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Medicine

Monitoreo multisistema para la identificación de convulsiones, arritmias y apnea en conejos restringidos conscientes

Published: March 27, 2021 doi: 10.3791/62256
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Pharmacology, Upstate Medical University, 2Department of Neurology, Upstate Medical University, 3Strong Epilepsy Center, Departments of Neurology, Anesthesiology / Perioperative Medicine, & Pediatrics, University of Rochester Medical Center

Summary

Usando video-EEG-ECG-oximetry-capnography simultáneo, desarrollamos una metodología para evaluar la susceptibilidad de los modelos del conejo para desarrollar arritmias y asimientos provocados. Este novedoso sistema de grabación establece una plataforma para probar la eficacia y seguridad de la terapéutica y puede capturar la compleja cascada de eventos multi-sistema que culminan en la muerte súbita.

Abstract

Los pacientes con canalopatías iónicas tienen un alto riesgo de desarrollar convulsiones y arritmias cardíacas fatales. Hay una mayor prevalencia de enfermedades cardíacas y arritmias en personas con epilepsia (es decir, corazón epiléptico). Además, los disturbios cardiacos y autonómicos se han divulgado que rodeaban asimientos. 1:1.000 pacientes con epilepsia/año mueren de muerte súbita inesperada en epilepsia (SUDEP). Los mecanismos para SUDEP siguen siendo incompleto entendidos. Los electroencefalogramas (EEG) y los electrocardiogramas (ECG) son dos técnicas utilizadas rutinariamente en el ámbito clínico para detectar y estudiar los sustratos/desencadenantes de las convulsiones y las arritmias. Si bien muchos estudios y descripciones de esta metodología se encuentran en roedores, su actividad eléctrica cardíaca difiere significativamente de la de los humanos. Este artículo proporciona una descripción de un método no invasor para la grabación simultánea video-EEG-ECG-oximetry-capnography en conejos conscientes. Como la función eléctrica cardíaca es similar en conejos y humanos, los conejos proporcionan un excelente modelo de estudios diagnósticos y terapéuticos traslacionales. Además de delinear la metodología para la adquisición de datos, discutimos los acercamientos analíticos para examinar la función eléctrica neuro-cardiaca y la patología en conejos. Esto incluye la detección de arritmias, el análisis espectral de EEG y una escala de convulsiones desarrollada para conejos restringidos.

Introduction

La electrocardiografía (ECG) se utiliza rutinariamente en el ámbito clínico para evaluar la dinámica de la conducción eléctrica cardíaca y el proceso de activación-recuperación eléctrica. El ECG es importante para detectar, localizar y evaluar el riesgo de arritmias, isquemia e infartos. Por lo general, los electrodos se fijan al pecho, los brazos y las piernas del paciente para proporcionar una vista tridimensional del corazón. Una desviación positiva se produce cuando la dirección de la despolarización miocárdica es hacia el electrodo y una desviación negativa se produce cuando la dirección de la despolarización miocárdica está lejos del electrodo. Los componentes electrográficos del ciclo cardiaco incluyen la despolarización atrial (onda de P), la conducción atrial-ventricular (intervalo de P-R), la excitación ventricular (complejo de QRS), y la repolarización ventricular (onda de T). Hay grandes similitudes en el ECG y las medidas de potencial de acción en muchos mamíferos, incluidos los seres humanos, conejos, perros, conejillos de Indias, cerdos, cabras y caballos1,2,3.

Los conejos son un modelo ideal para la investigación traslacional cardíaca. El corazón de conejo es similar al corazón humano en términos de composición de canales iónicos, y propiedades de potencial de acción2,4,5. Los conejos se han utilizado para la generación de modelos genéticos, adquiridos y droga-inducidos de la enfermedad cardíaca2,4,6,7,8. Existen grandes similitudes en el ECG cardíaco y en la respuesta potencial de acción a fármacos en humanos y conejos7,10,11.

La frecuencia cardíaca y el proceso de activación-recuperación eléctrica cardíaca es muy diferente en roedores, en comparación con los conejos, los seres humanos y otros mamíferos más grandes12,13,14. El corazón de roedor late ~ 10 veces más rápido que los humanos. En contraste, con el segmento ST iso-eléctrico en ecgs humanos y conejos, no hay segmento ST en roedores14,15,16. Además, los roedores tienen una forma de onda QRS-r' con una onda T invertida14,15,16. Las mediciones del intervalo QT son muy diferentes en roedores frente a humanos y conejos14,15,16. Además, los valores normales de ECG son muy diferentes en humanos frente a roedores12,15,16. Estas diferencias en las formas de onda del ECG pueden atribuirse a diferencias en la morfología del potencial de acción y en los canales iónicos que impulsan la repolarización cardíaca9,14. Mientras que la corriente de potasio exterior transitoria es la principal corriente de repolarización en la morfología del potencial de acción cardíaco corto (no domo) en roedores, en humanos y conejos hay una gran cúpula de fase 2 en el potencial de acción, y las corrientes de potasio rectificador retardado (IKr e IKs)son las principales corrientes de repolarización en humanos y conejos4,9,13,17. Es importante destacar que la expresión de IKr e IKs está ausente/mínima en roedores, y debido a la cinética de activación temporal de IKr e IKs no tiene un papel en la morfología del potencial de acción cardíaco9,13. Así, los conejos proporcionan un modelo más traslacional para evaluar los mecanismos para las anormalidades y las arritmias droga-inducidas, adquiridas, y heredadas de ECG4,7,13. A continuación, como numerosos estudios han demostrado la presencia de anomalías eléctricas tanto neuronales como cardíacas en enfermedades cardíacas primarias (Síndrome de QT Largo18,19,20)o neuronales (epilepsia21,22, 23,24),es importante estudiar los mecanismos subyacentes en un modelo animal que reproduzca de cerca la fisiología humana. Mientras que los roedores pueden ser suficientes para modelar el cerebro humano, los roedores no son un modelo ideal dela fisiologíacardíaca humana 7 .

La electroencefalografía (EEG) utiliza electrodos, generalmente colocados en el cuero cabelludo o por vía intracraneal, para registrar la función eléctrica cortical. Estos electrodos pueden detectar cambios en la velocidad de disparo y la sincronicidad de grupos de neuronas piramidales cercanas en la corteza cerebral25. Esta información se puede utilizar para evaluar la función cerebral y el estado despierto/sueño. Además, los EEG son útiles para localizar la actividad epileptiforme y distinguir los ataques epilépticos de los eventos no epilépticos (por ejemplo, la actividad psicógena no epileptiforme y los eventos cardiogénicos). Para diagnosticar el tipo de la epilepsia, los factores que provocan, y el origen del asimiento, sujetan a los pacientes de la epilepsia a las varias maniobras que pueden traer en un asimiento. Varios métodos incluyen la hiperventilación, la estimulación fótica y la privación del sueño. Este protocolo demuestra el uso de la estimulación fótica para inducir aberraciones y convulsiones de EEG en conejos26,27,28,29.

Las grabaciones simultáneas de video-EEG-ECG han sido ampliamente utilizadas en humanos y roedores para evaluar la actividad conductual, neuronal y cardíaca durante los estados pre-ictal, ictal y post-ictal30. Si bien varios estudios han realizado grabaciones de EEG y ECG por separado en conejos4,31,32,33,un sistema para adquirir y analizar video-EEG-ECG simultáneo en el conejo consciente restringido no está bien establecido34. Este trabajo describe el diseño y la implementación de un protocolo que puede grabar datos simultáneos de video-EEG-ECG -capnografía-oximetría en conejos conscientes con el fin de evaluar la función eléctrica y respiratoria neuro-cardíaca. Los resultados recogidos de este método pueden indicar la susceptibilidad, los disparadores, la dinámica y la concordancia entre las arritmias, los asimientos, los disturbios respiratorios, y las manifestaciones físicas. Una ventaja de nuestro sistema experimental es que adquirimos grabaciones conscientes sin la necesidad de un sedante. Los conejos permanecen en los sujetadores durante ≥5 h, con un movimiento mínimo. A medida que los anestésicos perturban la función neuronal, cardíaca, respiratoria y autonómica, las grabaciones durante el estado consciente proporcionan los datos más fisiológicos.

Este sistema de registro puede en última instancia proporcionar penetraciones detalladas para avanzar la comprensión de los mecanismos neurológicos, cardiacos y respiratorios para la muerte inesperada repentina en la epilepsia (SUDEP). Además de la monitorización neurológica y cardíaca anterior, la evidencia reciente también ha apoyado el papel de la insuficiencia respiratoria como una contribución potencial a la muerte súbita después de una convulsión35,36. Para monitorear el estado respiratorio de los conejos, se implementó oximetría y capnografía para evaluar el estado del sistema respiratorio antes, durante y después de una convulsión. El protocolo presentado aquí fue diseñado con el propósito de determinar el umbral para farmacológico y los asimientos inducidos fótico-estímulos del conejo. Este protocolo puede detectar las anormalidades sutiles de EEG y de ECG que pueden no dar lugar a manifestaciones físicas. Además, este método se puede utilizar para la seguridad cardiaca y la prueba antiarrítmica de la eficacia de drogas y de dispositivos nuevos.

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Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de salud (NIH) y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica del Norte (IACUC). Además, un esquema de este protocolo se proporciona en la figura 1.

1. Preparación del aparato de control

  1. Conecte la computadora a un amplificador con una caja de cabeza de 64 pines.
    NOTA: Cada animal tiene cuatro electrodos de pasador de cuero cabelludo subdérmico recto (7 o 13 mm) para EEGs de los 4 cuadrantes de la cabeza, 3 electrodos de pasador de tórax subdérmico doblado (13 mm, ángulo de 35°) para ECG (triángulodeEinthoven), 1 electrodo de tierra de pin subdérmico doblado en la pierna derecha, y 1 electrodo de pasador de cuero cabelludo subdérmico recto en el centro de la cabeza sirve como referencia.
  2. Para hacer que cada 8º pin en el headbox sea una referencia, actualice la configuración del software de adquisición, la pestaña de adquisición, para que el Electrodo de Referencia sea "Independiente" (es decir, modo de investigación).
    NOTA: Esto permite grabaciones de hasta 7 animales simultáneamente, cada uno con 7 electrodos más un electrodo de referencia dedicado y un electrodo de tierra, todo a través de un amplificador, digitalizador y computadora. Todos los electrodos se adquieren como canales unipolares y se comparan con la referencia (centro de la cabeza). Se pueden configurar configuraciones/montajes de plomo bipolares y aumentados adicionales durante o después de la grabación. Como la configuración tiene la capacidad de grabar desde múltiples animales simultáneamente, un electrodo de tierra de cada animal está conectado en paralelo a la entrada de tierra en el amplificador (Figura 2).
  3. Retire los conejos de su jaula y sopesarlos para calcular la dosis de droga adecuada para cada animal. Coloque los conejos en un transporte y lléelos a una habitación separada para minimizar el estrés a los animales no experimentales. En este estudio, se utilizaron conejos blancos de Nueva Zelanda machos y hembras, y su posterior descendencia. Los experimentos fueron realizados en los conejos > 1 mes de la edad. En el momento del experimento, estos conejos pesaban entre 0,47 y 5,00 kg.
    NOTA: Dado que los conejos deben estar en la misma habitación y a la vista de la cámara, no aísle completamente a los conejos. Existe el potencial de manifestaciones visuales y auditivas de un conejo que estresa a otro conejo. Por lo tanto, es ideal tener un conejo en la habitación a la vez, lo que se hace para los experimentos de estimulación fótica. Para todos los demás experimentos, los conejos se espaciar tanto como sea posible, manteniendo todos ellos dentro de la vista de la cámara de vídeo. Idealmente, se utilizan barreras o solo se estudia un animal a la vez. Esto no fue un factor de confusión importante, ya que las frecuencias cardíacasde los conejos se mantuvieron bastante estables durante los experimentos y hubo la presencia frecuente de husillos del sueño. Las grabaciones de múltiples animales aseguran simultáneamente que tanto los datos de animales de control como los de prueba se adquieran bajo las mismas condiciones ambientales.

2. Implantación de electrodos de EEG-ECG y fijación de monitores respiratorios

  1. Retire un conejo del transportista y colócale en el regazo de un investigador sentado.
  2. Sostenga el conejo verticalmente y manténgalo cercadelcuerpo del investigador.
  3. Baje el conejo en una posición supina, con la cabezadelconejo en las rodillasdelinvestigador, y la cabezadelconejo más baja que el resto de su cuerpo.
    NOTA: Esta maniobra relaja al animal y minimiza la probabilidad de que intente moverse o escapar mientras coloca los electrodos.
  4. Ahora que el conejo está asegurado en una posición supina, pida a un segundo investigador que extienda el pelaje hasta que la piel pueda ser identificada y aislada del tejido subyacente.
  5. Insertar electrodos dobladosa 35° subdérmicamente en cada axila (Figura 3A).
    NOTA: Los electrodos deben ser empujados a través de modo que estén firmemente enganchados a la piel, pero no penetren en estructuras más profundas. Hacer que el electrodo entre y luego salga de la piel (de paso a través) reduce la posibilidad de que los cables se desalojan al colocar el conejo en el sujetador o si se mueve durante el experimento (Figura 3B). Todos los electrodos se esteriliza con etanol al 70% antes de su colocación.
  6. Coloque los plomos en el pecho posterior a las extremidades anteriores derecha e izquierda y en el abdomen anterior a la extremidad posterior izquierda. Coloque un electrodo de alfiler de tierra anterior a la extremidad posterior derecha en el abdomen (Figura 4A).
  7. Una vez que todos los cables de ECG estén colocados correctamente, devuelva el conejo a una posición decúbito prono, con los cables corriendo por un lado del abdomen del conejo, y transfiera el conejo a un sujeción de tamaño adecuado (por ejemplo, 6 "x 18" x 6").  Al colocar el conejo en el sujeción, tire del cable suelto hacia arriba para minimizar que el conejo saque los electrodos con sus patas. Pegue los cables al lado del sujetador para que no sean atrapados debajo del conejo durante el experimento (Figura 4B).
  8. Asegure el conejo en el sujeción bajando la sujeción alrededor del cuello y bloqueándolo en su lugar. Además, mueva las extremidades traseras hacia arriba debajo del animal y asegure la sujeción trasera.
    NOTA: Uno debe ser capaz de caber 1-2 dedos dentro del espacio debajo del cuello para asegurar que no es demasiado apretado. Particularmente durante los experimentos donde puede haber movimiento motor, es importante apretar la sujeción para minimizar el movimiento, las posibles lesiones espinales, la dislocación de las extremidades y la capacidad de eliminar la sujeción trasera (Figura 4B). Los conejos se han mantenido en el sujetador durante ~ 5 h sin ningún problema relacionado con el aumento del movimiento o signos de deshidratación.
    1. Para los conejos pequeños (por ejemplo, menos de 2 meses) coloque una almohadilla de refuerzo de goma debajo del animal para criar al conejo, lo que evita que el conejo descanse su cuello en la parte inferior del reposacabezas (Figura 4C).
      NOTA: Una caída repentina en el ritmo respiratorio y cardíaco puede ser secundaria al choque del cuello. Si esto ocurre, afloje el sujeción del cuello y levante la cabezadelconejo para aliviar cualquier compresión del cuello.
    2. Cuando la sujeción trasera no rastrea de cerca la espalda/columna vertebral del conejo, coloque un espaciador de PVC para evitar cualquier movimiento que pueda causar lesiones en la columna vertebral.
      NOTA: Por ejemplo, ~ 14 cm de largo x 4 "tubo de PVC de diámetro interior, con el 25-33% inferior eliminado se puede colocar sobre el conejo con espuma para proporcionar la restricción adecuada (Figura 4C).
  9. Ahora que el conejo está colocado firmemente en el sujeción, inserte los electrodos de clavijas rectas subdérmicas de 7-13 mm en el cuero cabelludo (Figura 3A). Usando un enfoque de ángulo de entrada de 45°, ejecute los cables entre las orejas y ate los cables libremente al sujetador detrás de la cabeza para mantener la colocación del plomo. Coloque 5 cables de EEG en las siguientes posiciones: anterior derecho, anterior izquierdo, occipital derecho, occipital izquierdo y un cable de referencia central (Cz) en el punto entre los otros 4 cables (Figura 4D).
    NOTA: Los electrodos se colocan correctamente cuando se colocan en el tejido subcutáneo contra el cráneo. Esta colocación minimiza el artefacto de la nariz, las orejas y otros músculos circundantes. Algún artefacto del movimiento rítmico de la nariz es inevitable. Los cables de EEG anteriores deben colocarse medialmente a los ojosdelconejo y apuntarse anterior. Los cables occipitales deben colocarse antes de las orejas y apuntarán en la dirección medial. Cz se coloca en el centro de la parte superior de la cabeza en un punto que está entre los 4 electrodos (a medio camino entre Lambda y Bregma, a lo largo de la línea de sutura). El perno del electrodo Cz señala anterior.
    1. Pase los cables EEG entre las orejas, para evitar que el conejo intente morder los cables.
  10. Conecte el pletismógrafo del oxímetro de pulso a la oreja del conejo sobre la vena marginal del oído.
    NOTA: Puede ser necesario afeitar el exceso de vello de la oreja para mejorar la señal o usar alguna gasa para mantener el sensor en su lugar.
    1. Asegúrese de que la frecuencia cardíaca en la pletismografía se correlacione con la frecuencia cardíaca del ECG y que se muestre la saturación de oxígeno (Figura 5C).
  11. Coloque suavemente la mascarilla con tubos de capnografía sobre la boca y la nariz del conejo (Figura 4H). Asegure la mascarilla con una cuerda envuelta alrededor de la máscara y coloque ambos extremos de la cuerda al sujetador. Coloque el otro extremo del tubo de capnografía al monitor de signos vitales.
    NOTA: Es importante evitar que la cuerda se tenda sobre los ojos del conejo durante el experimento. Para hacer esto, pegue la cuerda en el centro del sujetador entre las orejas del conejo. Con el fin de mejorar la señal de capnografía, crear una válvula unidireccional utilizando cinta adhesiva y un trozo delgado de nitrilo que permitirá que el oxígeno entre en la pieza en T, y dirigirá el CO2 exhalado en el tubo de capnografía (Figura 4I).

3. Grabación de video-EEG-ECG

  1. Realice la grabación video-EEG-ECG usando un software EEG disponible en el comercio.
    NOTA: Los cables biopotenciales y el video están bloqueados en el tiempo para correlacionar más tarde las señales eléctricas y de video (por ejemplo, pico de EEG con un tirón mioclónico).
  2. Confirme una conectividad óptima, sin deriva de línea de base, sin ruido eléctrico de 60 Hz y una alta relación señal/ruido. Específicamente, asegúrese de que cada fase de la forma de onda cardiaca se pueda visualizar en el ECG y que el delta, el theta, y las ondas alfa no sean visualmente obscurecidos por el ruido de alta frecuencia en el EEG.
    1. Si todos los electrodos están produciendo cantidades excesivas de ruido, ajuste el plomo de referencia central. Si solo un electrodo es excesivamente ruidoso, empuje ese electrodo más profundamente en la piel o reposicionarlo hasta que no haya metal expuesto.
  3. Ajuste el video para que todos los conejos puedan ser vistos simultáneamente, lo que permite la correlación de la actividad motora con los hallazgos de EEG (Figura 5A).
    NOTA: El sistema acomoda grabaciones simultáneas de EEG/ECG/oximetría/capnografía de hasta 7 conejos.
  4. Iniciar el registro basal de cada animal durante un mínimo de 10-20 min o hasta que la frecuencia cardíaca se estabilice a un estado relajado y tranquilo (200-250 lpm) y los conejos no presenten grandes movimientos durante al menos 5 min. Adquiera datos electrográficos de ancho de banda completo sin filtros. Con el fin de visualizar mejor los datos, establezca el filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) a 1 Hz y el filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) a 59 Hz.
    NOTA: Otra señal de que el conejo está relajado es la aparición de husillos de sueño EEG (discutidos más adelante).
  5. Agregue notas con tiempo bloqueado durante el experimento en tiempo real para indicar el momento de las intervenciones (por ejemplo, administración de fármacos) y los eventos neuro-cardíacos (por ejemplo, pico de EEG, convulsiones motoras, latidos ectópicos y arritmias) y artefactos motores/investigadores.
    NOTA: Debido a la frecuencia con la que el investigador necesita aplicar una intervención (por ejemplo, estimulación fótica, administración de fármacos), para minimizar el estrés de un investigador que entra y sale de la habitación y abre/cierra la puerta, el investigador permanece en el lado opuesto de la habitación durante todo el experimento. El investigador se sienta lo más lejos posible del animal, y permanece quieto y en silencio para minimizar la posibilidad de perturbar a los animales.

4. Protocolos experimentales

NOTA: Cada uno de los siguientes experimentos se realizan en días separados si se realizan en el mismo animal. Hay un retraso de 2 semanas entre los estudios de fármacos compuestos de pruebas orales y el estudio de fármacos proconvulsivos terminales agudos. Cuando es necesario, se realiza el experimento de estimulación fótica, seguido de una espera de 30 minutos, y luego el estudio de fármacos PTZ.

  1. Para permitir que los conejos se aclimaten en los sujetadores y para que el investigador confirme objetivamente la estabilización de las tasas cardiorrespiratorias, instrumente a todos los conejos con los sensores cardiorrespiratorios y neuronales y realice un monitoreo de video continuo durante > 1 hora, 1 - 3 veces por animal.
  2. Experimento de estimulación fótica
    1. Además del método descrito anteriormente, coloque una fuente de luz con un reflector circular de 30 cm delante del conejo a la altura de los ojos, con la intensidad del flash establecida en el máximo (16 candela)29. La fuente de luz se indica mediante un punto blanco en la Figura 4E.
      NOTA: Se debe utilizar una habitación poco iluminada para provocar la respuesta fotosensible37.
    2. Como los ojosdelconejo están en el lado de la cabeza en lugar de la parte delantera de su cabeza (como en los humanos), coloque 2 espejos a cada lado del conejo, y 1 detrás del conejo para que la luz entre en los ojosdelconejo.
      NOTA: Un espejo plano que mide ≥ 20 cm de alto, ≥ 120 cm de largo crea un recinto triangular alrededor del conejo para asegurar que la luz parpadeante entre en los ojosdelconejo, como se ve en la Figura 4E.
    3. Conecte la fuente de luz a un controlador que tenga una velocidad, intensidad y duración ajustables.
    4. Grabe video usando una cámara con una luz roja y capacidades de grabación infrarroja.
    5. Exponer a los conejos a cada frecuencia durante 30 s con los ojos abiertos y luego otros 30 s con una máscara quirúrgica que cubre su cara para simular o causar el cierre del ojo en cada frecuencia.
      NOTA: Estudios anteriores han demostrado que el cierre ocular es la maniobra más provocativa para provocar fotosensibilidad a la convulsión29. Además, el 10% de los pacientes fotosensibles sólo presentan signos electroencefalográficos mientras sus ojos están cerrados29. Un asimiento se puede identificar clínico observando la presencia de tirones mioclónicos de la cabeza y del entero-cuerpo, clonus, o un estado tónico. La grabación de EEG se analiza más a fondo para la correlación electroencephalographic (e.g., puntos, poli-puntos, y descargas rítmicas) con las manifestaciones del motor para una diagnosis definitiva de la actividad de asimiento. Los movimientos en los cuales el EEG es obscurecido por el artefacto del músculo o las ondas del epileptogenicity indeterminante se deben repasar por un epileptologist para la confirmación.
    6. Aumente la frecuencia del estimulador fótico de 1 Hz a 25 Hz en incrementos de 2 Hz. A continuación, realice el mismo protocolo de fotoestimulación, pero esta vez disminuir la frecuencia de 60 Hz a 25 Hz en incrementos de 5 Hz.
      NOTA: Si un conejo tiene una convulsión, el experimento debe detenerse. Continúe monitoreando el conejo durante 30 min. A continuación, devolver el conejo a la sala de alojamiento y supervisar cada 1 h durante 3 h para la recuperación completa. Sin embargo, si la estimulación fótica induce una respuesta fotoparoxismal, entonces el resto de las frecuencias ascendentes se omiten y la serie se inicia de nuevo descendiendo desde 60 Hz hasta que se produce otra respuesta fotoparoxismal. Esto permitirá la determinación de los umbrales de estimulación fótica superior e inferior. No es necesario ningún retraso, ya que la respuesta fotoparoxismal cesará después de que se suspenda la estimulación fótica. Si no está claro si se ha producido una respuesta fotoparoxismal, la frecuencia se repite después de un retraso de 10 s38.
    7. Después de que se complete el experimento, retire los cables de EEG y ECG del conejo y devuélvalo a su jaula doméstica para el cuidado de rutina por parte del personal de la cría.
  3. Administración oral de medicamentos
    1. Como muchos medicamentos se toman por vía oral, prepare compuestos orales mezclándolos con salsa de manzana de grado alimenticio. Mezcle 0,3 mg/kg de E-4031 en 3 ml de salsa de manzana y cárguela en una jeringa oral/de riego de 3 ml sin aguja.
      NOTA: Varios medicamentos se pueden administrar de esta manera, incluyendo, compuestos de prueba, medicamentos que se sabe que alteran la duración del intervalo QT (moxifloxacina o E-4031), y un control negativo o vehículo. Algunos fármacos no están disponibles en una formulación intravenosa. Además, muchos medicamentos se prescriben en una formulación oral y, por lo tanto, una administración intravenosa puede tener menos relevancia clínica.
    2. Levante los labios superiores y deslice la punta de la jeringa oral en el lado de la bocadelconejo, que no está obstruido por los dientesdelconejo, e inyecte todo el medicamento y la salsa de manzana en la bocadelconejo.
    3. Continúe con la grabación de video-EEG-ECG durante 2 h y luego devuelva al animal a su jaula doméstica para el cuidado de rutina.
    4. En el día experimental 2 y 3, conecte el conejo al video-EEG-ECG, registre 10-20 minutos de la línea de fondo, después inyecte la misma medicación y registre para 2 h.
    5. Después de 1 semana de lavado, realice 10-20 minutos de la línea de fondo, y después dé a cada conejo una dosis sola del placebo por 3 días consecutivos y registre para 2 h.
      NOTA: La administración de medicamentos orales puede diseñarse como un estudio cruzado, en el que el placebo se administra durante la semana 1 y el medicamento en la semana 2.
  4. Experimento de medicación intravenosa (Pentylenetetrazol, PTZ)
    1. Para visualizar la vena marginal de la oreja, afeite la superficie posterior de la orejadelconejo. Use una toallita de etanol al 70% para desinfectar el sitio y dilatar la vena marginal del oído. Esto se indica mediante el óvalo discontinuo negro en la Figura 4F.
    2. En este punto, haga que un experimentador cubra la caradelconejo con su mano para disminuir el estrés del procedimiento al conejo. Un segundo experimentador cannula cuidadosamente la vena marginal del oído con un angiocatheter estéril 25-G.
    3. Una vez que el catéter esté en la vena, coloque un tapón de inyección estéril en el extremo del catéter para que una aguja pueda introducir el medicamento por vía intravenosa. La ubicación del tapón de inyección se indica mediante un círculo azul en la Figura 4G.
    4. Haga una férula envolviendo una gasa de 4 x 4 pulgadas con cinta adhesiva para que forme una forma de tubo y colocándola dentrodela oreja del conejo. Luego pegue la férula a la oreja para que el catéter esté asegurado en su lugar y permanezca en posición vertical, similar a la oreja no cateterizada.
    5. Inyecte 1 mL de 10 unidades usp por mL de solución salina heparinizada.
      NOTA: El catéter y el vaso deben estar visiblemente despejados de aire y permanecer patentados. Si el catéter no está en el vaso, la jeringa no empujará fácilmente y habrá acumulación de solución salina en el tejido subcutáneo.
    6. Dé a los conejos dosis incrementales de PTZ por vía intravenosa de 1 mg/kg a 10 mg/kg en incrementos de 1 mg/kg cada 10 min. Tome nota al comienzo de cada dosis para indicar qué animal se está inyectando y la concentración del medicamento.
      NOTA: Esto permite evaluaciones de los efectos agudos y aditivos de la administración de PTZ. Alternativamente, para evaluar más a fondo los efectos crónicos de la dosis baja de PTZ, el conejo se da dosis repetidas en cada concentración de dosis baja, 7 dosis en 2 mg/kg, 3 dosis en 5 mg/kg, entonces 3 dosis en 10 mg/kg, cada dosis es separada por 10 minutos.
    7. Después de cada dosis, vigile cuidadosamente el video-EEG-ECG-capnography-oximetry para cualquier anormalidad eléctrica y respiratoria neuro-cardiaca y evidencia visual de la actividad epileptiforme. Tenga en cuenta estos cambios en tiempo real y durante el post-análisis.
      NOTA: La actividad convulsiva a menudo comienza dentro de los 60 s de la administración de PTZ.

5. Conclusión de experimentos de no supervivencia.

  1. Si el conejo no experimentó muerte súbita durante el transcurso del experimento PTZ, administre 1 mL de 390 mg/mL de pentobarbital sódico por cada 4,54 kg de peso corporal (o 1,5 mL a todos los conejos), seguido de una descarga de 1 mL de solución salina normal. Monitoree el ECG para asegurarse de que el conejo sufre un paro cardíaco.
  2. Una vez que el conejo experimenta un paro cardíaco, realice rápidamente una necropsia para aislar recientemente varios órganos, incluidos el corazón, los pulmones, el hígado, el cerebro, el músculo esquelético y cualquier otro tejido necesario para los análisis moleculares / bioquímicos posteriores.
  3. Desechar el conejo de acuerdo con las políticas institucionales.

6. Análisis del ECG

  1. Utilice el software de análisis de ECG disponible en el mercado para inspeccionar visualmente el ECG e identificar períodos de taquicardia, bradicardia, latidos ectópicos y otras arritmias (Figura 6). Para reducir la cantidad de datos a revisar, cree un tacograma, que aumentará la facilidad con la que se pueden identificar períodos de taquicardia, bradicardia o irregularidades del intervalo RR.
    NOTA: Las anomalías del ECG (por ejemplo, prolongación del intervalo QTc) y las arritmias se identifican manualmente mediante la revisión del ECG para determinar si hay anomalías en la tasa (p. ej., arritmias brady/taqui-arritmias), el ritmo (p. ej., complejos auriculares/ventriculares prematuros), la conducción (p. ej., el bloqueo atriorculoventricular) y la forma de onda (por ejemplo, taquicardia auricular/ventricular no sinusal y fibrilación). Las arritmias se pueden detectar revisando el tacograma para detectar irregularidades en el intervalo RR. La taquicardia se puede identificar por secciones del tacograma en las que la frecuencia cardíaca está por encima de 300 latidos por minuto. La bradicardia se identifica cuando la frecuencia cardíaca es inferior a 120 latidos por minuto en el tacograma.
  2. Utilizando el software de análisis de ECG disponible en el mercado, realice mediciones estándar de ECG (frecuencia cardíaca, intervalos del ciclo cardíaco) al inicio y tras la provocación (por ejemplo, el investigador manipulando el animal, la administración de agentes de prueba y los cambios de ECG inducidos por convulsiones).

7. Análisis de video-EEG

  1. Desplácese visualmente por el vídeo y el trazado de EEG utilizando software disponible comercialmente para identificar la señal de referencia (Figura 7) y la presencia de descargas de EEG esperadas, como husillos de sueño (Figura 8) y ondas de vértice (Figura 9).
    NOTA: Aunque los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquieren sin ningún filtro, los datos deben mostrarse con el filtro de baja frecuencia (es decir, filtro de paso alto) establecido en 1 Hz, y basado en el teoremadeNyquist, el filtro de alta frecuencia (es decir, filtro de paso bajo) se establece en 120 Hz para evitar perder cualquier señal. Los filtros se pueden ajustar para permitir una mejor visualización y reducción de ruido (por ejemplo, 1-59 Hz) al revisar la actividad de EEG de frecuencia más baja (<25 Hz).
  2. Además de las formas de onda de capnografía, utilice el artefacto de movimiento de la nariz en el EEG para determinar la presencia frente a la ausencia de respiración. Esto también se puede correlacionar con los movimientos de la nariz que se ven en la grabación de video.
  3. Desplácese visualmente por el video y el rastreo de EEG utilizando software disponible comercialmente para distinguir los movimientos epilépticos frente a los no epilépticos (por ejemplo, conscientes) durante al menos 1 minuto después de cada dosis de PTZ(Figura 10). Explora para las descargas epilépticas interictales y para los cambios de EEG antes, durante, y después de asimientos. Un asimiento se puede identificar clínico observando la presencia de tirones mioclónicos de la cabeza y del entero-cuerpo, clonus, o un estado tónico con un correlativo de EEG. Los cambios de EEG pueden incluir los puntos de EEG, los poli-puntos, y las descargas rítmicas.
    NOTA: Los movimientos en los cuales el EEG es obscurecido por el artefacto del músculo o las ondas del epileptogenicity indeterminante se deben repasar por un neurólogo para la confirmación. Puede ser ventajoso enfocar el video en un conejo para ver su comportamiento, así como sus grabaciones de EEG y ECG, más de cerca (Figura 5B).
  4. Puntuar el video-EEG para las convulsiones en función del tipo y la gravedad de las manifestaciones motoras, que normalmente ocurren dentro de 1 minuto después de la inyección de PTZ (Tabla 1).
  5. Después de un experimento de estimulación fótica, analice los cables occipitales del EEG para detectar la presencia y ausencia del ritmo de conducción occipital mediante la creación de una gráfica de análisis espectral en el software de análisis de EEG disponible en el mercado. El ritmo de conducción occipital creará un pico en el análisis espectral que corresponde a la frecuencia del estimulador fótico (Figura 11).
    NOTA: La estimulación fótica puede producir picos de frecuencia armónicos además del pico de la frecuencia fundamental.

7. Análisis de la función respiratoria

  1. Revise la salida del monitor de signos vitales (Figura 4I) y exporte la señal para un análisis posterior.
  2. Tenga en cuenta el cambio en el patrón respiratorio durante una convulsión y después de una convulsión, especialmente el punto de tiempo cuando comienza la apnea.

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Representative Results

El método descrito anteriormente es capaz de detectar anomalías en el sistema de conducción eléctrica del cerebro y el corazón, así como alteraciones respiratorias. Se utiliza un software de adquisición de datos para evaluar la morfología del ECG y detectar cualquier frecuencia cardíaca anormal, alteraciones de la conducción o ritmos de ECG (latidos ectópicos auriculares/ventriculares y arritmias brady/taqui) (Figura 6). Además de visualizar la morfología del ECG, se analizan las trazas para cuantificar el intervalo RR, la frecuencia cardíaca, el intervalo PR, la duración P, el intervalo QRS, el intervalo QT, el QTc, el intervalo JT y el intervalo Tpico afinal T. El análisis de estos datos muestra que las taqui-/brady-arritmias están detectadas fácilmente.

Además de analizar los datos de ECG, también se analizan los datos de EEG. El EEG basal se recogió y analizó mediante análisis espectral(Figura 7). Estos datos muestran que los cables occipitales tienen una amplitud más alta que los cables frontales y que la frecuencia dominante en todos los cables está en el rango delta. Ser capaz de registrar EEGs de conejos con una alta relación señal/ruido es importante para detectar descargas epileptiformes y realizar análisis adicionales en la grabación. Las ondas que tienen una morfología y frecuencia similares a los husos del sueño humano se muestran en la Figura 8. Las ondas de vértice que se originan en el centro de la cabeza se muestran en la Figura 9. Además de los cambios normales de EEG, también se observan varios movimientos conscientes no epilépticos de conejos durante los registros basales para distinguirlos de las descargas epileptiformes (Figura 10). Las grabaciones de video-EEG de los movimientos mostrados, así como otras, están disponibles en la Película Suplementaria 1-11.

Varios métodos fueron puestos en ejecución para intentar inducir asimientos. El primer método empleó la estimulación fótica a 1-60 Hz con los ojos abiertos y cerrados (Figura 4E). Debido a que la posición de los ojos en el conejo es lateral en lugar de anterior como los humanos, los espejos se emplean para dirigir la luz hacia los ojos del conejo utilizando una sola fuente de luz. El análisis del EEG del experimento de estimulación fótica a 3 Hz muestra una fuerte respuesta de conducción occipital a la frecuencia esperada de 3 Hz (Figura 11). Además de la estimulación fótica, los conejos se inyectan con pentylenetetrazol (PTZ, bloqueador de GABAA) a través de un catéter en la vena del oído marginal izquierdo(Figura 4G). La inyección de PTZ causa diversos grados de actividad de asimiento en el plazo de 1 minuto y se asocia a formas de onda distintas de EEG. Algunas formas de onda representativas, que incluyen ráfagas theta, ráfagas theta de gran amplitud, ondas polyspike, ondas polyspike de baja tensión, estallidos gamma rítmicos y silencio electrocerebral (ECS) se muestran en la Figura 12, Figura 13, Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17.

Para identificar un asimiento se utilizan varios criterios. El vídeo se repasa para identificar cualquier manifestación posible del motor del asimiento. Entonces para confirmar que la actividad de motor era el resultado de la actividad epiléptica, la señal de EEG se evalúa para un punto temporal correlacionado de EEG, polyspike, onda aguda, o descarga rítmica. En caso de duda, el video-EEG es revisado por un segundo investigador y/o un epileptólogo para su verificación. El inicio de convulsiones se define como el primer caso de descargas rítmicas de EEG (inicio de convulsiones de EEG) y actividad motora (inicio de convulsiones clínicas). EEG y el asimiento clínico terminan cuando la cesación de los puntos rítmicos de EEG y de la actividad de motor, se observan, respectivamente. Además de varias morfologías de la onda de EEG, los conejos progresaron con asimientos cada vez más generalizados y cada vez más prolongados del motor. Se creó una escala de incautación porque ni la escala de convulsiones de Racine, ni sus versiones modificadas, eran aplicables a los conejos restringidos (Tabla 1). Los videos de la actividad convulsiva motora representativa se muestran en la Película suplementaria 17, la Película suplementaria 18, la Película suplementaria 19, la Película suplementaria 20, la Película suplementaria 21, la Película suplementaria 22.

El método aquí presentado también es capaz de determinar la cascada multi-sistema de eventos que preceden a la muerte súbita mediada por convulsiones (Figura 18). Varias patologías incluyen: silencio electrocerebral (ECS), paro respiratorio (apnea), brady-/taqui-arritmias, y paro cardiaco (asistolia.) Durante los experimentos, un conejo experimentó muerte súbita después de tener un asimiento farmacológico inducido. En este conejo, había una secuencia que comenzó con la detención respiratoria, entonces ECS, bloque auriculoventricular, varias taquiarritmias no-sostenidas, bradicardia, y en última instancia asistolia.

Figure 1
Figura 1: Visión general del protocolo experimental. Para proporcionar una descripción de los pasos principales en este protocolo, una figura fue creada. Esta figura indica que el aparato de control debe estar preparado, seguido de conectar el equipo al conejo y garantizar que se observe una señal de alta calidad. Después de este paso, se puede realizar el experimento previsto, se pueden obtener órganos y analizar los datos de video-EEG-ECG-capnografía-oximetría. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2:Equipos experimentales. Diagrama de configuración experimental, que incluye una computadora, luz infrarroja, micrófono, cámara de video, monitor de signos vitales, caja de cabeza de 64 pines, amplificador, digitalizador, 8 electrodos (5 EEG, 3 ECG) + tierra para cada animal que están conectados a la caja de cabeza. Los cables están codificados por colores de acuerdo con lo siguiente: 4 EEG azul, 1 referencia EEG negro, 3 ECG rojo, 1 suelo verde. La caja de sujeción que sostiene a los conejos no se muestra. Esta configuración permite grabar hasta 7 conejos simultáneamente. La línea amarilla representa el tubo de capnografía y conecta la mascarilla con el monitor de signos vitales. La línea azul representa el cable de oximetría que está conectado al monitor de signos vitales. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Imagen de electrodos de EEG y ECG. (A) Electrodos de ECG doblados y electrodos de EEG rectos. (B) Cómo enganchar el electrodo de ECG en el tejido subcutáneo del conejo, para que sea a través y a través. Abreviaturas (LL: Miembro izquierdo, RA: Brazo derecho, RL: Miembro derecho, LA: Brazo izquierdo, RF: Frontal derecho, LF: Frontal izquierdo, Cz: Centro, RO: Occipital derecho, LO: Occipital izquierdo). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4:Conejo conectado al equipo. (A) Ubicación de los electrodos de ECG, brazo izquierdo se indica mediante un punto amarillo. El brazo derecho está indicado por un punto blanco. La pierna izquierda se indica con un punto rojo. El suelo anterior a la pierna derecha está indicado por un punto verde. (B) Conejo en sujeción con electrodos de ECG y EEG unidos. (C)Conejo juvenil en un sujetador con las modificaciones apropiadas para acomodar un conejo más pequeño, incluyendo un refuerzo debajo del conejo, espuma de cuello y tubería de PVC cortada. (D)Conejo en sujeción con localización de electrodos EEG. Frontal derecho se indica con un punto naranja. Frontal izquierdo se indica con un punto rojo. El occipital derecho está indicado por un punto amarillo. El occipital izquierdo se indica con un punto azul. La referencia se indica mediante un punto negro. (E)Conejo en sujeción con estimulador fótico y configuración de cabina de espejo. La fuente de luz se indica mediante un punto blanco. (F) Vena marginal del oído después de que la oreja del conejo ha sido afeitada y limpiada con alcohol. (G)Conejo con angiocatéter grabado firmemente en la vena del oído marginal izquierdo. El sitio del tapón de inyección está indicado con un punto azul. (H) Conejo con mascarilla unida a la tubería de capnografía por una pieza en T que contiene una válvula unidireccional. (I) Diagrama de la mascarilla y la pieza en T conectadas al tubo de capnografía. Durante la inspiración, el aire de la habitación es capaz de entrar en la pieza en T a través de una válvula unidireccional (flecha verde). Durante la expiración, el CO2 sale de la pieza en T entrando en el tubo de capnografía (flecha amarilla). Debido a la pequeña cantidad de espacio muerto, se retiene muy poco CO2 en la pieza en T y generalmente es inferior a 5 mmHg. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5:Video-EEG-ECG-Capnografía-Oximetría simultánea de conejos. (A)Grabación simultánea de video-EEG-ECG de 3 conejos. (B) Zoom en vista de la grabación simultánea de video-EEG-ECG de Rabbit #2. (LL: Miembro izquierdo, AR: Brazo derecho, LA: Brazo izquierdo) (C)Grabación simultánea de capnografía (amarillo) y pletismografía (azul). En la figura se incluyen mediciones que muestran el CO2inspirado, el CO2de marea final, la frecuencia respiratoria, la frecuencia del pulso y la oximetría de pulso. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 6
Figura 6:ECG de conejo. (a) ECG basal. Los cables se muestran en la configuración estándar de plomo de las extremidades del plano frontal bipolar y en la configuración unipolar (AR: Brazo derecho, LL: Miembro izquierdo, LA: Brazo izquierdo) con el plomo Cz en la cabeza como referencia. (B)Complejos ventriculares prematuros. (C) Bradicardia sinusal. (D) Taquicardia sinusal. (E)Trazado de ECG de conejo de línea base con inicio de onda P, pico de onda P, extremo de onda P, inicio de onda QRS, pico de onda QRS, extremo de onda QRS, altura del segmento ST, pico de onda T, extremo de onda T etiquetado. (F) Mediciones de ECG. Todas las mediciones son en milisegundos excepto la frecuencia cardíaca, que está en latidos por minuto. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 7
Figura 7:EEG basal y análisis espectral. (A) Seguimiento de EEG durante el registro de referencia. (B) El análisis espectral del EEG muestra que la actividad de la onda delta es la frecuencia dominante en todos los cables. Delta (δ: hasta 4 Hz) Ondas Theta (θ: 4-8 Hz) Ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) Ondas Beta (β: 15-32 Hz) Ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz). El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 120 Hz. Las grabaciones de Video-EEG-ECG se muestran en las películas suplementarias 1 y 2. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 8
Figura 8:Trazado EEG del husillo del sueño y análisis espectral. (A) Trazado de EEG durante los husillos del sueño. (B) El análisis espectral del EEG muestra la presencia de una onda adicional a 12-15 Hz, que es similar a la frecuencia asociada con los husos del sueño en los seres humanos. Delta (δ: hasta 4 Hz) Ondas Theta (θ: 4-8 Hz) Ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) Ondas Beta (β: 15-32 Hz) Ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz). El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). (C)Los montajes múltiples de EEG de un huso del sueño demuestran que se presentan del centro de la cabeza (Cz), que es constante con resultados humanos. Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Trazado de ondas de vértices y análisis espectral. (A) Trazado EEG de múltiples ondas de vértices. (B) El análisis espectral de las ondas de vértice no muestra una diferencia apreciable en la frecuencia de las ondas de vértice. Aunque esto se espera porque visualmente la frecuencia es inferior a 1 Hz.(C)Múltiples montajes de EEG de ondas de vértice muestran que surgen del centro de la cabeza, lo que es consistente con los hallazgos humanos. Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 10
Figura 10:Artefactos de EEG causados por el movimiento del conejo. (A) EEG durante la saccade del ojo derecho. (B) EEG durante un parpadeo en el ojo izquierdo. (C)EEG durante el movimiento rítmico de la nariz que se asocia con la presencia de respiración. (D) EEG durante el movimiento de lamer. (E) EEG durante un episodio del conejo extendiendo su cabeza hacia abajo. (F)EEG durante movimientos conscientes complejos de todo el cuerpo. Video-EEG de estos movimientos están disponibles en Películas suplementarias 3-11. Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: EEG durante la estimulación fótica. (A)Seguimiento de EEG durante la estimulación fótica de 3 Hz con los ojos del conejo abiertos. (B)Análisis espectral de la estimulación fótica de 3 Hz con picos a 3 Hz vistos en los cables occipitales, pero no en los cables frontales. Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 12
Figura 12:Trazado EEG y análisis espectral de las ráfagas theta. Las explosiones de Theta se consideran intermitentemente en todos los cables EEG. La frecuencia de estas ondas es de alrededor de 4-6 Hz. Delta (δ: hasta 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 13
Figura 13: Trazado EEG y análisis espectral de ráfagas theta de gran amplitud. Las ráfagas theta de gran amplitud son similares en apariencia y frecuencia a las ondas theta, pero con una amplitud mayor. El rápido cambio en la amplitud hace que algunas de estas ondas se vean más nítidas. Delta (δ: hasta 4 Hz) Ondas Theta (θ: 4-8 Hz) Ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) Ondas Beta (β: 15-32 Hz) Ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz). El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). La grabación de Video-EEG-ECG se muestra en la Película Suplementaria 12. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 14
Figura 14:Trazado EEG y análisis espectral de ondas polyspike. Las ondas de Polyspike se ven intermitentemente y simultáneamente en todos los cables. En el análisis espectral, hay múltiples picos armónicos con una frecuencia fundamental alrededor de 6 Hz. Delta (δ: hasta 4 Hz) Theta (θ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). La grabación de Video-EEG-ECG se muestra en la Película Suplementaria 13. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 15
Figura 15: Trazado EEG y análisis espectral de ondas polispike de baja tensión. Las ondas polyspike de bajo voltaje son similares a las ondas polyspike, pero tienen una amplitud más baja. El análisis espectral es similar al de las poliespecíneas. Delta (δ: hasta 4 Hz) Ondas Theta (θ: 4-8 Hz) Ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) Ondas Beta (β: 15-32 Hz) Ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz). El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 16
Figura 16:Trazado de EEG y análisis espectral de estallidos gamma rítmicos. Las explosiones gammas rítmicas en un patrón que estalla se consideran lo más claramente en los plomos anteriores. En el análisis de frecuencia hay un pico adicional visto alrededor de 50-55 Hz en los cables anteriores. Delta (δ: hasta 4 Hz) Ondas Theta (θ: 4-8 Hz) Ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) Ondas Beta (β: 15-32 Hz) Ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz). El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 120 Hz. La grabación de video-EEG-ECG se muestra en la película suplementaria 14. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 17
Figura 17:Trazado de EEG y análisis espectral de la supresión de EEG generalizada postictal. Supresión generalizada postictal de EEG con el histograma de frecuencia correspondiente. Delta (δ: hasta 4 Hz) Ondas Theta (θ: 4-8 Hz) Ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) Ondas Beta (β: 15-32 Hz) Ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz). El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). Los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquirieron sin ningún filtro, pero los datos se mostraron con filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) establecido en 1 Hz y filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) establecido en 59 Hz. El eje Y es log power spectral density 10*log10(μV2/Hz). La grabación de Video-EEG-ECG se muestra en la Película Suplementaria 15. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 18
Figura 18 :Secuencia de muerte súbita después de la convulsión. Un conejo experimentó muerte súbita durante el protocolo de PTZ y la secuencia de la muerte es detallada. Las manifestaciones electroencefalográficas están indicadas en verde. El tiempo cero es el final clínico de la convulsión. Esto es seguida por el silencio electrocerebral post-ictal (ECS.) Los datos respiratorios se muestran en rojo y señalan la aparición de apnea. La información electrocardiográfica se muestra en tonos de azul. Este conejo experimentó bloqueo cardíaco, taquiarritmias múltiples, bradicardia y, en última instancia, asistolia, que está indicada por la estrella negra. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Tabla 1: Escala de convulsiones para conejos restringidos. El aumento de la gravedad de las convulsiones se asocia con una actividad motora epiléptica cada vez más sostenida y generalizada. Ejemplos de video están disponibles en Películas suplementarias 17-22. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Película suplementaria 1: Grabación de video-EEG-ECG de conejo de línea base con las luces encendidas. Después de que el conejo se coloca en el sujetador, el conejo se vuelve más relajado y se pueden hacer grabaciones de línea de base. El video muestra que el conejo no se mueve durante esta grabación. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 2: Grabación de video-EEG-ECG de conejo de línea de base con las luces apagadas. Para que se realice un experimento de estimulación fótica, las luces de la habitación deben estar apagadas. Apagar las luces en la habitación no afecta significativamente la grabación de EEG o ECG. Es importante destacar que la cámara de video tiene una luz infrarroja para que el conejo se pueda ver en la oscuridad. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 3: Artefacto muscular del movimiento del ojo izquierdo. El método descrito en este papel puede discernir entre el artefacto del músculo y las descargas epileptiformes. Aunque esta onda de amplitud grande periódica se pudiera confundir con un asimiento, ocurre simultáneamente con el movimiento del ojo izquierdo y es por lo tanto más probable ser causada por actividad muscular. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 4: Artefacto muscular de un parpadeo en el ojo izquierdo. La grabación de video-EEG es capaz de detectar un parpadeo ocular en EEG y también determinar que ocurre simultáneamente con el parpadeo ocular visto en video. El parpadeo del ojo se lateraliza a los plomos izquierdos laterales de EEG. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 5: Artefacto muscular del músculo de la mandíbula. El video-EEG es capaz de detectar el movimiento de pequeños músculos de la cabeza y el cuello. El video es invaluable para determinar que este movimiento se debe a los músculos en lugar de a las descargas epilépticas del cerebro. Como era de esperar la señal asociada a este movimiento surge de los cables occipitales. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 6: Artefacto muscular de lamer. El trazo de EEG demuestra las ondas agudas rítmicas grandes que podrían ser constantes con actividad de asimiento. El video demuestra que estas ondas son causadas por movimientos de la lengua y no son descargas epilépticas. Como era de esperar, la señal asociada a este movimiento surge de los cables occipitales. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 7: Artefacto muscular del movimiento de la boca. Las nuevas ondas que se ven en la cordillera delta están asociadas con el movimiento de la boca. Importantemente, esto se puede distinguir de la desaceleración intermitente secundaria a la encefalopatía por la visualización del movimiento de la boca cuando aparecen las ondas theta. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 8: Artefacto muscular de giro de cabeza. Una disminución grande, lenta y transitoria de la amplitud observada en los cables frontales se asocia con el giro de la cabeza del conejo. Es importante tener en cuenta que no hay descargas epilépticas que preceden al movimiento. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 9: Artefacto muscular de la extensión de la cabeza. Un aumento grande, lento y transitorio en la amplitud se ve en todos los plomos cuando el conejo está levantando su cabeza. No hay descargas epilépticas que preceden al movimiento. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 10: Artefacto muscular de la flexión de la cabeza. Una disminución muy grande en la amplitud en todos los plomos se ve cuando el conejo extiende su cabeza hacia abajo. No hay descargas epilépticas que preceden al movimiento. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 11: Artefacto muscular del movimiento complejo. Mientras que en el sujetador, el conejo hace un movimiento complejo que involucra su cabeza y todo su cuerpo. Esto ocurrió durante la grabación de la línea de fondo, antes de que cualquier medicación de asimiento-inducción fuera dada. Este movimiento rápidamente que ocurría fue registrado como explosión de alta amplitud y de alta frecuencia en el EEG. Además, las ondas agudas rítmicas que se ven en los cables frontales se deben al movimiento de la nariz, que se puede ver que es sincrónico con las ondas en el video. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 12: Video-EEG de grandes explosiones de amplitud theta. Después de la inyección de PTZ algunos conejos exhibieron una desaceleración intermitente del EEG en todos los plomos. Estas ondas anormales no fueron asociadas generalmente al movimiento. Aunque estas explosiones de ondas en la gama del theta no sean típicas de actividad de asimiento, se asocian a encefalopatía en seres humanos. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 13: Video-EEG de polyspikes. Las ondas agudas se pueden ver inmediatamente después de la inyección, durante una convulsión o durante el período postictal. Estos hallazgos son similares a los que se encuentran en los seres humanos y se asocian con la actividad convulsiva. Durante los polyspikes, el oído derecho también se nota para ser crispando, una manifestación física del asimiento. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 14: Video-EEG de estallido gamma rítmico. Las ráfagas de alta frecuencia, como las que se muestran en el video, a menudo ocurren en el período postictal y ocasionalmente después de dosis de PTZ. La causa fisiológica de estas explosiones gammas de alta frecuencia es desconocida. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 15: Video-EEG de la supresión generalizada postictal de EEG. En el período postictal, especialmente después de un asimiento tónico-clónico generalizado, hay a menudo supresión del EEG en todos los plomos. Las deflexiones grandes de la amplitud durante el período postictal se muestran para ser causadas por el artefacto del músculo de tirones mioclónicos. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 16: Video-EEG del silencio electrocerebral. Este vídeo demuestra la alta relación señal/ruido de este método. Con la actividad mínima de EEG, no hay señal apreciativa del EEG. Esta especificidad es importante a la hora de determinar el momento de la muerte encefálica. Además, cabe señalar que a menudo hay función cardíaca residual después de que se ha producido la muerte cerebral. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 17: Video-EEG de la etapa 0 de la escala del asimiento. La Escala de Convulsiones está diseñada para calificar la gravedad de las convulsiones motoras mediante la determinación de la propagación y la duración de la convulsión. En la etapa 0, no hay actividad de asimiento visible, aunque pueda haber descargas epilépticas consideradas en EEG. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 18: Video-EEG de la etapa 1 de la escala del asimiento. La etapa 1 de la escala de la asimiento es identificada por la presencia de un asimiento parcial breve. Generalmente, las convulsiones parciales se limitan a la cabeza, en lugar de cualquier otra parte del cuerpo. Esto puede manifestarse como tirones de una sola cabeza, contraccións de un solo oído u otra actividad motora breve y no rítmica asociada con descargas epilépticas en EEG. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 19: Video-EEG de la etapa 2 de la escala del asimiento. La etapa 2 de la escala del asimiento es identificada por un asimiento generalizado no-sostenido. Con frecuencia todo el cuerpo se someterá a un tirón mioclónico. Esto se distingue de las etapas posteriores por una falta de rítmica. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 20: Video-EEG de la etapa 3 de la escala del asimiento. La etapa 3 de la escala del asimiento es identificada por un asimiento sostenido, rítmico que se limite a la cabeza en términos de manifestaciones del motor. El conejo que se muestra tiene contracciones rítmicas de las orejas y los párpados. El conejo experimenta un breve tirón mioclónico de todo el cuerpo, pero no progresa a sacudidas rítmicas de todo el cuerpo. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 21: Video-EEG de la etapa 4 de la escala del asimiento. La etapa 4 de la escala de convulsiones se identifica por una convulsión sostenida y rítmica que involucró a todo el cuerpo. Como se puede ver en el video, el cuerpo del conejo está involucrado en mioclono, mientras que hay relativamente poco movimiento de las orejas, los ojos y la cabeza. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 22: Video-EEG de la etapa 5 de la escala del asimiento. La etapa final de la Escala de Convulsiones si se identifica por la presencia de las fases tónica y clónica de la convulsión. Inicialmente hay un movimiento desorganizado de todo el cuerpo. Esto es seguida por la etapa tónica, luego por la etapa clónica de la convulsión hasta que la convulsión se resuelve. Ocasionalmente, los conejos experimentan la muerte súbita después de esta etapa, pero rara vez mueren después de una convulsión de menor gravedad. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

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Esta configuración experimental facilita grabaciones y análisis detallados de video-EEG-ECG-oximetría-capnografía simultánea en conejos, particularmente en modelos de enfermedades cardíacas y /o neuronales. Los resultados de este artículo demuestran que este método es capaz de detectar asimientos y arritmias y de distinguirlos de artefactos electrográficos. Los resultados esperados fueron obtenidos al dar a conejos un proconvulsivo, que indujo asimientos. Los datos obtenidos de las grabaciones video-EEG podían ser analizados más a fondo para distinguir movimientos voluntarios contra la severidad cada vez mayor de los asimientos del motor y de las anormalidades electroencephalographic, incluyendo respuesta que conducía fótica, encefalopatía y descargas epileptiformes. Los varios tipos de descargas epileptiformes fueron caracterizados y correlacionados más a fondo con actividad de motor. El análisis del ECG demostró un método que produjo un alto ratio de la señal-a-ruido y permitió la identificación y la cuantificación de cada correlación eléctrica del ciclo cardiaco. Este método también fue capaz de detectar la presencia de anomalías cardíacas, incluyendo complejos ventriculares prematuros, bradicardia, bloqueo cardíaco, taquicardia, taqui-arritmias y asistolia. El desarrollo de un método robusto para investigar más a fondo las interacciones neuro-cardiacas de enfermedades multi-sistema proporciona un avance tecnológico importante que es necesario para comprender mejor estas enfermedades. Además, la monitorización de la función respiratoria a lo largo del tiempo facilita una mejor comprensión de la insuficiencia respiratoria después de las convulsiones y su contribución a la muerte súbita.

Esta configuración también proporciona un sistema robusto para estudios de fármacos, como las pruebas de seguridad cardíaca. Los proyectos de investigación que emplean estas técnicas son capaces de investigar la interacción entre las manifestaciones neuronales, cardíacas y respiratorias en tiempo real. Aunque muchos estudios se han conducido en corazones de roedores, los resultados en el corazón del conejo son mejores para los estudios de traslación, pues la expresión del canal del ion, las propiedades del potencial de acción, y las medidas de ECG son similares a los seres humanos. Como se trata de una configuración de video-EEG-ECG utilizada clínicamente, en el futuro el mismo diseño se puede aplicar a grandes mamíferos, como cerdos, perros u ovejas. Además, esta configuración de grabación se puede utilizar para la monitorización intracraneal de EEG en el conejo que se mueve libremente, lo que permite grabaciones más extensas en varios estados fisiológicos, eventos neuro-cardíacos espontáneos circundantes y muerte súbita precedente. Estos métodos serán invaluables para dilucidar el mecanismo de SUDEP y para encontrar nuevas terapias dirigidas a tratar enfermedades del cerebro y el corazón.

El protocolo presentado en este artículo tiene muchos pasos críticos que se deben seguir para producir datos con una alta relación señal/ruido. Es importante destacar que antes de que comience el experimento, el conejo debe estar asegurado en el sujetador para limitar los movimientos de cuerpo grande que podrían resultar en una lesión espinal. Todos los electrodos se comprueban para la calidad de la señal. Si todos los electrodos son ruidosos, entonces el electrodo de referencia puede ser reemplazado para mejorar la señal. Si los electrodos individuales son ruidosos, entonces ese electrodo debe ser empujado más profundamente en la piel o removido y reimplantado. Durante el experimento, el movimiento de los conejos puede hacer que los electrodos se desplacen. Tan pronto como sea posible, intente reemplazar los electrodos sin obstruir la vista de la cámara para que aún se puedan recopilar datos del experimento.

Una ventaja de la metodología descrita en este estudio es que facilita al investigador la detección de un gran número de animales, y es rentable. Existen limitaciones de este protocolo. Aunque, pocos estudios se hayan realizado para investigar específicamente el impacto fisiológico de la restricción en conejos, encontramos que los conejos toleraron la restricción extremadamente bien. Muchos estudios del sistema auditivo se han realizado en conejos despiertos en restricciones ligeras. En estas condiciones, los conejos se sientan tranquilamente durante horas sin ningún signo de estrés o incomodidad39. Después de ser colocados en el sujetador, los conejos rara vez tratan de escapar del sujetador. Exhiben un ritmo cardíaco que está cerca de la línea de fondo y se quedan a menudo dormidos, según lo observado por la presencia de husillos del sueño en el EEG. Los conejos no exhiben visual, ritmo cardíaco, o cualquier otra manifestación para sugerir que están estresados.

Una dirección futura es desarrollar un sistema para la grabación telemétrica de EEG y ECG. Esto permitiría un análisis más detallado durante varios estados fisiológicos, la detección de asimientos espontáneos, y la cascada de cambios neuro-cardiacos que precedían muerte inesperada repentina en la epilepsia (SUDEP.) Debido a las restricciones tecnológicas y a una relativa falta de literatura sobre EEG en conejos, el método presentado se desarrolló primero. Para adaptar este método a los conejos que se mueven libremente, requeriría la supervisión video continua, los implantes intracraneales de EEG, y los electrodos subcutáneos de ECG. Sin embargo, la capnografía respiratoria crónica no sería factible. Debido a las regulaciones institucionales (IACUC), la metodología es para grabaciones de ≤5 horas en el restringidor. En roedores, es común evaluar el umbral, la dinámica y los tipos de convulsiones utilizando medidas provocativas, como el electrochoque febril, auditivo, máximo, la hiperventilación, la privación del sueño y las convulsiones inducidas por drogas16,40,41,42,43. Este protocolo permitiría probar cualquiera de las medidas de provocación mencionadas anteriormente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen que este estudio fue apoyado por subvenciones de la Asociación Americana del Corazón, la Sociedad Americana de Epilepsia y el Departamento de Farmacología del Norte del Estado de SUNY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container PFIZER (HOSPIRA) 7983-09 Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle Sur-Vet SS-10L2025 Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges Fisher Scientific 22-415-469 Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce Kirkland 897971 Vehicle for oral medications
Computer Dell Optiplex 5040 Acquisition computer
E-4031 Tocris 1808 Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode RhythmLink RLSND116-2.5 13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode RhythmLink RLSP513 5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020) Swartz Center for Computational Neuroscience Open Access Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter Linksys USB3G16 Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution Med-Pharmex ANADA 200-280 Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding Generic N/A Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush Medline EMZ50051240 To maintain patency of angiocatheter
IR Light Bosch EX12LED-3BD-8W Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16) ADInstruments N/A ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge Smiths Medical 3060 Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5) MathWorks N/A Required to run EEGLAB
Microphone Sony Stereo ECM-D570P Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White 3M 1530-1 Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks Natus LC101-8 Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume) Sigma-Aldrich 88580 Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator Grass PS22 Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler 12Vwire.com LM-12-100-BLK Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator Grass Instruments BZA641035 Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe Generic N/A Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier Natus 13926 Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier Natus 22134 64-pin breakout box
Rabbit Restrainer Plas-Labs 501-TC Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster) Generic N/A Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip NONIN 61000 PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter NONIN 13931 XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output Sony SRG-X120 Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer Sur-Vet 13882 Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock Sur-Vet SRIP2V Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply Covidien 5110 To prepare ear vein before catheterization

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Bosinski, C., Wagner, K., Zhou, X., Liu, L., Auerbach, D. S. Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits. J. Vis. Exp. (169), e62256, doi:10.3791/62256 (2021).

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