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Monitoraggio multi-sistema per l'identificazione di convulsioni, aritmie e apnee nei conigli trattenuti coscienti

Published: March 27, 2021 doi: 10.3791/62256
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Pharmacology, Upstate Medical University, 2Department of Neurology, Upstate Medical University, 3Strong Epilepsy Center, Departments of Neurology, Anesthesiology / Perioperative Medicine, & Pediatrics, University of Rochester Medical Center

Summary

Utilizzando video-EEG-ECG-oximetry-capnography simultanei, abbiamo sviluppato una metodologia per valutare la suscettibilità dei modelli di coniglio per sviluppare aritmie e convulsioni provocate. Questo nuovo sistema di registrazione stabilisce una piattaforma per testare l'efficacia e la sicurezza delle terapie e può catturare la complessa cascata di eventi multi-sistema che culminano nella morte improvvisa.

Abstract

I pazienti con channelopatie ioniche sono ad alto rischio di sviluppare convulsioni e aritmie cardiache fatali. C'è una maggiore prevalenza di malattie cardiache e aritmie nelle persone con epilessia (cioè cuore epilettico). Inoltre, sono stati segnalati disturbi cardiaci e autonomici che circondano le convulsioni. 1:1.000 pazienti con epilessia/anno muoiono di morte improvvisa e inaspettata nell'epilessia (SUDEP). I meccanismi per il SUDEP rimangono incompleti. Gli elettroencefalogrammi (EEG) e gli elettrocardiogrammi (ECG) sono due tecniche abitualmente utilizzate nell'ambiente clinico per rilevare e studiare i substrati/trigger per convulsioni e aritmie. Mentre molti studi e descrizioni di questa metodologia sono nei roditori, la loro attività elettrica cardiaca differisce significativamente dagli esseri umani. Questo articolo fornisce una descrizione di un metodo non invasivo per la registrazione simultanea di video-EEG-ECG-oximetry-capnoography nei conigli coscienti. Poiché la funzione elettrica cardiaca è simile nei conigli e nell'uomo, i conigli forniscono un eccellente modello di studi diagnostici e terapeutici traslittiali. Oltre a delineare la metodologia per l'acquisizione dei dati, discutiamo gli approcci analitici per l'esame della funzione elettrica neuro-cardiaca e della patologia nei conigli. Ciò include il rilevamento dell'aritmia, l'analisi spettrale dell'EEG e una scala di crisi sviluppata per conigli trattenuti.

Introduction

L'elettrocardiografia (ECG) viene utilizzata regolarmente nell'ambiente clinico per valutare la dinamica della conduzione elettrica cardiaca e il processo di attivazione-recupero elettrico. L'ECG è importante per rilevare, localizzare e valutare il rischio di aritmie, ischemia e infarizioni. Tipicamente, gli elettrodi sono apposti sul petto, sulle braccia e sulle gambe del paziente al fine di fornire una visione tridimensionale del cuore. Una deflessione positiva viene prodotta quando la direzione della depolarizzazione del miocardio è verso l'elettrodo e viene prodotta una deflessione negativa quando la direzione della depolarizzazione del miocardio è lontana dall'elettrodo. I componenti elettrografici del ciclo cardiaco includono la depolarizzazione atriale (onda P), la conduzione atriale-ventricolare (intervallo P-R), l'eccitazione ventricolare (complesso QRS) e la ripolarizzazione ventricolare (onda T). Ci sono grandi somiglianze nell'ECG e misure potenziali d'azione in molti mammiferi tra cui umani, conigli, cani, porcellini d'India, maiali, capre e cavalli1,2,3.

I conigli sono un modello ideale per la ricerca traslizionale cardiaca. Il cuore di coniglio è simile al cuore umano in termini di composizione del canale ionica e proprietà potenzialid'azione 2,4,5. I conigli sono stati utilizzati per la generazione di modelli genetici, acquisiti e indotti da farmaci di malattiecardiache 2,4,6,7,8. Ci sono grandi somiglianze nell'ECG cardiaco e una potenziale risposta d'azione ai farmaci negli esseriumani e nei conigli 7,10,11.

La frequenza cardiaca e il processo di attivazione-recupero elettrico cardiaco sono molto diversi nei roditori, rispetto ai conigli, agli esseri umani e ad altri mammiferipiù grandi 12,13,14. Il cuore del roditore batte ~ 10 volte più velocemente degli esseri umani. Al contrario, al segmento ST iso-elettrico negli ECG umani e dei conigli, non esiste un segmento ST nei roditori14,15,16. Inoltre, i roditori hanno una forma d'onda QRS-r' con un'onda T invertita14,15,16. Le misurazioni dell'intervallo QT sono molto diverse nei roditori rispetto agli esseri umani e aiconigli 14,15,16. Inoltre, i normali valori ECG sono molto diversi negli esseri umani rispetto ai roditori12,15,16. Queste differenze nelle forme d'onda ECG possono essere attribuite alle differenze nella morfologia del potenziale d'azione e nei canali ionici che guidano la ripolarizzazionecardiaca 9,14. Mentre la corrente transitoria verso l'esterno di potassio è la principale corrente ripolarizzante nella morfologia del potenziale di azione cardiaca corta (non dome) nei roditori, nell'uomo e nei conigli c'è una grande cupola di fase 2 sul potenziale d'azione, e le correnti di potassio raddrizzatore ritardato (I Kr e IKs)sono le principali correnti di ridimensionamento polari nell'uomo e nei conigli4,9,13,17. È importante sottolineare che l'espressione di IKr e IKs è assente / minima nei roditori, e a causa della cinetica di attivazione temporale di IKr e IKs non ha un ruolo nella morfologia del potenziale di azione cardiaca9,13. Pertanto, i conigli forniscono un modello più traslazionale per valutare i meccanismi per le anomalie e le aritmie ECG indotte, acquisite ed ereditarie da farmaci4,7,13. Successivamente, poiché numerosi studi hanno dimostrato la presenza di anomalie elettriche neuronali e cardiache nelle malattie cardiache primarie (sindrome QT lunga18,19,20) o neuronali (epilessia21,22,23,24), è importante studiare i meccanismi sottostanti in un modello animale che riproduce da vicino la fisiologia umana. Mentre i roditori possono essere sufficienti per modellare il cervello umano, i roditori non sono un modello ideale di fisiologia cardiaca umana7.

L'elettroencefalografia (EEG) utilizza elettrodi, solitamente posti sul cuoio capelluto o intracranicialmente, per registrare la funzione elettrica corticale. Questi elettrodi possono rilevare cambiamenti nella velocità di cottura e sincronicità di gruppi di neuroni piramidali vicini nella corteccia cerebrale25. Queste informazioni possono essere utilizzate per valutare la funzione cerebrale e lo stato di veglia / sonno. Inoltre, gli EEG sono utili per localizzare l'attività epileptiforme e distinguere le convulsioni epilettiche da eventi non epilettici (ad esempio, attività psicogenica non epilettiforme ed eventi cardiogenici). Al fine di diagnosticare il tipo di epilessia, i fattori provocatori e l'origine della crisi epilessia, i pazienti con epilessia sono sottoposti a varie manovre che possono portare a una crisi epilettica. Vari metodi includono iperventilazione, stimolazione fotica e privazione del sonno. Questo protocollo dimostra l'uso della stimolazione fotica per indurre aberrazioni e convulsioni EEG neiconigli 26,27,28,29.

Registrazioni video-EEG-ECG simultanee sono state ampiamente utilizzate negli esseri umani e nei roditori per valutare l'attività comportamentale, neuronale e cardiaca durante gli stati pre-ictal, ictal e post-ictal30. Mentre diversi studi hanno condotto registrazioni EEG ed ECG separatamente nei conigli4,31,32,33, un sistema per acquisire e analizzare video-EEG-ECG simultaneo nel coniglio trattenuto cosciente non è ben consolidato34. Questo documento descrive la progettazione e l'implementazione di un protocollo in grado di registrare dati video-EEG-ECG -capnografia-ossimametria simultanei nei conigli coscienti al fine di valutare la funzione elettrica e respiratoria neuro-cardiaca. I risultati raccolti da questo metodo possono indicare la suscettibilità, i fattori scatenanti, la dinamica e la concordanza tra aritmie, convulsioni, disturbi respiratori e manifestazioni fisiche. Un vantaggio del nostro sistema sperimentale è che acquisiamo registrazioni consapevoli senza la necessità di un sedativo. I conigli rimangono nei limitatori per ≥5 ore, con un movimento minimo. Come anestetici perturb funzione neuronale, cardiaca, respiratoria e autonomica, le registrazioni durante lo stato cosciente forniscono i dati più fisiologici.

Questo sistema di registrazione può in definitiva fornire informazioni dettagliate per far progredire la comprensione dei meccanismi neurologici, cardiaci e respiratori per la morte improvvisa e inaspettata nell'epilessia (SUDEP). Oltre al monitoraggio neurologico e cardiaco di cui sopra, recenti prove hanno anche supportato il ruolo dell'insufficienza respiratoria come potenziale contributo alla morte improvvisa dopo unacrisi epilettica 35,36. Per monitorare lo stato respiratorio dei conigli, sono stati implementati ossimametria e capnografia per valutare lo stato dell'apparato respiratorio prima, durante e dopo una crisi epilettica. Il protocollo qui presentato è stato concepito allo scopo di valutare la soglia per le convulsioni di coniglio indotte da stimoli farmacologici e fotici. Questo protocollo è in grado di rilevare sottili anomalie EEG ed ECG che potrebbero non provocare manifestazioni fisiche. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per la sicurezza cardiaca e test di efficacia antiaritmica di nuovi farmaci e dispositivi.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) e dell'Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Inoltre, nella figura 1 è fornita una descrizione di questo protocollo.

1. Preparazione delle apparecchiature di registrazione

  1. Collegare il computer a un amplificatore con un headbox a 64 pin.
    NOTA: Ogni animale ha quattro elettrodi perno subdermico dritto del cuoio capelluto (7 o 13 mm) per eeg dai 4 quadranti della testa, 3 elettrodi perno del torace subdermico piegati (angolo 13 mm, 35°) per ECG (triangolo di Einthoven), 1 elettrodo a perno subdermico piegato sulla gamba destra e 1 elettrodo dritto del perno del cuoio capelluto subdermico al centro della testa funge da riferimento.
  2. Per fare di ogni8° pin sulla headbox un riferimento, aggiornare le impostazioni del software di acquisizione, scheda di acquisizione, quindi l'elettrodo di riferimento è "Indipendente" (cioè la modalità di ricerca).
    NOTA: Ciò consente registrazioni da un massimo di 7 animali contemporaneamente, ognuno con 7 elettrodi più un elettrodo di riferimento dedicato e un elettrodo di terra, il tutto attraverso un amplificatore, digitalizzatore e computer. Tutti gli elettrodi sono acquisiti come canali unipolari e confrontati con il riferimento (centro della testa). Ulteriori configurazioni/montaggi di piombo bipolare e aumentato possono essere configurati durante o dopo la registrazione. Poiché la configurazione ha la capacità di registrare da più animali contemporaneamente, un elettrodo di terra di ogni animale è collegato in parallelo all'ingresso a terra sull'amplificatore (Figura 2).
  3. Rimuovere i conigli dalla gabbia e pesarli per calcolare la dose di farmaco appropriata per ogni animale. Posizionare i conigli in un trasportino e portarli in una stanza separata al fine di ridurre al minimo lo stress per gli animali non sperimentali. In questo studio, sono stati usati conigli bianchi della Nuova Zelanda maschi e femmine e la loro prole successiva. Esperimenti sono stati eseguiti su conigli > 1 mese di età. Al momento dell'esperimento, questi conigli pesavano tra 0,47 e 5,00 kg.
    NOTA: Poiché i conigli devono essere nella stessa stanza e in vista della fotocamera, non isolare completamente i conigli. C'è il potenziale per manifestazioni visive e uditivi da un coniglio che stressa un altro coniglio. Pertanto, è l'ideale avere un coniglio nella stanza alla volta, il che viene fatto per gli esperimenti di stimolazione fotica. Per tutti gli altri esperimenti, i conigli sono distanziati il più possibile, mantenendoli tutti all'interno della vista della videocamera. Idealmente, vengono utilizzate barriere o viene studiato un solo animale alla volta. Questo non fu un grande confondatore in quanto la frequenzacardiaca dei conigli rimase abbastanza stabile durante gli esperimenti e ci fu la frequente presenza di mandrini del sonno. Le registrazioni di più animali assicurano contemporaneamente che i dati sugli animali di controllo e di prova siano acquisiti nelle stesse condizioni ambientali.

2. Impianto di elettrodi EEG-ECG e fissaggio di monitor respiratori

  1. Rimuovere un coniglio dal trasportatore e posizionare in grembo a un investigatore seduto.
  2. Tenere il coniglio verticalmente e tenerlo vicino al corpodell'investigatore.
  3. Abbassare il coniglio in posizione supina,con la testa delconiglio alle ginocchiadell'investigatore,e la testadel conigliopiù in basso rispetto al resto del suo corpo.
    NOTA: Questa manovra rilassa l'animale e riduce al minimo la probabilità che cerchi di muoversi o fuggire mentre posiziona gli elettrodi.
  4. Ora che il coniglio è fissato in posizione supina, chiedi a un secondo investigatore di stendere la pelliccia fino a quando la pelle non può essere identificata e isolata dal tessuto sottostante.
  5. Inserire elettrodipiegati di 35 ° in modo subdermico in ogni ascella (Figura 3A).
    NOTA: Gli elettrodi devono essere spinti in modo che siano saldamente agganciati alla pelle, ma non penetrino in strutture più profonde. Far entrare e poi uscire l'elettrodo dalla pelle (attraverso e attraverso) riduce la possibilità che i cavi si sblottino quando si posiziona il coniglio nel trattino o se si muove durante l'esperimento(Figura 3B). Tutti gli elettrodi vengono sterilizzati con il 70% di etanolo prima del posizionamento.
  6. Posizionare i cavi sul petto posteriore agli arti anteriori destro e sinistro e sull'addome anteriore all'arto posteriore sinistro. Posizionare un perno-elettrodo di terra anteriore all'arto posteriore destro sull'addome (Figura 4A).
  7. Una volta che tutti i cavi ECG sono posizionati correttamente, riportare il coniglio in una posizione soggetta, con i cavi che corrono su un lato dell'addome del coniglio e trasferire il coniglio in un limitatore di dimensioni appropriato (ad esempio, 6 " x 18 " x 6 ").  Quando si posiziona il coniglio nel trattino, tirare il filo sciolto verso l'alto per ridurre al minimo il coniglio dall'estrarre gli elettrodi con le gambe. Rastremi i fili sul lato del limitatore in modo che non siano catturati sotto il coniglio durante l'esperimento (Figura 4B).
  8. Fissare il coniglio nel trattino abbassando il sistema di ritenuta intorno al collo e bloccarlo in posizione. Inoltre, spostare gli arti posteriori sotto l'animale e fissare il sistema di ritenuta posteriore.
    NOTA: Si dovrebbe essere in grado di inserire 1-2 dita all'interno dello spazio sotto il collo per assicurarsi che non sia troppo stretto. In particolare durante gli esperimenti in cui può esserci movimento del motore, è importante stringere il sistema di ritenuta per ridurre al minimo il movimento, le potenziali lesioni spinali, la lussazione degli arti e la capacità di estocco il sistema diritenuta posteriore (figura 4B). I conigli sono stati mantenuti nel limitatore per ~ 5 ore senza problemi legati all'aumento del movimento o segni di disidratazione.
    1. Per i piccoli conigli (ad esempio, meno di 2 mesi) posizionare un booster pad di gomma sotto l'animale per sollevare il coniglio, il che impedisce al coniglio di riposare il collo sul fondo del poggiatesta(Figura 4C).
      NOTA: Un improvviso calo della frequenza respiratoria e cardiaca può essere secondario all'impingement del collo. In questo caso, allentare il limitatore del collo e sollevare la testadel coniglioper alleviare qualsiasi compressione del collo.
    2. Quando il sistema di ritenuta posteriore non traccia da vicino la schiena /colonna vertebrale del coniglio, posizionare un distanziale in PVC per evitare qualsiasi movimento che possa causare lesioni spinali.
      NOTA: Ad esempio, il tubo in PVC di diametro interno di ~ 14 cm x 4", con il 25-33% inferiore rimosso può essere posizionato sopra il coniglio con schiuma per fornire un adeguato contenimento(Figura 4C).
  9. Ora che il coniglio è posizionato saldamente nel limitatore, inserire gli elettrodi per spillo subdermici da 7-13 mm nel cuoio capelluto (Figura 3A). Utilizzando un approccio di ingresso ad angolo di 45°, far correre i fili tra le orecchie e collegare liberamente i fili al trattino dietro la testa per mantenere il posizionamento del piombo. Posizionare 5 lead EEG nelle seguenti posizioni: anteriore destro, anteriore sinistro, occipitale destro, occipitale sinistro e un vantaggio di riferimento centrale (Cz) nel punto tra gli altri 4 lead (Figura 4D).
    NOTA: Gli elettrodi sono posizionati correttamente quando sono posizionati in tessuto sottocutaneo contro il cranio. Questo posizionamento riduce al minimo l'artefatto dal naso, dalle orecchie e da altri muscoli circostanti. Alcuni artefatti del movimento ritmico del naso sono inevitabili. I cavi anteriori dell'EEG devono essere posizionati mediali agliocchi delconiglio e puntare anteriormente. I cavi occipitali devono essere posizionati anteriormente alle orecchie e puntano nella direzione mediale. Cz è posto al centro della parte superiore della testa in un punto che si trova tra tutti e 4 gli elettrodi (a metà strada tra Lambda e Bregma, lungo la linea di sutura). Il perno dell'elettrodo Cz punta anterioremente.
    1. Passa i fili EEG tra le orecchie, per evitare che il coniglio cerchi di mordere i fili.
  10. Attaccare il pletismografo dell'ossidrometro a impulsi all'orecchio del coniglio sopra la vena dell'orecchio marginale.
    NOTA: Potrebbe essere necessario radere i capelli in eccesso dall'orecchio per migliorare il segnale o utilizzare una garza per mantenere il sensore in posizione.
    1. Assicurarsi che la frequenza cardiaca sulla pletosmografia sia correlata alla frequenza cardiaca dell'ECG e che la saturazione di ossigeno sia visualizzata (Figura 5C).
  11. Posizionare delicatamente la maschera facciale con tubi di capnografia sulla bocca e sul naso del coniglio(Figura 4H). Fissare la maschera facciale con la corda avvolta intorno alla maschera e attaccare entrambe le estremità della stringa al trattino. Attaccare l'altra estremità del tubo di capnografia al monitor dei segni vitali.
    NOTA: È importante impedire alla corda di posare sugli occhi del coniglio durante l'esperimento. Per fare questo, rastremi la corda al centro del trattino tra le orecchie del coniglio. Al fine di migliorare il segnale capnografico, creare una valvola unidirezione utilizzando nastro adesivo e un sottile pezzo di nitrile che consenta all'ossigeno di entrare nel pezzo a T e dirigerà la CO2 espirata nei tubi di capnografia (Figura 4I).

3. Registrazione di video-EEG-ECG

  1. Eseguire la registrazione video-EEG-ECG utilizzando un software EEG disponibile in commercio.
    NOTA: I cavi biopotenziali e il video sono bloccati nel tempo per correlare in seguito i segnali elettrici e video (ad esempio, picco EEG con uno scatto mioclonico).
  2. Conferma la connettività ottimale, senza deriva di base, senza rumore elettrico a 60 Hz e un elevato rapporto segnale/rumore. In particolare, assicurarsi che ogni fase della forma d'onda cardiaca possa essere vista sull'ECG e che le onde delta, theta e alfa non siano visivamente oscurate dal rumore ad alta frequenza sull'EEG.
    1. Se tutti gli elettrodi producono quantità eccessive di rumore, regolare il piombo di riferimento centrale. Se solo un elettrodo è eccessivamente rumoroso, spingere quell'elettrodo più in profondità nella pelle o riposizionarlo fino a quando non è esposto metallo.
  3. Regolare il video in modo che tutti i conigli possano essere visti contemporaneamente, il che consente la correlazione dell'attività motoria con i risultati EEG (Figura 5A).
    NOTA: Il sistema ospita registrazioni simultanee EEG/ECG/oximetry/capnoography da un massimo di 7 conigli.
  4. Inizia la registrazione di base da ogni animale per un minimo di 10-20 minuti o fino a quando la frequenza cardiaca si stabilizza in uno stato calmo e rilassato (200-250 bpm) e i conigli non mostrano grandi movimenti per almeno 5 minuti. Acquisire dati elettrografici a larghezza di banda completa senza filtri. Per visualizzare meglio i dati impostare il filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) a 1 Hz e il filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) a 59 Hz.
    NOTA: Un altro segno che il coniglio è rilassato è l'inizio dei mandrini del sonno EEG (discussi più avanti).
  5. Aggiungere note bloccate nel tempo durante l'esperimento in tempo reale per indicare la tempistica degli interventi (ad esempio, il parto dei farmaci) e degli eventi neuro-cardiaci (ad esempio, picco EEG, convulsioni motorie, battito ectopico e aritmie) e artefatti motori / investigatori.
    NOTA: A causa della frequenza con cui lo sperimentatore deve applicare un intervento (ad esempio, stimolazione fotica, somministrazione di farmaci), per ridurre al minimo lo stress di un investigatore che entra ed esce dalla stanza e apre / chiude la porta, l'investigatore rimane sul lato opposto della stanza per tutto l'esperimento. L'investigatore si trova il più lontano possibile dall'animale e rimane fermo e silenzioso per ridurre al minimo potenzialmente disturbando gli animali.

4. Protocolli sperimentali

NOTA: Ciascuno dei seguenti esperimenti viene eseguito in giorni separati se vengono eseguiti sullo stesso animale. C'è un ritardo di 2 settimane tra gli studi sui farmaci composti dei test orali e lo studio del farmaco pro-convulsivo terminale acuto. Quando necessario, viene eseguito l'esperimento di stimolazione fotica, seguito da un'attesa di 30 minuti e quindi dallo studio del farmaco PTZ.

  1. Per consentire ai conigli di acclimatarsi nei limitatori e per lo sperimentatore di confermare oggettivamente la stabilizzazione dei tassi cardiorespiratori, instrumentare tutti i conigli con i sensori cardiorespiratori e neuronali ed eseguire un monitoraggio video continuo per > 1 ora, 1 - 3 volte per animale.
  2. Esperimento di stimolazione fotica
    1. Oltre al metodo sopra descritto, posizionare una sorgente luminosa con un riflettore circolare di 30 cm davanti al coniglio a livello degli occhi, con l'intensità del flash impostata al massimo (16 candela)29. La sorgente luminosa è indicata da un punto bianco nella figura 4E.
      NOTA: Una stanza scarsamente illuminata deve essere utilizzata per ottenere la risposta fotosensibile37.
    2. Poiché gli occhidel conigliosono sul lato della testa invece che sulla parte anteriore della testa (come negli esseri umani), posizionare 2 specchi su entrambi i lati del coniglio e 1 dietro il coniglio in modo che la luce entrinegli occhi delconiglio.
      NOTA: Uno specchio piatto ≥ alto 20 cm, lungo ≥ 120 cm crea un recinto triangolare attorno al coniglio per garantire che la luce lampeggiante entri negliocchi delconiglio, come si vede nella figura 4E.
    3. Collegare la sorgente luminosa a un controller con una velocità, un'intensità e una durata regolabili.
    4. Registra video utilizzando una fotocamera con una luce rossa e funzionalità di registrazione a infrarossi.
    5. Esporre i conigli a ciascuna frequenza per 30 s con gli occhi aperti e poi altri 30 s con una maschera chirurgica che copre il viso per simulare o causare la chiusura degli occhi ad ogni frequenza.
      NOTA: Studi precedenti hanno dimostrato che la chiusura degli occhi è la manovra più provocatoria per suscitare la fotosensibilità al sequestro29. Inoltre, il 10% dei pazienti fotosensibili mostra solo segni elettroencefalografici mentre i loro occhi sonochiusi 29. Una crisi epilettica può essere identificata clinicamente osservando la presenza di scatti mioclonici della testa e di tutto il corpo, clono o uno stato tonico. La registrazione EEG viene analizzata più a fondo per la correlazione elettroencefalografica (ad esempio picchi, poli-picchi e scariche ritmiche) con manifestazioni motorie per una diagnosi definitiva dell'attività convulsa. I movimenti in cui l'EEG è oscurato da artefatto muscolare o onde di epilessogenicità indeterminante devono essere esaminati da un epileptologo per la conferma.
    6. Aumentare la frequenza dello stimolatore fotico da 1 Hz a 25 Hz con incrementi di 2 Hz. Quindi eseguire lo stesso protocollo di stimolazione fotografica, ma questa volta ridurre la frequenza da 60 Hz a 25 Hz in incrementi di 5 Hz.
      NOTA: Se un coniglio ha una crisi epilettica, l'esperimento deve essere interrotto. Continuare a monitorare il coniglio per 30 minuti. Quindi riportare il coniglio nella stanza degli alloggi e monitorare ogni 1 h per 3 ore per il pieno recupero. Tuttavia, se la stimolazione fotica induce una risposta fotoparossistica, allora il resto delle frequenze ascendenti viene saltato e la serie viene ricominciata scendendo da 60 Hz fino a quando non si verifica un'altra risposta fotoparossistica. Ciò consentirà la determinazione delle soglie di stimolazione fotica superiore e inferiore. Non è necessario alcun ritardo in quanto la risposta fotoparossistica cesserà dopo che la stimolazione fotica è stata interrotta. Se non è chiaro se si sia verificata una risposta fotoparossismica, la frequenza viene ripetuta dopo un ritardo di 10 s38.
    7. Una volta completato l'esperimento, rimuovere i cavi EEG ed ECG dal coniglio e restituirlo alla sua gabbia di casa per le cure di routine da parte del personale zootecno.
  3. Somministrazione orale di farmaci
    1. Poiché molti farmaci vengono presi per via orale, preparare composti orali mescolandosi con salsa di mele di livello alimentare. Mescolare 0,3 mg/kg di E-4031 in 3 ml di salsa di mele e caricarlo in una siringa orale/irrigua da 3 ml senza ago.
      NOTA: Diversi farmaci possono essere somministrati in questo modo tra cui, composti di prova, farmaci che sono noti per alterare la durata del QT (moxifloxacina o E-4031) e un controllo negativo o un veicolo. Alcuni farmaci non sono disponibili in una formulazione endovenosa. Inoltre, molti farmaci sono prescritti in una formulazione orale e quindi una somministrazione endovenosa può avere meno rilevanza clinica.
    2. Solleva le labbra superiori e fai scorrere la punta della siringa orale nel lato dellabocca delconiglio, che non è strutturato dai dentidel coniglio,e inietta tutti i farmaci e la salsa di mele nella boccadelconiglio.
    3. Continuare la registrazione video-EEG-ECG per 2 ore e quindi riportare l'animale nella sua gabbia di casa per cure di routine.
    4. Nel giorno sperimentale 2 e 3, collegare il coniglio al video-EEG-ECG, registrare 10-20 minuti di basale, quindi iniettare lo stesso farmaco e registrare per 2 h.
    5. Dopo 1 settimana di lavaggio, eseguire 10-20 minuti di basale, quindi dare a ciascun coniglio una singola dose di placebo per 3 giorni consecutivi e registrare per 2 ore.
      NOTA: La somministrazione di farmaci orali può essere progettata come uno studio crossover, in cui il placebo viene somministrato durante la settimana 1 e il farmaco nella settimana 2.
  4. Esperimento farmacologico per via endovenosa (Pentilenetetrazolo, PTZ)
    1. Per visualizzare la vena marginaledell'orecchio,radere la superficie posteriore dell'orecchio del coniglio. Utilizzare una salvietta al 70% di etanolo per disinfettare il sito e dilatare la vena dell'orecchio marginale. Ciò è indicato dall'ovale tratteggiato nero nella figura 4F.
    2. A questo punto, fare in modo che uno sperimentatore coprail viso delconiglio con la mano al fine di ridurre lo stress della procedura per il coniglio. Un secondo sperimentatore cannula con cura la vena dell'orecchio marginale con un angiocatetere sterile 25-G.
    3. Una volta che il catetere è nella vena, posizionare una spina di iniezione sterile alla fine del catetere in modo che un ago possa introdurre farmaci per via endovenosa. La posizione della spina di iniezione è indicata da un cerchio blu nella figura 4G.
    4. Crea una stecca avvolgendo una garza da 4 x 4 pollici con del nastro adesivo in modo che formi una forma a tubo e la posizionareall'interno dell'orecchiodel coniglio. Quindi rastrettare la stecca all'orecchio in modo che il catetere sia fissato in posizione e rimanga in posizione verticale, simile all'orecchio non catetere.
    5. Iniettare 1 mL di 10 unità USP per mL di salina eparinata.
      NOTA: Il catetere e la nave devono essere visibilmente liberati dall'aria e rimanere brevettati. Se il catetere non è nel vaso, la siringa non spingerà facilmente e ci sarà accumulo di soluzione salina nel tessuto sottocutaneo.
    6. Dare ai conigli dosi incrementali di PTZ per via endovenosa da 1 mg/kg a 10 mg/kg in incrementi di 1 mg/kg ogni 10 min. Prendere nota all'inizio di ogni dose per indicare quale animale viene iniettato e la concentrazione del farmaco.
      NOTA: Ciò consente di effettuare valutazioni degli effetti acuti e additivi della somministrazione di PTZ. In alternativa, per valutare ulteriormente gli effetti cronici della PTZ a bassa dose, al coniglio vengono somministrate dosi ripetute ad ogni bassa concentrazione di dose, 7 dosi a 2 mg/kg, 3 dosi a 5 mg/kg, quindi 3 dosi a 10 mg/kg, ciascuna dose è separata di 10 min.
    7. Dopo ogni dose, monitorare attentamente la video-EEG-ECG-capnografia-ossimametria per eventuali anomalie neuro-cardiache elettriche e respiratorie e prove visive di attività epileptiforme. Si notano queste modifiche in tempo reale e durante la post-analisi.
      NOTA: L'attività di sequestro inizia spesso entro 60 s dalla somministrazione di PTZ.

5.Conclusione di esperimenti di non sopravvivenza.

  1. Se il coniglio non ha avuto morte improvvisa nel corso dell'esperimento PTZ, somministrare 1 mL di 390 mg/mL di pentobarbital di sodio per ogni 4,54 kg di peso corporeo (o 1,5 mL a tutti i conigli), seguito da uno scarico di 1 mL di soluzione salina normale. Monitorare l'ECG per assicurarsi che il coniglio subisca un arresto cardiaco.
  2. Una volta che il coniglio sperimenta un arresto cardiaco, esegui rapidamente una necroscopia per isolare appena vari organi, tra cui cuore, polmoni, fegato, cervello, muscolo scheletrico e qualsiasi altro tessuto necessario per successive analisi molecolari / biochimiche.
  3. Smaltire il coniglio secondo le politiche istituzionali.

6. Analisi dell'ECG

  1. Utilizzare un software di analisi ECG disponibile in commercio per ispezionare visivamente l'ECG e per identificare periodi di tachicardia, bradicardia, battiti ectopici e altre aritmie (Figura 6). Per ridurre la quantità di dati da rivedere, creare un tachigramma, che aumenterà la facilità con cui è possibile identificare periodi di tachicardia, bradicardia o irregolarità dell'intervallo RR.
    NOTA: Anomalie dell'ECG (ad es. Ilprolungamento del QT c) e le aritmie sono identificati manualmente rivedendo l'ECG per rilevare anomalie nella velocità (ad esempio, aritmie brady-/tachi-aritmie), ritmo (ad esempio complessi atriali/ventricolari prematuri), conduzione (ad esempio, blocco atrio-ventricolare) e forma d'onda (ad esempio, tachicardia atriale/ventricolare non sinusale/ventricolare e fibrillazione). Le aritmie possono essere rilevate rivedendo il tachigramma per rilevare irregolarità nell'intervallo RR. La tachicardia può essere identificata da sezioni del tachigramma in cui la frequenza cardiaca è superiore a 300 battiti al minuto. La bradicardia viene identificata quando la frequenza cardiaca è inferiore a 120 battiti al minuto sul tachigramma.
  2. Utilizzando il software di analisi ECG disponibile in commercio, eseguire misurazioni ECG standard (frequenza cardiaca, intervalli del ciclo cardiaco) al basale e dopo la provocazione (ad esempio, ricercatore che manipola l'animale, somministrazione di agenti di prova e cambiamenti ECG indotti dalle convulsioni).

7. Analisi del video-EEG

  1. Scorrere visivamente il tracciamento video ed EEG utilizzando il software disponibile in commercio per identificare il segnale di base (Figura 7) e la presenza di scariche EEG previste come i mandrini del sonno (Figura 8) e le onde dei vertici (Figura 9).
    NOTA: Sebbene i dati elettrografici a larghezza di banda completa siano acquisiti senza filtri, i dati devono essere visualizzati con il filtro a bassa frequenza (cioè il filtro passa alto) impostato a 1 Hz, e in base al teoremadiNyquist, il filtro ad alta frequenza (cioè il filtro passa basso) è impostato a 120 Hz per evitare di perdere qualsiasi segnale. I filtri possono essere regolati per consentire una migliore visualizzazione e riduzione del rumore (ad esempio, 1-59 Hz) durante la revisione dell'attività EEG a frequenza inferiore (<25 Hz).
  2. Oltre alle forme d'onda capnografiche, utilizzare l'artefatto del movimento del naso sull'EEG per determinare la presenza rispetto all'assenza di respirazione. Questo può anche essere correlato con i movimenti del naso visti nella registrazione video.
  3. Scorrere visivamente il tracciamento video ed EEG utilizzando un software disponibile in commercio per distinguere i movimenti epilettici rispetto a movimenti non epilettici (ad esempio, coscienti) per almeno 1 minuto dopo ogni dose di PTZ (Figura 10). Eseguire la scansione per le scariche epilettiche interiettiche e per i cambiamenti EEG prima, durante e dopo le convulsioni. Una crisi epilettica può essere identificata clinicamente osservando la presenza di scatti mioclonici della testa e di tutto il corpo, clonus o uno stato tonico con un correlato EEG. Le modifiche EEG possono includere picchi EEG, poli-picchi e scariche ritmiche.
    NOTA: I movimenti in cui l'EEG è oscurato da artefatto muscolare o onde di epilessogenicità indeterminante devono essere esaminati da un neurologo per la conferma. Potrebbe essere vantaggioso concentrare il video su un coniglio per visualizzarne il comportamento, così come le sue registrazioni EEG ed ECG, più da vicino(Figura 5B).
  4. Segnare il video-EEG per le convulsioni in base al tipo e alla gravità delle manifestazioni motorie, che in genere si verificano entro 1 minuto dopo l'iniezione di PTZ (Tabella 1).
  5. Dopo un esperimento di stimolazione fotica, analizzare i lead occipitali dell'EEG per la presenza e l'assenza del ritmo di guida occipitale creando un grafico di analisi spettrale in un software di analisi EEG disponibile in commercio. Il ritmo di guida occipitale creerà un picco nell'analisi spettrale che corrisponde alla frequenza dello stimolatore fotico (Figura 11).
    NOTA: La stimolazione fotica può produrre picchi di frequenza armonica oltre al picco della frequenza fondamentale.

7. Analisi della funzione respiratoria

  1. Esaminare l'uscita dal monitor dei segnali vitali(figura 4I)ed esportare il segnale per ulteriori analisi.
  2. Si noti il cambiamento del modello respiratorio durante una crisi epilettica e dopo una crisi epilettica, in particolare il momento in cui inizia l'apnea.

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Representative Results

Il metodo sopra descritto è in grado di rilevare anomalie nel sistema di conduzione elettrica del cervello e del cuore, nonché disturbi respiratori. Un software di acquisizione dati viene utilizzato per valutare la morfologia dell'ECG e rilevare eventuali frequenza cardiache anomale, disturbi della conduzione o ritmi ECG (battiti ectopici atriali/ventricolari e bradi-/tachi-aritmie)(Figura 6). Oltre a visualizzare la morfologia dell'ECG, le tracce vengono analizzate per quantificare l'intervallo RR, la frequenza cardiaca, l'intervallo PR, la durata P, l'intervallo QRS, l'intervallo QT, l'intervallo QTc, l'intervallo JT el'intervallo finaleT-picco-T. L'analisi di questi dati mostra che le aritmie tachi-/brady-aritmie sono prontamente rilevate.

Oltre all'analisi dei dati ECG, vengono analizzati anche i dati EEG. L'EEG di base è stato raccolto e analizzato utilizzando l'analisi spettrale (Figura 7). Questi dati mostrano che i lead occipitali hanno un'ampiezza maggiore rispetto ai cavi frontali e che la frequenza dominante in tutti i lead è nell'intervallo delta. Essere in grado di registrare eEG da conigli con un elevato rapporto segnale/rumore è importante per rilevare le scariche epileptiformi ed eseguire ulteriori analisi sulla registrazione. Le onde che hanno una morfologia e una frequenza simili a quella dei mandrini del sonno umano sono mostrate nella figura 8. Le onde dei vertici provenienti dal centro della testa sono mostrate nella figura 9. Oltre ai normali cambiamenti EEG, vengono notati anche vari movimenti consapevoli del coniglio non epilettico durante le registrazioni di base al fine di distinguerli dalle scariche epilettiche(Figura 10). Le registrazioni video-EEG dei movimenti mostrati, così come altre, sono disponibili in Supplemental Movie 1-11.

Diversi metodi sono stati implementati per tentare di indurre sequestri. Il primo metodo utilizzava la stimolazione fotica a 1-60 Hz con gli occhi aperti e chiusi(figura 4E). Poiché la posizione degli occhi sul coniglio è laterale piuttosto che anteriore come gli esseri umani, gli specchi sono impiegati per dirigere la luce negli occhi del coniglio usando un'unica fonte di luce. L'analisi dell'EEG dall'esperimento di stimolazione fotica a 3 Hz mostra una forte risposta di guida occipitale alla frequenza prevista di 3 Hz(Figura 11). Oltre alla stimolazione fotica, ai conigli viene iniettato pentilenetetrazolo (PTZ, GABAA blocker) tramite un catetere nella vena dell'orecchio marginale sinistro(Figura 4G). L'iniezione di PTZ causa vari gradi di attività convulsa entro 1 minuto ed è associata a distinte forme d'onda EEG. Alcune forme d'onda rappresentative, che includono esplosioni di theta, grandi esplosioni di theta di ampiezza, onde polispike, onde polispike a bassa tensione, esplosioni gamma ritmiche e silenzio elettrocerebrale (ECS) sono mostrate nella figura 12, Figura 13, Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17.

Al fine di identificare un sequestro vengono utilizzati diversi criteri. Il video viene esaminato per identificare eventuali manifestazioni motorie convulsioni. Quindi, per confermare che l'attività motoria è stata il risultato dell'attività epilettica, il segnale EEG viene valutato per un picco EEG correlato temporaneamente, polispike, onda acuta o scarica ritmica. In caso di dubbio, il video-EEG viene esaminato da un secondo investigatore e/o da un epileptologo per la verifica. L'inizio delle crisi epilettiche è definito come il primo caso di scariche ritmiche EEG (inizio crisi EEG) e attività motoria (inizio crisi clinico). L'EEG e la crisi clinica terminano quando si osservano rispettivamente la cessazione dei picchi ritmici EEG e dell'attività motoria. Oltre a varie morfologie delle onde EEG, i conigli progredirono attraverso convulsioni motorie sempre più generalizzate e sempre più prolungate. È stata creata una scala di sequestro perché né la scala di sequestro racine, né le sue versioni modificate, erano applicabili ai conigli trattenuti(tabella 1). I video dell'attività rappresentativa di crisi motoria sono mostrati in Supplemental Movie 17, Supplemental Movie 18, Supplemental Movie 19, Supplemental Movie 20, Supplemental Movie 21, Supplemental Movie 22.

Il metodo qui presentato è anche in grado di determinare la cascata multi-sistema di eventi che precedono la morte improvvisa mediata dal sequestro (Figura 18). Varie patologie includono: silenzio elettrocerebrale (ECS), arresto respiratorio (apnea), aritmie brady-/tachi-aritmie e arresto cardiaco (asystole).) Durante gli esperimenti, un coniglio ha subito una morte improvvisa dopo aver avuto una crisi farmacologicamente indotta. In questo coniglio, c'era una sequenza iniziata con l'arresto respiratorio, poi ECS, blocco atrioventricolare, diverse tachiaritmie non sostenute, bradicardia e infine asystole.

Figure 1
Figura 1: Panoramica del protocollo sperimentale. Al fine di fornire una panoramica dei passaggi principali di questo protocollo, è stata creata una figura. Questa cifra delinea che l'apparecchiatura di registrazione deve essere preparata, seguita dal collegamento dell'apparecchiatura al coniglio e dalla garanzia che venga osservato un segnale di alta qualità. Dopo questo passaggio, è possibile eseguire l'esperimento previsto, procurare organi e analizzare i dati video-EEG-ECG-capnografia-ossimametria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Attrezzature sperimentali. Diagramma della configurazione sperimentale, che include un computer, luce infrarossa, microfono, videocamera, monitor dei segni vitali, headbox a 64 pin, amplificatore, digitalizzatore, 8 elettrodi (5 EEG, 3 ECG) + terra per ogni animale collegato al headbox. I lead sono codificati a colori secondo quanto segue: 4 EEG blu, 1 riferimento EEG nero, 3 ECG rossi, 1 terra verde. La scatola del trattino che contiene i conigli non viene mostrata. Questa configurazione consente di registrare contemporaneamente fino a 7 conigli. La linea gialla rappresenta i tubi capnografici e collega la maschera facciale al monitor dei segni vitali. La linea blu rappresenta il filo di prossimatria collegato al monitor dei segni vitali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagine degli elettrodi EEG ed ECG. (A) Elettrodi ECG piegati ed elettrodi EEG dritti. (B) Come agganciare l'elettrodo ECG nel tessuto sottocutaneo del coniglio, in modo che sia attraverso e attraverso. Abbreviazioni (LL: Arto sinistro, RA: Braccio destro, RL: Arto destro, LA: Braccio sinistro, RF: Frontale destro, LF: Frontale sinistro, Cz: Centro, RO: Occipitale destro, LO: Occipitale sinistro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Coniglio collegato all'apparecchiatura. (A) Posizione degli elettrodi ECG, braccio sinistro è indicato da un punto giallo. Braccio destro è indicato da un punto bianco. La gamba sinistra è indicata da un punto rosso. Il terreno anteriore alla gamba destra è indicato da un punto verde. (B) Coniglio in trattenutore con elettrodi ECG ed EEG collegati. (C) Coniglio giovanile in un limitatore con opportune modifiche per ospitare un coniglio più piccolo, tra cui un booster sotto il coniglio, schiuma del collo e tubo di PVC tagliato. (D) Coniglio in trattenutore con posizione degli elettrodi EEG. Frontale destro è indicato da un punto arancione. Sinistra frontale è indicato da un punto rosso. L'occipitale destro è indicato da un punto giallo. L'Occipitale sinistro è indicato da un punto blu. Il riferimento è indicato da un punto nero. (E) Coniglio in trattenutore con stimolatore fotico e configurazione della cabina dello specchio. La sorgente luminosa è indicata da un punto bianco. (F) Vena auricolare marginale dopo che l'orecchio del coniglio è stato rasato e asciugato con alcol. (G) Coniglio con angiocatetere saldamente nastrato nella vena dell'orecchio marginale sinistro. Il sito di spina di iniezione è indicato con un punto blu. (H) Coniglio con maschera facciale attaccata al tubo di capnografia da un pezzo a T che contiene una valvola uni-way. (I) Diagramma della maschera facciale e del pezzo a T collegato al tubo di capnografia. Durante l'ispirazione, l'aria ambiente è in grado di entrare nel pezzo a T attraverso una valvola uni-way (freccia verde). Durante la scadenza, la CO2 lascia il pezzo a T inserendo il tubo di capnografia (freccia gialla). A causa della piccola quantità di spazio morto, pochissima CO2 viene trattenuta nel pezzo a T ed è generalmente inferiore a 5 mmHg. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Registrazione simultanea di 3 conigli nel video-EEG-ECG-Capnoography-Oximetry. ( A) Registrazione simultanea video-EEG-ECG di 3 conigli. (B) Ingrandito in vista della registrazione video-EEG-ECG simultanea da Rabbit #2. (LL: Arto sinistro, RA: Braccio destro, LA: Braccio sinistro) (C) Registrazione simultanea della capnografia (giallo) e della pletismografia (blu). Le misurazioni che mostrano CO2 ispirata,CO 2 dimareafinale, frequenza respiratoria, frequenza cardiaca e ossimametria dell'impulso sono incluse nella figura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Rabbit ECG. (A) ECG di base. I lead sono mostrati nella configurazione standard del piombo dell'arto piano frontale bipolare e nella configurazione unipolare (RA: Braccio destro, LL: Arto sinistro, LA: braccio sinistro) con il piombo Cz sulla testa come riferimento. (B)Complessi ventricolari prematuri. (C) Bradicardia del seno. (D) Tachicardia del seno. (E) Tracciamento ECG del coniglio di base con inizio onda P, picco d'onda P, estremità dell'onda P, inizio onda QRS, picco d'onda QRS, estremità dell'onda QRS, altezza del segmento ST, picco d'onda T, estremità dell'onda T etichettata. (F) Misurazioni ECG. Tutte le misurazioni sono in millisecondi ad eccezione della frequenza cardiaca, che è in battiti al minuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Analisi EEG e spettrale di base. (A) Tracciatura EEG durante la registrazione di base. (B) L'analisi spettrale dell'EEG mostra che l'attività dell'onda delta è la frequenza dominante in tutti i lead. Onde Delta (δ: fino a 4 Hz) Onde Dita (θ: 4-8 Hz) Onde Alfa (α: 8 -15 Hz) Onde Beta (β: 15-32 Hz) Onde Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L'asse Y è la densità spettrale di potenza del log10*log 10(μV2/Hz). I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 120 Hz. Le registrazioni video-EEG-ECG sono mostrate nei filmati supplementari 1 e 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Tracciamento EEG del mandrino del sonno e analisi spettrale. (A) Tracciamento EEG durante i mandrini del sonno. (B) L'analisi spettrale dell'EEG mostra la presenza di un'onda aggiuntiva a 12-15 Hz, che è simile alla frequenza associata ai mandrini del sonno nell'uomo. Onde Delta (δ: fino a 4 Hz) Onde Dita (θ: 4-8 Hz) Onde Alfa (α: 8 -15 Hz) Onde Beta (β: 15-32 Hz) Onde Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L'asse Y è la densità spettrale di potenza del log10*log 10(μV2/Hz). (C) Più montaggi EEG di un mandrino del sonno dimostrano che derivano dal centro della testa (Cz), che è coerente con i risultati umani. I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Fare clicqui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Tracciamento delle onde dei vertici e analisi spettrale. (A) Tracciamento EEG di più onde di vertice. (B) L'analisi spettrale delle onde dei vertici non mostra una differenza apprezzabile nella frequenza delle onde dei vertici. Sebbene ciò sia previsto perché visivamente la frequenza è inferiore a 1 Hz. (C) I montaggi EEG multipli delle onde dei vertici mostrano che sorgono dal centro della testa, il che è coerente con i risultati umani. I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Y Axis is Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Artefatti EEG causati dal movimento del coniglio. (A) EEG durante saccade dell'occhio destro. (B) EEG durante un battito di ciglia sinistro. (C) EEG durante il movimento ritmico del naso associato alla presenza di respirazione. (D) EEG durante il movimento di leccare. (E) EEG durante un episodio del coniglio che allunga la testa verso il basso. (F) EEG durante complessi movimenti coscienti di tutto il corpo. Video-EEG di questi movimenti sono disponibili in Film supplementari 3-11. I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Fare clicqui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11: EEG durante la stimolazione fotica. (A) Tracciamento EEG durante la stimolazione fotica a 3 Hz con gli occhi aperti del coniglio. (B) Analisi spettrale della stimolazione fotica a 3 Hz con picchi a 3 Hz osservati nei cavi occipitali, ma non nei cavi frontali. I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Y Axis is Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 12
Figura 12: Tracciamento EEG e analisi spettrale delle esplosioni di theta. Le esplosioni di Theta sono viste a intermittenza in tutti i lead EEG. La frequenza di queste onde è di circa 4-6 Hz. Delta (δ: fino a 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) onde Alfa (α: 8 -15 Hz) onde Beta (β: 15-32 Hz) Onde Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L'asse Y è la densità spettrale di potenza del log10*log 10(μV2/Hz). I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Y Axis is Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 13
Figura 13: Tracciamento EEG e analisi spettrale di grandi esplosioni di ampiezza. Le esplosioni di theta di grande ampiezza sono simili nell'aspetto e nella frequenza alle onde theta, ma con un'ampiezza maggiore. Il rapido cambiamento di ampiezza rende alcune di queste onde più nitide. Onde Delta (δ: fino a 4 Hz) Onde Dita (θ: 4-8 Hz) Onde Alfa (α: 8 -15 Hz) Onde Beta (β: 15-32 Hz) Onde Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L'asse Y è la densità spettrale di potenza del log10*log 10(μV2/Hz). I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Y Axis is Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). La registrazione video-EEG-ECG è mostrata in Supplemental Movie 12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 14
Figura 14: Tracciamento EEG e analisi spettrale delle onde polispike. Le onde polispike sono viste in modo intermittente e simultaneo in tutti i lead. Sull'analisi spettrale, ci sono picchi armonici multipli con una frequenza fondamentale intorno a 6 Hz. Onde Delta (δ: fino a 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) onde Alfa (α: 8 -15 Hz) onde Beta (β: 15-32 Hz) Onde Gamma (γ: ≥ 32 Hz) onde. L'asse Y è la densità spettrale di potenza del log10*log 10(μV2/Hz). I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Y Axis is Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). La registrazione video-EEG-ECG è mostrata in Supplemental Movie 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 15
Figura 15: Tracciamento EEG e analisi spettrale delle onde polispike a bassa tensione. Le onde polispike a bassa tensione sono simili alle onde polispike, ma hanno un'ampiezza inferiore. L'analisi spettrale è simile a quella dei polispikes. Onde Delta (δ: fino a 4 Hz) Onde Dita (θ: 4-8 Hz) Onde Alfa (α: 8 -15 Hz) Onde Beta (β: 15-32 Hz) Onde Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L'asse Y è la densità spettrale di potenza del log10*log 10(μV2/Hz). I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Y Axis is Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 16
Figura 16: Tracciamento EEG e analisi spettrale delle esplosioni gamma ritmiche. Le esplosioni gamma ritmiche in uno schema a scoppio sono viste più chiaramente nei cavi anteriori. Sull'analisi della frequenza c'è un picco aggiuntivo visto intorno ai 50-55 Hz nei cavi anteriori. Onde Delta (δ: fino a 4 Hz) Onde Dita (θ: 4-8 Hz) Onde Alfa (α: 8 -15 Hz) Onde Beta (β: 15-32 Hz) Onde Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L'asse Y è la densità spettrale di potenza del log10*log 10(μV2/Hz). I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 120 Hz. La registrazione video-EEG-ECG è mostrata in Supplemental Movie 14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 17
Figura 17: Tracciamento EEG e analisi spettrale della soppressione dell'EEG generalizzata postittale. Soppressione EEG generalizzata postittale con l'istogramma di frequenza corrispondente. Onde Delta (δ: fino a 4 Hz) Onde Dita (θ: 4-8 Hz) Onde Alfa (α: 8 -15 Hz) Onde Beta (β: 15-32 Hz) Onde Gamma (γ: ≥ 32 Hz). L'asse Y è la densità spettrale di potenza del log10*log 10(μV2/Hz). I dati elettrografici a larghezza di banda completa sono stati acquisiti senza filtri, ma i dati sono stati visualizzati con filtro a bassa frequenza (=filtro passa alto) impostato a 1 Hz e filtro ad alta frequenza (=filtro passa basso) impostato a 59 Hz. Y Axis is Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). La registrazione video-EEG-ECG è mostrata in Supplemental Movie 15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 18
Figura 18: Sequenza di morte improvvisa dopo il sequestro. Un coniglio ha subito una morte improvvisa durante il protocollo PTZ e la sequenza di morte è dettagliata. Le manifestazioni elettroencefalografiche sono indicate in verde. Il tempo zero è la fine clinica del attacco epilettico. Segue il silenzio elettrocerebrale post-ictale (ECS.) I dati respiratori sono mostrati in rosso e annotano l'inizio dell'apnea. Le informazioni elettrocardiografiche sono mostrate nei toni del blu. Questo coniglio ha sperimentato blocco cardiaco, tachiaritmie multiple, bradicardia e, in definitiva, asstolo, che è indicato dalla stella nera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Scala di sequestro per conigli trattenuti. L'aumento della gravità delle convulsioni è associato a un'attività motoria epilettica sempre più sostenuta e generalizzata. Esempi video sono disponibili in Film supplementari 17-22. Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Filmato supplementare 1: Registrazione video-EEG-ECG del coniglio di base con luci accese. Dopo che il coniglio è stato posto nel trattenutore, il coniglio diventa più rilassato e possono essere fatte registrazioni di base. Il video mostra che il coniglio non si muove durante questa registrazione. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 2: Registrazione video-EEG-ECG del coniglio di base con luci spente. Affinché venga eseguito l'esperimento di stimolazione fotica, le luci nella stanza devono essere spente. Spegnere le luci nella stanza non influisce in modo significativo sulla registrazione EEG o ECG. È importante sottolineare che la videocamera ha una luce infrarossa in modo che il coniglio possa essere visto al buio. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 3: Artefatto muscolare dal movimento dell'occhio sinistro. Il metodo descritto in questo documento è in grado di discernere tra artefatto muscolare e scariche epileptiformi. Sebbene questa onda periodica di ampiezza grande possa essere confusa con una crisi epilettica, si verifica contemporaneamente al movimento dell'occhio sinistro ed è quindi più probabile che sia causata dall'attività muscolare. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 4: Artefatto muscolare da un battito di ciglia sinistro. La registrazione video-EEG è in grado di rilevare un battito di ciglia su EEG e anche determinare che si verifica contemporaneamente al battito di ciglia visto sul video. Il battito di ciglia è lateralizzato ai cavi EEG laterali a sinistra. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 5: Artefatto muscolare dal muscolo mascellare. Il video-EEG è in grado di rilevare il movimento di piccoli muscoli della testa e del collo. Il video è inestimabile per determinare che questo movimento è dovuto ai muscoli invece che alle scariche epilettiche dal cervello. Come previsto il segnale associato a questo movimento deriva dai cavi occipitali. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 6: Artefatto muscolare da leccare. Il tracciamento EEG mostra grandi onde bruschi ritmiche che potrebbero essere coerenti con l'attività di attacco. Il video dimostra che queste onde sono causate da movimenti della lingua e non sono scariche epilettiche. Come previsto, il segnale associato a questo movimento deriva dai cavi occipitali. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 7: Artefatto muscolare dal movimento della bocca. Nuove onde viste nella catena del delta sono associate al movimento della bocca. È importante sottolineare che questo può essere distinto dal rallentamento intermittente secondario all'encefalopatia mediante visualizzazione del movimento della bocca quando compaiono le onde theta. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 8: Artefatto muscolare dal capo. Una grande, lenta e transitoria diminuzione dell'ampiezza osservata nei cavi frontali è associata alla rotazione della testa del coniglio. È importante notare che non ci sono scariche epilettiche che precedono il movimento. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 9: Artefatto muscolare dall'estensione della testa. Un grande, lento e transitorio aumento di ampiezza si vede in tutti i cavi quando il coniglio sta sollevando la testa. Non ci sono scariche epilettiche che precedono il movimento. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 10: Artefatto muscolare dalla flessione della testa. Una diminuzione molto grande dell'ampiezza in tutti i lead si vede quando il coniglio estende la testa verso il basso. Non ci sono scariche epilettiche che precedono il movimento. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 11: Artefatto muscolare da movimenti complessi. Mentre è nel trattino, il coniglio fa un movimento complesso che coinvolge la sua testa e tutto il suo corpo. Ciò si è verificato durante la registrazione di base, prima che fossero somministrati farmaci che inducevano convulsioni. Questo movimento in rapida evoluzione è stato registrato come un'elevata ampiezza e un'esplosione ad alta frequenza sull'EEG. Inoltre, le onde bruschi ritmiche viste nei cavi frontali sono dovute al movimento del naso, che può essere visto come sincrono con le onde sul video. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 12: Video-EEG di grande ampiezza theta scoppia. Dopo l'iniezione di PTZ alcuni conigli hanno mostrato un rallentamento intermittente dell'EEG in tutti i cavi. Queste onde anomale di solito non erano associate al movimento. Sebbene queste esplosioni di onde nell'intervallo theta non siano tipiche dell'attività convulsione, sono associate all'encefalopatia negli esseri umani. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 13: Video-EEG di polispikes. Le onde bru sharp possono essere viste immediatamente dopo l'iniezione, durante una crisi epilettica o durante il periodo postitale. Questi risultati sono simili a quelli trovati nell'uomo e sono associati all'attività convulsa. Durante i polispikes, si nota anche che l'orecchio destro si contrae, una manifestazione fisica della crisi epilettica. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 14: Video-EEG di gamma ritmica burst. Le esplosioni ad alta frequenza, come quelle mostrate nel video, si verificano spesso nel periodo postittale e occasionalmente dopo dosi di sottosoglie di PTZ. La causa fisiologica di questi lampi gamma ad alta frequenza è sconosciuta. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 15: Video-EEG della soppressione eeg generalizzata postittale. Nel periodo postittale, specialmente dopo una crisi tonico-clonica generalizzata, c'è spesso soppressione dell'EEG in tutti i lead. Grandi deviazioni di ampiezza durante il periodo postittale si dimostrano causate da artefatto muscolare da scatti mioclonici. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 16: Video-EEG del silenzio elettrocerebrale. Questo video dimostra l'elevato rapporto segnale/rumore di questo metodo. Con una minima attività EEG, non c'è alcun segnale riconoscente dall'EEG. Questa specificità è importante quando si determina il momento della morte cerebrale. Inoltre, va notato che spesso c'è una funzione cardiaca residua dopo che si è verificata la morte cerebrale. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 17: Video-EEG della fase di scala di crisi 0. La scala di crisi epilettica è progettata per valutare la gravità delle convulsioni motorie determinando la diffusione e la durata del sequestro. Allo stadio 0, non c'è attività convulsa visibile, anche se possono esserci scariche epilettiche viste su EEG. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 18: Video-EEG della fase di scala di crisi 1. Lo stadio 1 della scala di crisi epilettica è identificato dalla presenza di un breve sequestro parziale. Generalmente le convulsioni parziali sono limitate alla testa, piuttosto che a qualsiasi altra parte del corpo. Questo può manifestarsi come jerk a testa singola, contrazioni a orecchio singolo o altra breve attività motoria non ritmica associata a scariche epilettiche su EEG. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 19: Video-EEG della scala di crisi 2. Lo stadio 2 della scala delle convulsioni è identificato da un sequestro generalizzato non sostenuto. Spesso tutto il corpo subirà uno mioclonico. Questo si distingue dalle fasi successive per la mancanza di ritmicità. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 20: Video-EEG della scala di crisi 3. Lo stadio 3 della scala di crisi è identificato da una crisi epilettica sostenuta che è limitata alla testa in termini di manifestazioni motorie. Il coniglio mostrato ha contrazioni ritmiche delle orecchie e palpebre. Il coniglio sperimenta un breve jerk mioclonico per tutto il corpo ma non progredisce fino allo scatto ritmico di tutto il corpo. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 21: Video-EEG della fase di scala di crisi 4. Lo stadio 4 della scala delle convulsioni è identificato da una crisi epilettica sostenuta che ha coinvolto l'intero corpo. Come si può vedere nel video, il corpo del coniglio è coinvolto nel mioclono mentre c'è relativamente poco movimento delle orecchie, degli occhi e della testa. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato supplementare 22: Video-EEG della scala di crisi 5. La fase finale della Scala di Crisi Se identificata dalla presenza sia delle fasi toniche che cloniche del sequestro. Inizialmente c'è movimento disorganizzato di tutto il corpo. Questo è seguito dalla fase tonica, quindi dalla fase clonica del sequestro fino a quando il sequestro non si risolve. Occasionalmente i conigli sperimentano la morte improvvisa dopo questa fase, ma raramente muoiono a seguito di una crisi di gravità inferiore. Clicca qui per scaricare questo film.

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Discussion

Questa configurazione sperimentale facilita registrazioni e analisi video-EEG-ECG-ossimametria-capnografia simultanee dettagliate nei conigli, in particolare nei modelli di malattie cardiache e/o neuronali. I risultati di questo articolo mostrano che questo metodo è in grado di rilevare convulsioni e aritmie e differenziarle dagli artefatti elettrografici. I risultati attesi sono stati ottenuti quando si dà ai conigli un proconvulsivo, che ha indotto convulsioni. I dati ottenuti dalle registrazioni video-EEG sono stati in grado di essere ulteriormente analizzati per differenziare i movimenti volontari rispetto all'aumento della gravità delle convulsioni motorie e delle anomalie elettroencefalografiche, tra cui la risposta alla guida fotica, l'encefalopatia e le scariche epilettiche. Vari tipi di scariche epileptiformi erano ulteriormente caratterizzati e correlati con l'attività motoria. L'analisi dell'ECG ha dimostrato un metodo che ha prodotto un elevato rapporto segnale-rumore e ha permesso l'identificazione e la quantificazione di ogni correlato elettrico del ciclo cardiaco. Questo metodo è stato anche in grado di rilevare la presenza di anomalie cardiache, tra cui complessi ventricolari prematuri, bradicardia, blocco cardiaco, tachicardia, tachi-aritmie e asystole. Lo sviluppo di un metodo robusto per indagare ulteriormente le interazioni neuro-cardiache delle malattie multi-sistema fornisce un importante progresso tecnologico necessario per comprendere meglio queste malattie. Inoltre, il monitoraggio della funzione respiratoria nel tempo facilita una migliore comprensione dell'insufficienza respiratoria dopo le convulsioni e del suo contributo alla morte improvvisa.

Questa configurazione fornisce anche un solido sistema per studi farmacologici, come i test di sicurezza cardiaca. I progetti di ricerca che utilizzano queste tecniche sono in grado di indagare l'interazione tra le manifestazioni neuronali, cardiache e respiratorie in tempo reale. Sebbene molti studi siano stati condotti sui cuori dei roditori, i risultati nel cuore del coniglio sono migliori per gli studi trasduzionali, poiché l'espressione del canale ionico, le proprietà potenziali d'azione e le misure ECG sono simili agli esseri umani. Poiché si tratta di un set-up video-EEG-ECG clinicamente utilizzato, in futuro lo stesso design può essere applicato a grandi mammiferi, come maiali, cani o pecore. Inoltre, questa configurazione di registrazione può essere utilizzata per il monitoraggio EEG intracraniale nel coniglio che si muove liberamente, che consente registrazioni più estese in vari stati fisiologici, circondando eventi neuro-cardiaci spontanei e precedendo la morte improvvisa. Questi metodi saranno preziosi per chiarire il meccanismo del SUDEP e per trovare nuove terapie dirette a curare le malattie del cervello e del cuore.

Il protocollo presentato in questo articolo ha molti passaggi critici che devono essere seguiti per produrre dati con un elevato rapporto segnale/rumore. È importante sottolineare che prima dell'inizio dell'esperimento, il coniglio deve essere fissato nel limitatore per limitare i grandi movimenti del corpo che potrebbero causare lesioni spinali. Tutti gli elettrodi sono controllati per la qualità del segnale. Se tutti gli elettrodi sono rumorosi, l'elettrodo di riferimento può essere sostituito per migliorare il segnale. Se i singoli elettrodi sono rumorosi, allora quell'elettrodo dovrebbe essere spinto più in profondità nella pelle o rimosso e reimpiantato. Durante l'esperimento, il movimento dei conigli può causare lo spostamento degli elettrodi. Il prima possibile, provare a sostituire gli elettrodi senza ostruire la vista della fotocamera in modo che i dati possano ancora essere raccolti dall'esperimento.

Un vantaggio della metodologia delineata in questo studio è che facilita allo sperimentatore lo studio a migliorare un gran numero di animali ed è conveniente. Ci sono limitazioni di questo protocollo. Sebbene siano stati eseguiti pochi studi per indagare specificamente l'impatto fisiologico della moderazione sui conigli, abbiamo scoperto che i conigli hanno tollerato la moderazione estremamente bene. Molti studi sul sistema uditivo sono stati eseguiti su conigli svegli in poggiatesta. In queste condizioni, i conigli si siedono tranquillamente per ore senza segni di stress o disagio39. Dopo essere stati messi nel trattenutore, i conigli raramente cercano di sfuggire al trattenutore. Mostrano una frequenza cardiaca vicina alla linea di base e spesso si addormentano, come notato dalla presenza di mandrini del sonno sull'EEG. I conigli non mostrano immagini, frequenza cardiaca o altre manifestazioni per suggerire che siano stressati.

Una direzione futura è quella di sviluppare un sistema per la registrazione telemetrica EEG ed ECG. Ciò consentirebbe un'analisi più dettagliata durante vari stati fisiologici, l'individuazione di convulsioni spontanee e la cascata di cambiamenti neuro-cardiaci che precedono la morte improvvisa inaspettata nell'epilessia (SUDEP). A causa dei vincoli tecnologici e della relativa mancanza di letteratura sull'EEG nei conigli, il metodo presentato è stato sviluppato per primo. Per adattare questo metodo ai conigli che si muovono liberamente, richiederebbe un monitoraggio video continuo, impianti EEG intra-cranici ed elettrodi ECG sottocutanei. Tuttavia, la capnografia respiratoria cronica non sarebbe fattibile. A causa delle normative istituzionali (IACUC), la metodologia è per ≤ registrazioni di 5 ore nel restrainer. Nei roditori, è comune valutare la soglia, la dinamica e i tipi di convulsioni utilizzando misure provocatorie, come febbrile, uditivo, elettroshurto massimo, iperventilazione, privazione del sonno e convulsioni indotte da farmaci16,40,41,42,43. Questo protocollo consentirebbe di testare una qualsiasi delle misure provocatorie precedentemente menzionate.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono che questo studio è stato supportato da sovvenzioni dell'American Heart Association, dell'American Epilepsy Society e del SUNY Upstate Department of Pharmacology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container PFIZER (HOSPIRA) 7983-09 Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle Sur-Vet SS-10L2025 Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges Fisher Scientific 22-415-469 Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce Kirkland 897971 Vehicle for oral medications
Computer Dell Optiplex 5040 Acquisition computer
E-4031 Tocris 1808 Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode RhythmLink RLSND116-2.5 13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode RhythmLink RLSP513 5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020) Swartz Center for Computational Neuroscience Open Access Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter Linksys USB3G16 Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution Med-Pharmex ANADA 200-280 Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding Generic N/A Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush Medline EMZ50051240 To maintain patency of angiocatheter
IR Light Bosch EX12LED-3BD-8W Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16) ADInstruments N/A ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge Smiths Medical 3060 Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5) MathWorks N/A Required to run EEGLAB
Microphone Sony Stereo ECM-D570P Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White 3M 1530-1 Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks Natus LC101-8 Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume) Sigma-Aldrich 88580 Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator Grass PS22 Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler 12Vwire.com LM-12-100-BLK Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator Grass Instruments BZA641035 Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe Generic N/A Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier Natus 13926 Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier Natus 22134 64-pin breakout box
Rabbit Restrainer Plas-Labs 501-TC Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster) Generic N/A Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip NONIN 61000 PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter NONIN 13931 XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output Sony SRG-X120 Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer Sur-Vet 13882 Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock Sur-Vet SRIP2V Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply Covidien 5110 To prepare ear vein before catheterization

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Bosinski, C., Wagner, K., Zhou, X., Liu, L., Auerbach, D. S. Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits. J. Vis. Exp. (169), e62256, doi:10.3791/62256 (2021).

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