa ett hjärnskålen fönster för att möjliggöra in vivo imaging, och andra, att montera en ring givaren på toppen för att möjliggöra samtidig ultraljudsbehandling och imaging. Hjärnskålen fönster har använts i stor utsträckning av neuroscientists för in vivo imaging av neurovaskulära koppling20, β-amyloid patogenes21 och neuroimmunology22, bland andra. I detta protokoll beskrivs kirurgiska ingrepp för att skapa akut (icke-återhämtning) och kroniska (återhämtning) hjärnskålen fönster i musen och råtta skallen beskrivs. Hjärnskålen fönster metoder, särskilt för kroniska experiment, har dokumenterats väl23,24,25. För att vara förenlig med befintlig litteratur kommer termerna "akut" och "kronisk" att användas i hela detta protokoll. Utformningen av ringgivare för in vivo-avbildning har också tidigare beskrivits26. Trots tillgången till dessa tekniker och de insikter som kan erhållas från realtidsavbildning av ultraljud-mikrobubble behandlingar, finns det mycket få forskningslaboratorier som framgångsrikt har publicerat litteratur med denna teknik26,27,28,29,30,31,32 . Som sådan, i detta protokoll, beskrivs kirurgiska och tekniska detaljer för att genomföra dessa realtid ultraljud-microbubble experiment. Medan de specificerade ultraljudsbehandling och imaging parametrar har optimerats för BBB experiment, andra effekter av ultraljud exponering för hjärnan, såsom neuromodulation33,34, β-amyloid plack övervakning31 och immun cell svar32, kan också undersökas med denna teknik.
Protocol
Alla följande försök godkändes av och genomfördes i enlighet med Norges livsmedels- och säkerhetsmyndigheten, Sunnybrook Research Institute's Animal Care Committee och Canadian Council on Animal Care.
1. Materialberedning
- Förbered de material som behövs för hjärnskålen fönster kirurgi och ultraljud-microbubble behandlingar. För kroniska kranialfönster är steriliserade verktyg och material, ett sterilt kirurgiskt utrymme och läkemedelsadministration före och efter operationen nödvändiga23,24,25.
- Givare och täckslipsberedning
- Kontrollera givarens fysiska integritet: leta efter sprickor och bucklar. Se till att elektroderna på givarens ovansida och sida är intakta.
- Sätt cyanoakrylatlim i en liten maträtt. Använd en applikator för att sprida ett tunt lager lim på givarens yta.
- Placera givaren på glasskyddet. Tryck ner ordentligt i 20-30 s.
OBS: En 3D-utskriven form kan användas för att underlätta justeringen av glasöverdraget med ringomvandlaren, vilket säkerställer ett fast och jämnt tryck på täckslipet och ringomvandlaren (figur 2). - Kontrollera om det finns bubblor mellan givaren och täckslätet. Om det finns bubblor, ta av täcket och upprepa från steg 1.2.3., eftersom luft hindrar ultraljudsutbredning. Härda över natten vid rumstemperatur.
- När du har fastnat på ett glasöverdrag, matcha givaren (figur 3).
OBS: Detta protokoll använder en egentillverkad bly zirkonat titanat ringgivare (10 mm ytterdiameter, 1,4 mm tjocklek, 1,2 mm höjd)35, matchad med en 50 Ω impedans och 0° fasbelastning med en anpassad matchande krets. Givaren körs vid 0,82 MHz i tjockleksläge och producerar en cirkulär brännpunkt cirka 1 mm under täckslipet. Ringgivare med liknande egenskaper (10 mm ytterdiameter, 1,5 mm tjocklek, 1,1 mm höjd) har karakteriserats26 och använts i stor utsträckning för multifotonmikroskopiexperiment27,28,29,31,32,36.
- Återanvändning av givare och byte av täckslip
- Byt ut täckslipet om det är sprucket eller har skräp (t.ex. päls, lim) från föregående experiment. För att ta bort täcket, lös upp limet genom att sänka givaren och täckslipet i aceton i 20 min.
OBS: Aceton kan påverka givarens och/eller elektrodernas integritet. Kontrollera med tillverkaren innan du fortsätter med det här steget. - Kontrollera om acetonen har löst upp limet genom att försiktigt dra i täcket med tång. Kontrollera en gång var 10:e minut för att undvika långvarig acetonexponering.
- Byt ut täckslipet om det är sprucket eller har skräp (t.ex. päls, lim) från föregående experiment. För att ta bort täcket, lös upp limet genom att sänka givaren och täckslipet i aceton i 20 min.
2. Beredning av djur
- Bedöva djuret genom att använda en blandning av medicinsk luft, syre och isofluran i en induktionskammare.
OBS: Användning av syre som bärgas har rapporterats påverka halveringstiden för mikrobubblor37,38 och minska omfattningen av ultraljud-mikrobubble inducerad ökning av BBB permeabilitet27, men kan också minska risken för hypoxi och dödlighet39. Välj bärgaser baserat på projektets mål och veterinärrådgivning. Injicerbara anestetika såsom en ketamin/xylazincocktail kan också användas. Det är dock lättare att kontrollera anestesi- och syrenivåerna i blodet när man använder inandningsbar bedövningsmedel. - Kontrollera att djuret har uppnått ett tillräckligt anestesiplan genom att utföra en bit nypa. Väg djuret för att bestämma dosen av dextran, mikrobubblor och läkemedel att administrera. Ta bort pälsen från djurets huvud och placera djuret på en stereotaktisk ram.
- För akuta experiment måste tillgång till systemcirkulationen fastställas för dextran- och mikrobubbleinjektioner. För att uppnå detta, sätt in en 27 g kateter i en svansven.
OBS: Även om retro-orbital injektioner också är möjliga, tail vener rekommenderas på grund av det begränsade arbetsutrymmet i huvudet området under multiphoton imaging. - Överför djuret till den stereotaktiska ramen och byt anestesin till noskonen. Håll djurets kärntemperatur på 37 °C med hjälp av en värmekälla, till exempel en värmedyna eller en handske fylld med varmt vatten.
- Övervaka djurtemperaturen med hjälp av en rektalsond och djurfysiologi med hjälp av en pulsoximeter. Applicera oftalmisk salva. Injicera lämpliga smärtstillande och/eller antiinflammatoriska läkemedel före operationen (se Tabell över material).
- Innan du påbörjar hjärnoperationen, kontrollera anestesiplanet och djurets hjärtfrekvens, O2-mättnad , andningshastighet och temperatur.
- För att påbörja hjärnskålsoperationen, ta bort pälsen på huvudet genom att applicera en depilatorisk kräm och/eller använda pälsklippare. Ta bort pälsen mellan ögonen till den främre halvan av nacken (figur 4A).
OBS: Långvarig kontakt med depilatory krämen kommer att bränna huden. För kroniska hjärnskålen fönster operationer, tvätta hårbotten med alternerande våtservetter av betadin och 70% EtOH efter päls borttagning. Förbered operationsutrymmet för steril kirurgi. Steriliteten måste bibehållas fram till steg 2.15. - För att ta bort hårbotten, lyft huden mellan ögonen med tång som hålls i den icke-dominerande handen, längs sagittal suturen. Använd böjd sax och ta bort huden för att exponera parietalbenen (figur 4B). Applicera fast tryck med en bomullspinne om det finns blödning från skallen eller hårbotten; blödning måste stoppas innan du går vidare till nästa steg.
OBS: Vid akuta operationer kan huden skjutas tillbaka och fästas vid skallen med flytande cyanoakrylatlim eller vävnadslim. - Ta bort periosteumet som täcker skallens yttre yta med bomullspinnar.
- Använd ett operationsmikroskop (6-25x) och en tandborr (0,5 mm borrborr, medelhastighet), skissera en cirkel på parietalbenet för att markera önskad plats för kranialfönstret på skallen (figur 5). Undvik sagittal sutur, lambda och bregma, eftersom dessa områden är tunnare och överlagrar stora blodkärl.
OBS: För att underlätta borrning kan en kontur av kranialfönstret ritas på skallen med hjälp av en markör och stencil (figur 5A). För råttor kan det vara lättare att borra en rektangulär, istället för ett cirkulärt kranialt fönster. På grund av råttskallebenets tjocklek, använd en borrkrona på 0,7 mm för att skissera kranialfönstret i det kompakta benet innan du använder en borrkrona på 0,5 mm för att slutföra borrningsprocessen. - Applicera försiktigt tryck med borrkronan; överdrivet tryck ökar risken för skador på hjärnvävnad. För att förhindra att skallen överhettas under borrning, droppa saltlösning på skallen med en spruta eller applicera en bit kirurgisk svamp som blötläggs i saltlösning.
- Växla mellan att borra och kyla skallen tills den resulterande benön separeras från resten av skallen. Kontrollera borrningsframsteget genom att applicera försiktigt tryck på benön med tång eller borrkronan. Fortsätt borra tills benön separerar från resten av skallen.
OBS: Små sprickor i de tunnaste områdena i skallen är en bra indikation på att borrningen är nästan klar. Att försöka ta bort benön i förtid kan orsaka att benbitar tränger in i hjärnvävnaden, skadar duran och orsakar inflammation och blödning. - Ta bort benön genom att använda ett par fina tångar för att greppa kanterna, eller det övre kompakta benskiktet, på benön (figur 6A). Se till att hjärnan hålls fuktig genom att applicera en bit kirurgisk svamp som har fördränkts i saltlösning. Om blödning observeras, placera den kirurgiska svampen på den region som blöder. Fortsätt inte till nästa steg förrän blödningen har upphört.
OBS: Om blödningen kvarstår efter 5 min kan djuret inte användas för multifoton av avbildningsexperiment. För råttor kan det vara nödvändigt att ta bort duran om den är tjock. För att ta bort duran, använd hög förstoring på driftsmikroskopet och ett par fina tångar. - För att placera ett kranialfönster, plocka upp ett glasöverdrag med ett par tångar, placera en droppe saltlösning på ena sidan och manövrera den över hålet i skallen. Se till att det inte finns några luftbubblor under täckslätet.
OBS: Använd ett 5 mm glasöverdrag för möss och 8 mm för råttor. För råttor, på grund av skallbenets tjocklek, använd en agaroselösning istället för saltlösning för att fylla i utrymmet mellan täckslipet och hjärnan. Givaren och dess täckslip kan också fästas direkt på skallen, istället för att använda ett separat täckslip för kranialfönstret. För det här alternativet fortsätter du till steg 3.1. Se figur 1 för mer information. - Sprid ett lager cyanoakrylatlim runt täckslipets omkrets (figur 6B) för att fästa det på skallen. Se till att det inte finns något lim under täcket. Tryck på täckslipet för att säkerställa att lim inte kommer i kontakt med hjärnan.
- När limet är helt torrt, jämna ut limets yta med hjälp av tandborren. Se till att allt limskräp avlägsnas från operationsområdet.
OBS: För kroniska kranialfönster, injicera nödvändiga postkirurgiska läkemedel (se Tabell över material), ge salva för sårvård och mjuka livsmedel och återställa djuret under en värmelampa.
3. Placering av ringgivaren
- Förbered 1% (w/v) agarose-lösningen. Tillsätt 0,1 g agaros och 10 ml PBS (1x) eller saltlösning i en liten bägare eller Erlenmeyerkolv. Koka lösningen tills agarosen är helt upplöst genom att placera bägaren på en kokplatta eller värma lösningen i en mikrovågsugn (30-45 s).
- Steg 3.2-3.5 är tidskänsliga eftersom agaroslösningen kyls snabbt. Dra tillbaka ~ 0,5 ml agaros i en 1 ml spruta.
OBS: För att skydda hjärnans integritet, se till att agarosens temperatur approximerar kroppstemperaturen före användning. - Sätt agarosen liberalt på täcket på kranialfönstret.
OBS: Om vävnad blanches, temperaturen på agaros var för hög; Djuret måste avlivas. Om det inte finns något separat täckslip som täcker hjärnan (dvs. givaren och dess täckslip placeras direkt på hjärnan, se steg 2.14), ska agaros deponeras på hjärnans yta i detta steg. - Placera givaren över kranialfönstret (bild 6C). Applicera fast tryck så att det finns minimal agaros mellan givaren och kranialfönstret. Se till att givaren är centrerad (XY-plan) och parallell (Z-plan) till kranialfönstret och att det inte finns några luftbubblor i agaroset.
- När agarosen har svalnat till en jello-liknande konsistens, skär bort överflödig agaros från omkretsen av givarens täckslip med en spatel eller skalpell. Se till att det inte finns några luftbubblor under givarens täckslip.
- Använd en spatel, sprid ett lager cyanoakrylatlim över omkretsen av givarens täckslip, som sträcker sig till skallen, så att givaren är fast fastsatt vid skallen.
- Håll fast tryck på givaren tills limet har torkat helt (10-15 min).
4. Multifoton mikroskopi imaging
- Placera djuret under objektivlinsen (figur 7A). Se till att objektivet är centrerat i ringgivaren och parallellt med givaren (figur 7B). Om en objektivlins för vattensänkning används fyller du ringgivarens mittpunkt med avjoniserat och avgasat vatten.
OBS: Avgasat vatten är viktigt för korrekt ultraljudsutbredning. - Börja med objektivet i dess högsta läge och sänk sedan objektivet långsamt tills det är i ringgivaren (figur 7A, B). Se till att objektivlinsen inte kolliderar med givaren eller täckslipen.
OBS: Växla mellan okularet för att kontrollera om objektivlinsens Z-position är i plan med hjärnans yta och med öga för att säkerställa att objektivlinsen inte kolliderar med givaren eller täcket. Det kan vara lättare att visualisera pialkärlen genom okularet efter injektion av fluorescerande dextran genom svansvenen (figur 7C). - Förbered multifotonmikroskopet för avbildning.
OBS: Detta protokoll använder ett upprätt multifotonmikroskop och en 20-25x objektiv som har ett arbetsavstånd på 2 mm, vilket är tillräckligt för att fokusera bortom täckslipet i hjärnans parenkym. - Förbered dextran. Tillsätt lämplig mängd PBS till injektionsflaskan med dextran, enligt tillverkarens instruktioner. Vortex dextran-lösningen i 1-3 min för att säkerställa att dextranpulvret är helt upplöst. Injicera dextranlösningen i svansvenen.
- Konfigurera en avbildningssökning
- Se till att objektivlinsen är parallell med hjärnan med hjälp av okularen. Luta djuret för att korrigera för XZ- och YZ-feljusteringar.
- Välj ett synfält i ett multifotonmikroskop. Ställ in en XYZ-skanning före ultraljudsexponering för att få en baslinjebild av vaskulaturen före ultraljudsexponering.
OBS: Typiska bildparametrar är följande: 300-800 μm i djup, 2-5 μm stegstorlek och 10-20 tidsstaplar. Se till att objektivlinsen inte kommer i kontakt med givaren eller täcket vid dess lägsta punkt under bildsekvensen.
5. Ultraljudsexponering
- Se till att alla BNC-kablar är korrekt anslutna (bild 3).
- Ställ in en XYZT-bildskanning som är tillräckligt lång för att fånga bildstaplar före, under och efter ultraljudsmikrobubblebehandlingar.
- Förbered mikrobubblorna genom att följa tillverkarens instruktioner. Injicera mikrobubblorna i svansvebenen och börja avbilda.
OBS: Mikrobubbleinjektioner kan göras med en infusionspump för att säkerställa konsekvent injektionshastighet och för att möjliggöra samtidig mikrobubbleinjektion och avbildning. Om mikrobubblor ska injiceras under avbildningen, se till att bakänden lätt kan nås utan att detektorerna utsätts för omgivande ljus. - Påbörja ultraljudsbehandlingen.
OBS: Typiska ultraljudsbehandling parametrar är följande: 10 ms cykler, mekaniskt index på 0,2-0,4 och puls repetition frekvenser mellan 1-4 Hz. Ultraljudsbehandling och microbubble parametrar som används i prekliniska ultraljud-microbubble studier har studerats utförligt och är väl dokumenterade i litteraturen (t.ex. se 40 för en översyn). - Fortsätt multiphoton imaging under hela ultraljudsbehandling och efter slutet av ultraljudsbehandling. Var observant för dextran extravasation från blodkärl, eftersom detta tyder på ökningar av BBB permeabilitet.
OBS: Om dextran upptäcks i det extravaskulära utrymmet, men i synfältets periferi, kan det påverkas blodkärl utanför synfältet. Detta kan bero på feljustering av givaren med objektivlinsens fokus. I det här scenariot är det lättare att justera synfältet genom att flytta objektivlinsen eller genom att flytta djuret än att justera givaren. - När avbildningen är klar avlivar du djurets livmoderhalscancer förskjutning under djupbedövning eller CO2-kvävning. För kroniska kranialfönster, sprida ett lager av dental cement på den exponerade skallen.
OBS: För kroniska kranialfönster kan huden som omger fönstret sutureras, även om detta inte är nödvändigt, på grund av avlägsnandet av hårbotten i steg 2.8.
6. Bildanalys
- Exportera bildstaplar.
- Analysera bilder med bildanalysprogramvara (t.ex. Olympus Fluoview, ImageJ/FIJI, Bitplane Imaris, ThermoFisher Scientific Amira) och/eller programmeringsverktyg (t.ex. Python, MATLAB).
Representative Results
Framgångsrika ultraljud-microbubble behandlingar kan upptäckas genom extravasation av fluorescerande dextran från intravaskulära till extravaskulära utrymmet (figur 8), vilket indikerar en ökning av BBB permeabilitet. Beroende på ringgivarens tryckfält påverkas pialkärl och/eller kapillärer.
För att utvärdera de kärlförändringar som orsakas av ultraljud-mikrobubble behandlingar, diametern på fartyget av intresse kan mätas före, under och efter ultraljud-microbubble behandling (figur 9). Detta kan göras manuellt i en kommersiellt tillgänglig programvara (t.ex. Olympus Fluoview-programvara). Under bildförvärv kan bolus dextran injektioner och linje skanningar också användas för att bedöma blodflödet30,41. För att utvärdera kinetiken hos dextranläckage som en representativ modell för läkemedelsleverans kan signalintensiteten mellan de intra- och extravaskulära utrymmena utvärderas med hjälp av verktyg som MATLAB26,27,29,41 (figur 10).
Ytterligare bildbehandling kan uppnås med ImageJ/FIJI. ImageJ/FIJI är en programvara med öppen källkod som är kompatibel med MATLAB och är väl lämpad att utföra vanliga analyser i biologisk bildanalys, såsom mätning av kärlförändringar, eller längden eller avståndet mellan fluorescerande föremål (t.ex. β-amyloid plack till blodkärl). Bildbehandlingspipelines som skapats i ImageJ/FIJI kan automatiseras genom att skriva anpassade makron.
Mer komplexa analyser, såsom 3D-segmentering av blodkärl och cellspårning, kan uppnås med hjälp av mer avancerad, halvautomatisk programvara (figur 11). Efter segmentering kan mer specifika analyser utföras, såsom klassificering av blodkärl som arterioles, venule eller kapillärer, baserat på diameter, förgrening, tortuositetsmönster och flödesriktning42,43. Maskininlärningsalgoritmer har också utvecklats för att automatisera blodkärlssegmentering22,44.
Bild 1: Allmänt arbetsflöde för intravitala multifoton ultraljud-microbubble hjärnexperiment. Ett allmänt arbetsflöde för intravital multiphoton ultraljud-microbubble hjärnan experiment beskrivs i detta protokoll visas. Det finns 6 steg: (A) Animalpreparat för (A1) möss och (A2) råttor, (B) Dextran injektion, (C) Microbubble injektion, (D) Förbehandling imaging, (E) Behandling och avbildning, (F) Efterbehandling imaging och dataanalys. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Tvärsnitt och ovanifrån av 3D-printad form. (A) Tvärsnitt av formen. Ett tunt lager cyanoakrylatlim appliceras på ringgivarens övre yta, och ett täckslip placeras ovanpå. En stämpel kan användas för att applicera fast, jämnt tryck på täcket och ringomvandlaren. (B) Ovanifrån av formen. Ett hack kan läggas till i formen för att underlätta avlägsnandet av den beredda givaren. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Ultraljudsundersökning. Typisk hårdvara för ultraljudsexperiment visas. Ultraljudsparametrar ställs in och utlöses av signalgeneratorn och förstärks av förstärkaren. En effektmätare kan användas för att registrera framåt- och reflekterade krafter innan signalen skickas till matchningsrutan, som matchas med givaren. Alla anslutningar uppnås med BNC-kablar om inget annat anges. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Område för pälsborttagning och borttagning av hårbotten. B) Avlägsnandet av hårbotten bör vara tillräckligt för att exponera parietalbenen. Blödningen måste stoppas innan du fortsätter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Kontur av kranialfönstret. Kranialfönstret ligger på ett parietalben. A) En kontur av kranialfönstret kan dras på skallen för att underlätta borrningsprocessen. (B) Konturen av kranialfönstret kan ses efter borrning genom det kompakta benet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 6: Kranialt fönster och givares inriktning. (A) Kranialfönstret skapas på ett parietalben. Benön har tagits bort och exponerat hjärnan under. B) Kranialfönstret är komplett när ett täckglas är förseglat på skallen med cyanoakrylatlim. (C) Givaren är centrerad till kranialfönstret och klibbad med cyanoakrylatlim. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 7: Placering av objektivlins och givare. C) Blodkärl fyllda med fluorescerande dextran är synliga genom okularen under epifluorescens. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Maximal projektion multifoton bilder av ultraljud-microbubble inducerad ökningar i BBB permeabilitet. Maximal projektion bilder av vaskulatur (A) före och (B) efter ultraljud-microbubble behandlingar. Framgångsrika ultraljud-microbubble behandlingar kan bekräftas genom att observera ökningar i BBB permeabilitet efter behandling, visualiseras som fluorescerande dextran extravasation (pilar). Skalstång: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Analys av vasomodulation framkallas av ultraljud-microbubble behandlingar. Maximal projektion bilder av cerebrala blodkärl före, under och efter ultraljud-microbubble behandlingar. Mikrobubblor finns i alla bilder. Jämfört med (A) pre-treatment villkor, klar vasomodulation kan observeras (B) under ultraljud-microbubble behandlingar (röda pilar). Ultraljud-microbubble medierade ökningar av BBB permeabilitet är också uppenbara efter behandling från läckage av fluorescerande dextran från intravaskulära till extravaskulära utrymmet (gula pilar). (C) När ultraljudet stängs av återgår kärldiametrar till förbehandling, baslinjestorlekar. (D) Kärlförändringar kan analyseras genom att man ritar upp diametern på det intressanta kärlet före, under och efter ultraljudsmikrobubblebehandling. Skalstång: 100 μm. (Opublicerat arbete). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 10: Analys av läckagekinetik efter ultraljud-mikrobubble behandlingar. Ökning av BBB permeabilitet visualiseras som läckage av fluorescerande dextran från intravaskulära till det extravaskulära utrymmet. Förändringar i BBB permeabilitet är uppenbara när man jämför bild stackar förvärvade (A) före och (B) efter ultraljud-microbubble behandlingar. (C) Läckagekinetik kan analyseras genom att spåra dextrans intensitet, volym och hastighet i extravaskulära fack (gul rektangel). Skalstång: 50 μm. (Opublicerat arbete.) Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 11: Blodkärlssegmentering av multifotonmikroskopi XYZ-stack. (A) Djup (XYZ) stack av blodkärl i en transgen EGFP råtta. Blodkärl visualiseras via intravenös injektion av fluorescerande Texas Red 70 kDa dextran (röd). Den gröna kanalen visar fluorescerande celler och vävnad autofluorescens. (B) 3D-rekonstruktioner av blodkärl skapas och färgkodas sedan enligt blodkärlstyp för att underlätta typspecifika analyser. Ven/venule är blå, artärer/arterioles är röda och kapillärer är cyan. Skalstång: 50 μm. Rekonstruktioner som skapats med Bitplane Imaris. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Intravital multifoton mikroskopi övervakning av hjärnan är ett värdefullt verktyg för att studera hjärnans svar under ultraljud exponering. Såvitt vi vet är protokollet som beskrivs här den enda metoden för att genomföra multifoton mikroskopi imaging av hjärnan parenkym under ultraljud-microbubble behandlingar. Skapandet av hjärnskålen fönster och användning av ring givare tillåter realtid övervakning av vaskulär, cellulära och andra nedströms svar på ultraljud-microbubble behandlingar vid hög rumsliga och tidsmässiga upplösning. Andra grupper har utfört multiphoton mikroskopi imaging efter slutförandet av ultraljud-microbubble behandlingar, och därmed saknas realtid svar av hjärnan parenchyma till behandlingar19. Förfarandet som beskrivs erbjuder förbättrad tidsmässig kontroll, så att insamling av data som kan hjälpa till att belysa de akuta mekanismerna bakom ultraljud-microbubble behandlingar. Kvantitativa och kvalitativa data kan extraheras och analyseras från de förvärvade bildstackarna, såsom extravasation kinetik27,29,30, förändringar i β-amyloid plack volym31 och celldynamik32.
Flera felsökningssteg har markerats i protokollet. För det första betonades kirurgiska steg som är särskilt mottagliga för operatörsfel, såsom användning av agaros under hjärnskålen fönsterkirurgi och placering av givaren. Åtgärder för att förhindra djurs obehag och död tillhandahölls också, inklusive övervakning av djurfysiologi under kirurgi och grundligt virvlande dextran före injektion. För det andra betonades också fysiska specifikationer för givaren och justeringen av objektivet, givaren och hjärnskålen fönstret. Specifikationerna för ringgivaren och dess akustiska egenskaper skall fastställas med hänsyn till den objektiva lins som används och djurmodellen. Specifikt måste ringgivarens inre diameter vara tillräckligt stor för att omge objektivlinsen, men tillräckligt liten för att monteras säkert på djurets skalle. Dessutom måste givarens fokusområde anpassas till det område för den använda objektivlinsen.
En vanlig utmaning är att kranialfönstret och ringgivaren är vinklade i förhållande till objektivet. Korrekt centrering (XY) och inriktning (Z) av objektivet med hjärnskålen och givaren säkerställer att givarens brännyta, och därmed regionen för behandlad hjärnvävnad, överensstämmer med bildfältet och minskar risken för kollision mellan objektivet och givaren under avbildning. Inriktning kan uppnås genom att justera djurets huvudposition och/eller genom att rotera den stereotaktiska ramen som den är fastsatt i.
Mikroskopkomponenter (t.ex. detektorer, stråldelare) och parametrar för bildförvärv bör väljas utifrån studiens syfte. Här används en objektiv lins med lång brännvidd (> 2 mm) på grund av närvaron av täckslip(erna) och ringgivaren som ligger mellan objektivet och hjärnan. Ett upprätt mikroskop rekommenderas också eftersom det ger mer utrymme att manövrera djuret, särskilt för hjärnexperiment. För att fånga kinetiken hos ultraljud-microbubble inducerad läckage av intravaskulära färgämnet är en hög temporal upplösning gynnsam, vilket kan uppnås med hjälp av ett resonansskanningssystem. Att kombinera detta med ett högkänslighetsdetekteringssystem, såsom galliumarsenidfosfid (GaAsP) detektorer, kommer också att resultera i mer gynnsamma bilder.
Det experimentella förfarandet som presenteras har flera begränsningar. För det första är det kirurgiska ingreppet ganska invasivt och har rapporterats orsaka inflammation45, även om inflammation kan minimeras46. Dessutom observerades immunsvar som framkallas av hjärnskålen fönster operationer att lösa av 2-4 veckor efter kirurgi23,24,25. Dessutom kan borrningsprocessen, särskilt när den utförs med överdriven kraft eller hastighet, orsaka skador på underliggande vävnad på grund av generering av värme, vibrationer och tryck som appliceras. Hjärnskålen fönster operationer och multiphoton imaging har också observerats för att påverka hjärnans temperatur47. Dessa begränsningar kan minskas i viss utsträckning genom noggrann skapande av orörda hjärnskålen fönster, korrekt återhämtning av djur med kroniska hjärnskålen fönster och underhåll av normotermisk kroppstemperatur med hjälp av en värmekälla med återkoppling kontroll. För det andra begränsas bilddjupet av mikroskopet och objektivet som används. Till exempel kan effekten av ultraljud-mikrobubblebehandling i djupare hjärnstrukturer, såsom hippocampus, inte studeras utan mer invasiva åtgärder, såsom avlägsnande av övergående kortikal vävnad48 eller användning av mikrolenser i samband med kortikal penetration49. Att använda en objektiv lins med långt arbetsavstånd kan lösa problemet i viss utsträckning, men ljuspenetration är också begränsad på större djup.
Medan de representativa bilderna av detta protokoll förvärvades från vilda gnagare, kan det presenterade experimentella förfarandet också tillämpas på transgena djur och sjukdomsmodeller, såsom Alzheimers sjukdom31. Ultraljud experiment som inte är relaterade till BBB modulering, såsom ultraljud-inducerad neuromodulation, kan också övervakas med hjälp av detta protokoll33,34. Andra möjliga tillämpningar kan uppnås genom att använda olika mikroskop- eller detektoruppsättningar, till exempel att para ihop ett konfokalt mikroskop med en ultrahög fartkamera50. Medan fotobleaching och fototoxicitet är jämförelsevis sämre i konfokala mikroskop på grund av att den stora excitation volymen, ultra-höghastighets imaging kan möjliggöra visualisering av hjärnan kapillär endotel cell-microbubble interaktioner med hög temporal upplösning, som ytterligare kan belysa mekanismerna som driver ultraljud-microbubble BBB behandlingar. Sammanfattningsvis ger det beskrivna protokollet en metod för att övervaka vaskulär och cellulära effekter som induceras av ultraljud-microbubble BBB experiment i realtid, vilket ger ett verktyg för att ytterligare bestämma mekanismerna som driver dessa behandlingar, samt belysa nedströms svar av hjärnan parenkym till ultraljud-microbubble behandlingar.
Disclosures
Charissa Poon, Melina Mühlenpfordt, Marieke Olsman och Catharina de Lange Davies förklarar inga ekonomiska eller icke-finansiella konkurrerande intressekonflikter. Spiros Kotopoulis är heltidsanställd och äger aktier i EXACT Therapeutics AS, ett företag som utvecklar ultraljud och mikrobubble/ klusterförbättrad läkemedelsleverans. Kullervo Hynynen är grundare av FUS Instruments, från vilken han får icke-forskningsrelaterat stöd.
Acknowledgments
Djurens inhysas av Comparative Medicine Core Facility (CoMed, NTNU). Figur 3 skapades i BioRender.com. Videoinspelning och redigering gjordes av Per Henning, webbansvarig vid Fakulteten för naturvetenskap vid NTNU. Projektet finansierades av Norges tekniska universitet (NTNU, Trondheim, Norge), Norges forskningsråd (RCN 262228), Canadian Institutes of Health Research (FDN 154272), National Institute of Health (R01 EB003268) och Temerty Chair in Focused Ultrasound Research vid Sunnybrook Health Sciences Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ring transducer placement | |||
| Agarose (powder) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml) | VWR | 213-0462 or 214-1130 | |
| Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1363589 | |
| Glass coverslips (13 mm) | Thermo Fisher Scientific | CB00130RA120MNT0 | Coverslip for ring transducer. |
| Hot plate or microwave | Corning | PC-400D | To heat agarose solution. |
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ring transducer | Custom-made | Custom-made | Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518 |
| Rubber stopper | VWR | 217-0867 | |
| Animal preparation and drugs | |||
| Bupivacaine*A | Aspen | 169912 | Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site. |
| Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery. |
| Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c.. |
| Carprofen*C | Pfizer | DIN 02255693 | Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery. |
| Depilatory cream | Veet | N/A | For complete fur removal after trimming. |
| Dexamethasone*C | Sandoz | DIN 00664227, 2301 | Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery. |
| Enrofloxacin*C | Bayer | DIN: 02249243 | Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery. |
| Fur clippers | Aesculap | 90200714 | Exacta/Isis. |
| Heating pad | Physitemp Instruments INC | HP-1M | |
| Isoflurane | Baxter | ESDG9623C | Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic. |
| Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery. |
| Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose rat: 1 mg/kg, s.c. |
| Pulse oximeter | STARR Life Sciences Corp | N/A | MouseOx. |
| Stereotaxic frame | Kopf | Kopf 900 | |
| Sterile ophthalmic ointment | Théa | 597562 | Viscotears. |
| Tail vein catheter (24 G) | BD Neoflon | 391350 | |
| * Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified. | |||
| Material and equipment for cranial window placement | |||
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Curved fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Cotton or fibreless swabs | Chemtronics | CX50 | |
| Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1594457 (gel), 230992 (liquid) | If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder. |
| Dental cement | Lang Dental | Jet Set-4 Denture Repair Package | |
| Dental micromotor hand drill | FOREDOM | K.1070-2 | High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10, 11370-40 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00050RA120MNT0 (5 mm) | Mouse cranial windows. |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00080RA120MNT0 (8 mm) | Rat cranial windows. |
| Micro drill burrs (0.5 mm) | Meisinger | HM71005 (0.5 mm) | |
| Micro drill burrs (0.7 mm) | Meisinger | HM71007 (0.7 mm) | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Surgical gelatin sponge | Ethicon | MS0005 | |
| Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Weigh boats / trays | VWR | 10803-148 | |
| * Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries. | |||
| Multiphoton microscopy | |||
| 20x water immersion objective | Olympus | XLUMPLFLN20 XW | Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm. |
| Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa) | Sigma Aldrich | 46945 | Recommended 10 kDa-2 MDa. |
| MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator | Spectra-Physics | N/A | |
| SliceScope microscope | Scientifica | N/A | |
| Ultrasound treatment | |||
| 50 dB RF Amplifier | E&I | 2100L | |
| Matching circuit | Custom-made | Custom-made | Custom-made. |
| Microbubbles | Bracco Imaging | N/A | SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg. |
| Microbubbles | Lantheus | N/A | Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg. |
| Signal generator | Agilent Technologies | 33500B |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Kalladka, D., et al. Human neural stem cells in patients with chronic ischaemic stroke (PISCES): a phase 1, first-in-man study. Lancet. 388 (10046), London, England. 787-796 (2016).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: Bottleneck in brain drug development. the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 12 (2005).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2012).
- Nagy, Z., Pappius, H. M., Mathieson, G., Hüttner, I. Opening of tight junctions in cerebral endothelium. I. Effect of hyperosmolar mannitol infused through the internal carotid artery. The Journal of Comparative Neurology. 185 (3), 569-578 (1979).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Burgess, A., et al. Alzheimer disease in a mouse model: MR imaging-guided focused ultrasound targeted to the hippocampus opens the blood-brain barrier and improves pathologic abnormalities and behavior. Radiology. 273 (3), 736-745 (2014).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
- Hynynen, K., Jones, R. M. Image-guided ultrasound phased arrays are a disruptive technology for non-invasive therapy. Physics in Medicine and Biology. 61 (17), 206-248 (2016).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
- Downs, M. E., et al. Long-term safety of repeated blood-brain barrier opening via focused ultrasound with microbubbles in non-human primates performing a cognitive task. PLOS One. 10 (5), 0125911 (2015).
- Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102 (2018).
- Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103-112 (2019).
- Bing, C., et al. Transcranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using a stereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2, 13 (2014).
- O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Blood-brain barrier: Real-time feedback-controlled focused ultrasound disruption by using an acoustic emissions-based controller. Radiology. 263 (1), 96-106 (2012).
- Jones, R. M., Deng, L., Leung, K., McMahon, D., O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Three-dimensional transcranial microbubble imaging for guiding volumetric ultrasound-mediated blood-brain barrier opening. Theranostics. 8 (11), 2909-2926 (2018).
- Jones, R. M., McMahon, D., Hynynen, K. Ultrafast three-dimensional microbubble imaging in vivo predicts tissue damage volume distributions during nonthermal brain ablation. Theranostics. 10 (16), 7211-7230 (2020).
- Arvanitis, C. D., et al. Mechanisms of enhanced drug delivery in brain metastases with focused ultrasound-induced blood-tumor barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (37), 8717-8726 (2018).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, (2012).
- McCarter, J. F., et al. Clustering of plaques contributes to plaque growth in a mouse model of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 126 (2), 179-188 (2013).
- Cruz Hernández, J. C., et al. Neutrophil adhesion in brain capillaries reduces cortical blood flow and impairs memory function in Alzheimer's disease mouse models. Nature Neuroscience. 22 (3), 413-420 (2019).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (71), e50148 (2013).
- Nhan, T., Burgess, A., Hynynen, K. Transducer design and characterization for dorsal-based ultrasound exposure and two-photon imaging of in vivo blood-brain barrier disruption in a rat model. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 60 (7), 1376-1385 (2013).
- Cho, E. E., Drazic, J., Ganguly, M., Stefanovic, B., Hynynen, K. Two-photon fluorescence microscopy study of cerebrovascular dynamics in ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (9), 1852-1862 (2011).
- Burgess, A., Nhan, T., Moffatt, C., Klibanov, A. L., Hynynen, K. Analysis of focused ultrasound-induced blood-brain barrier permeability in a mouse model of Alzheimer's disease using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 192, 243-248 (2014).
- Nhan, T., et al. Drug delivery to the brain by focused ultrasound induced blood-brain barrier disruption: Quantitative evaluation of enhanced permeability of cerebral vasculature using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 172 (1), 274-280 (2013).
- Nhan, T., Burgess, A., Lilge, L., Hynynen, K. Modeling localized delivery of Doxorubicin to the brain following focused ultrasound enhanced blood-brain barrier permeability. Physics in Medicine and Biology. 59 (20), 5987-6004 (2014).
- Poon, C. T., et al. Time course of focused ultrasound effects on β-amyloid plaque pathology in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 8 (1), 14061 (2018).
- Poon, C., Pellow, C., Hynynen, K. Neutrophil recruitment and leukocyte response following focused ultrasound and microbubble mediated blood-brain barrier treatments. Theranostics. 11 (4), 1655-1671 (2021).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Chu, P. -C., et al. Neuromodulation accompanying focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 5 (1), 15477 (2015).
- Yddal, T., Kotopoulis, S., Gilja, O. H., Cochran, S., Postema, M. Transparent glass-windowed ultrasound transducers. , at http://eprints.gla.ac.uk/158176/ 2079-2082 (2014).
- Santos, M. A., Goertz, D. E., Hynynen, K. Focused ultrasound hyperthermia mediated drug delivery using thermosensitive liposomes and visualized with in vivo two-photon microscopy. Theranostics. 7 (10), 2718-2731 (2017).
- Mullin, L., et al. Effect of anesthesia carrier gas on in vivo circulation times of ultrasound microbubble contrast agents in rats. Contrast Media & Molecular Imaging. 6 (3), 126-131 (2011).
- Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Molecular Imaging and Biology. 14 (1), 40-46 (2012).
- Baum, J. A. The carrier gas in anaesthesia: Nitrous oxide/oxygen, medical air/oxygen and pure oxygen. Current Opinion in Anaesthesiology. 17 (6), 513-516 (2004).
- Poon, C., McMahon, D., Hynynen, K. Noninvasive and targeted delivery of therapeutics to the brain using focused ultrasound. Neuropharmacology. , 20-37 (2017).
- Joo, I. L., et al. Early neurovascular dysfunction in a transgenic rat model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 7, 46427 (2017).
- Dorr, A., et al. Amyloid-β-dependent compromise of microvascular structure and function in a model of Alzheimer's disease. Brain: A Journal of Neurology. 135, Pt 10 3039-3050 (2012).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: An optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLOS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Teikari, P., Santos, M., Poon, C., Hynynen, K. Deep learning convolutional networks for multiphoton microscopy vasculature segmentation. arXiv. , at http://arxiv.org/abs/1606.02382 (2016).
- Denes, A., et al. Surgical manipulation compromises leukocyte mobilization responses and inflammation after experimental cerebral ischemia in mice. Frontiers in Neuroscience. 7, 00271 (2014).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9 (1), 5499 (2019).
- Podgorski, K., Ranganathan, G. Brain heating induced by near-infrared lasers during multiphoton microscopy. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1012-1023 (2016).
- Ulivi, A. F., et al. Longitudinal two-photon imaging of dorsal hippocampal CA1 in live mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59598 (2019).
- Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
- Beekers, I., et al. Combined confocal microscope and Brandaris 128 ultra-high-speed camera. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2575-2582 (2019).
