Summary
该协议提供了一种简单、廉价的方法，可以形成细菌纤维素（BC）球体。这种生物材料可以作为固体材料的封装介质，包括生物炭、聚合物球体和矿废物。
Abstract
自BC作为一种新材料的普及以来，细菌纤维素（BC）球体的研究日益增多。该协议为 BC 球体生产提供了一种经济实惠且简单的方法。除了产生这些球体外，还确定了固体粒子的封装方法。生产BC球体，水，红茶，糖，醋和细菌培养物结合在一个困惑的烧瓶和内容是搅拌。在确定BC球体形成的适当培养条件后，使用生物炭、聚合物珠和矿废物测试了它们封装固体粒子的能力。球体的特点是使用图像J软件和热重度分析（TGA）。 结果表明，直径为7.5毫米的球体可在7天内制成。添加各种颗粒会增加 BC 胶囊的平均大小范围。球体封装了10-20%的干质量。此方法显示了低成本的球体生产和封装，这些生产和封装是很容易获得的材料所可能实现的。BC 球体将来可能用作污染物清除辅助工具、受控释放肥料涂层或土壤修正。
Introduction
细菌纤维素（BC）因其机械强度、高纯度和晶体、保水能力和复杂的纤维结构1、2、3、4而备受业界关注。这些特点使不列颠哥伦比亚省成为各种应用的有利生物材料，包括生物医学、食品加工和环境修复使用1。形成BC薄膜可以与单一的有机体文化或混合文化，如那些用于康布查5，发酵茶饮料。酿造康布查依赖于"细菌和酵母的共生文化"，俗称SCOBY。利用这种生物共生培养，采用类似的技术来创造BC球体。这种生物材料可用于帮助分离环境污染物和锚定农业修正，如生物炭，以实现更高效的作物生产。
以前的文献已经讨论了BC在激动的条件下产生的特点与BC在静止文化中产生的特点。静止培养物在液空气接口形成薄膜，而摇动培养物导致液体6中悬浮的不同 BC 粒子、链和球体。许多研究都提到BC的商业生产在动态条件下更可行的说法，为应用本文的方法提供了依据。此外，还对BC球体的结构和性质进行了各种调查。丰田章男等人6比较困惑和光滑的墙埃伦迈尔烧瓶在他们的激动BC生产。Hu 和 Catchmark4的一项研究确定了 BC 球体的确定条件，这些球体被用作当前 BC 球体生产过程的指南，其结果表明，球体大小在 60 小时后不会继续增加。穆罕默德等人对不列颠哥伦比亚省生产的回顾表明，动摇不列颠哥伦比亚省的文化甚至确保了氧气的供应和分配，这是不列颠哥伦比亚省成功增长所必需的。荷兰等8国利用X射线衍射和富利埃变异红外光谱法研究了不列颠哥伦比亚省的晶体和化学结构。据推测，BC胶囊将表现出类似的特征，未来的研究将研究结构特性。研究还探讨了利用BC生产改进的生物复合物的有益效果。研究人员以环氧树脂为基础，表明BC的加入可改善疲劳寿命、断裂韧性、拉伸和弯曲强度等物质特征。正如过去和目前的研究所表明的，许多人对不列颠哥伦比亚省的商业化使用感兴趣。
许多研究人员已经研究了受控释放系统中的细菌纤维素，这里描述的方法产生胶囊，可以用作受控释放系统。这项研究主要集中在生物医学领域的控制释放，以及控制释放肥料（CRF）管理方面的一些探索。根据不列颠哥伦比亚省控制释放阿莫西林11号、利多卡因12号和布洛芬13号的成功，BC可能表现出与其他物质类似的输送特征，如颗粒化肥料。沙维夫和米克尔森14日对CRF的概述承认，CRF的CRF比传统的施肥效率更高，节省劳动力，而且通常比常规肥料施用更不会造成环境退化。细菌纤维素可以作为CRF的有利封装材料。肥料可能会从不列颠哥伦比亚省的膜中渗出，或作为BC生物降解15，16排放。BC的高水膨胀能力也可以作为一个有益的土壤修正17，18，19，因为肥料养分和水分都可以通过应用BC球体释放到地面。有了这些特性，BC球体封装形成的CRF可能比其他在生产和处置阶段可能产生负面影响的肥料涂层材料具有优势。将 BC 调整为肥料涂层可能会进一步改进 CRF 技术。通过降低肥料释放率，作物将有足够的时间来吸收肥料，防止过量径流进入水体，从而减少富营养化和非氧体区。类似的缓释肥料已经准备和试验使用聚合物涂层20。
与先前研究中概述的协议不同，本协议侧重于均匀、有凝聚力的球体生产，而不是高纤维素产量。此外，BC封装其他固体已被研究与纤维素薄膜，但不是球体21。通过扩大对细菌纤维素球体的研究，可以采取进一步措施，以商业生产BC，这是有益的，因为BC的环境安全的特点。这种BC球体制造方法采用廉价、现成的烹饪成分。初始组装后，BC 球体在 2 天内开始形成，不受干扰。通过这种策略生产 BC 球体需要的空间很小，并且有一个可食用的副产品，发酵茶"康布查"。其他研究中提到的封装技术包括通过相反转技术22、23、矩阵形成24、喷干燥25形成的涂层，以及合成26期间的直接封装。本手稿中概述的直接封装方法对那些希望使用现成材料的简单、廉价过程的人来说是有用的。
通过这项研究，创建了一个成功的BC球体生产和封装协议。BC球体可以在其单独结构中封装生物炭、矿尾矿和聚苯乙烯微珠的固体颗粒。BC 虽然尚未在工业领域广泛使用，但它是一种实用、可持续制造的自然产生的材料，可用于未来的应用。
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Protocol
1. 细菌纤维素起动培养物的创造和维护
- 以SCOBY的形式获得细菌纤维素的起始培养，约50克。它可以以商业性（例如，从健康文化中购买）。将 SCOBY 放入 1 升烧嘴中，上面覆盖着纸巾。
- 煮沸700mL的除离子水，将其从含有SCOBY的容器转移到单独的容器中，并加入85克蔗糖。
- 蔗糖溶解后，加入2袋红茶（4.87克）。将茶浸泡1小时，然后用搅拌棒小心取出茶包。
- 在茶中加入200升蒸馏白醋。让混合物冷却到25°C。 冷却后，在含有 SCOBY 的烧杯中加入 700 mL 的室温茶。
注意：在太热时加入酸性茶可能会损害SCOBY中的生物体。 - 用纸巾盖住烧嘴，用弹性带固定烧嘴，并将烧嘴放在保持 25 °C 温度的存储区域。 该船通常被称为股票文化或酒店。
- 为了保持 SCOBY 的健康，每月大约需要维护 2 次。
- 用戴手套的手来抑制SCOBY垫子，将酒店的液体排入单独的烧嘴中。在与液体的容器中，加入足够的酸茶，共溶液为700mL。
- 用酸茶溶解容器中的65克蔗糖。在等待蔗糖溶解时，小心地在 DI 水中冲洗 SCOBY 垫。
- 蔗糖完全溶解后，液体可添加到含有冲洗的 SCOBY 垫的烧瓶中。盖住烧嘴，将其返回孵化区。
2. 细菌纤维素球体的生产
注意：在开水时要小心。确保玻璃器皿能够承受沸水温度，没有缺陷，尺寸合适。 图1中给出了描述BC球体生产的示意图。
- 用茶壶煮350mL的除离子水。将热水转移到 500 mL 烧嘴上。使用搅拌棒将 42.5 克颗粒状蔗糖溶解到热水中。
- 当蔗糖完全溶解时，在含有蔗糖和水的烧瓶中浸泡1袋红茶（2.54克），浸泡1小时。在此之后，用搅拌棒取出茶包，小心避免打开茶包，然后将其丢弃在垃圾桶中。
- 将100mL蒸馏白醋加入烧嘴中，然后彻底搅拌混合物。将 80 mL 的酸性茶混合物转移到 250 mL 的迷惑烧瓶中。让茶混合物冷却到室温，20 - 25 °C。
注意：此时，混合物可以留待冷却过夜或直到为下一步做好准备。 - 一旦液体温度达到室温（20 - 25 °C），在困惑的烧瓶中加入20 mL的微生物启动培养液。这种液体可以从斯科比酒店获得。用胶卷盖住烧瓶。
- 将困惑的烧瓶放在轨道摇动台上，并将速度设定为每分钟 125 次旋转（rpm）。允许混合物在温度在 20 - 25 °C 的室内或孵化器中摇动 3 天，以产生 BC 球体。
注意：如果烧瓶内形成不规则形状，或者纤维素团块粘在烧瓶壁上，应将其移除，以防止进一步形成不规则的 BC 质量。使用钳子去除不需要的BC质量，包括细弦、环、管状形状和其他明显非球形的形状。 - 球体形成后，轻轻地从烧瓶中倒出，以本文未概述的方式分析、处理或使用它们。
3. 使用细菌纤维素球体封装颗粒或污染物
- 按照上述 步骤 2.1-2.5 操作。
- 摇晃3天后，在令人费解的烧瓶中加入约0.01克细磨碎颗粒物。适当的固体包括生物炭（260±140微米）、矿废料（350±140微米）和聚苯乙烯微珠（3微米）。这些材料的数据在 代表结果 部分中概述。请参阅随附 的材料表 ，进一步描述生物炭、矿废和微珠。
- 再次用护膜盖住烧瓶，并将其放回轨道摇床，使用相同的速度和环境温度（20 - 25 °C）再放置3天。删除 BC 封装粒子以进行分析、处置或其他用途。
图1。细菌纤维素球体的制造和固体颗粒的封装。 第 1 步涉及将细菌库存培养与红茶、糖和醋介质在一个困惑的烧瓶中结合。股票文化中的磁盘代表因为垫。然后，将困惑的烧瓶放在轨道摇动台上3天。中间步骤显示，一旦形成 BC 球体，固体就会被添加到烧瓶中。烧瓶又摇了3天。在最后一步，BC球体的大小继续增加，并封装了固体粒子。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Representative Results
BC球体在前48小时文化中增长最快（图2）。图2还显示了球体如何倾向于达到最大平均大小，然后保持恒定。在这个实验中，球体的平均直径达到7.5±0.2毫米。虽然BC球体在10天的生长期内从未完全恶化，但它们确实开始形成肌腱，在第八天左右从球体的主体延伸开来。这可以在图2E中看到，最明显的是在左上部的大球体上。
应用本文概述的封装方法，平均产生57个±4个直径从3毫米到12毫米的细菌纤维素球体（图3）。图3中还可以看到，在BC球体中加入固体对球体大小或频率没有一致的影响。轨道震动速度、环境温度和不规则粒子的形成似乎是影响球形粒子形状、大小和频率的主要因素。图4显示，过高的室温和不规则质量的不当去除，如何能够将BC从完好的球体（图4B）转变为恒星颗粒（图4A）或细小的团块（图4C）。
为了确定 BC 球体中封装固体的分数，对 BC 的四个不同的样本进行了热重测量分析。测试的四个样本是不列颠哥伦比亚省，不列颠哥伦比亚省与生物炭，BC与聚苯乙烯微珠，和BC与矿山废物。 图5 显示了单个样本在暴露于氮气高温下的行为。从代表球体的虚线可以看出，18.7%的样品是按重量分列的矿废物，从而揭示了成功的封装。虚线显示，14.5%的样本含有生物炭。这些百分比是通过从添加固体的样品的质量百分比中减去纯 BC 质量百分比来计算的。因为BC和聚苯乙烯在类似的温度下分解，衍生质量曲线被分解，以分离聚合物的分解和纤维素的分解（图6）。这一分析表明，该样本中13%的质量损失与聚苯乙烯的热降解相对应。由于整齐聚苯乙烯的热降解导致质量损失约100%27，估计所有13%的质量的样品对应于封装聚苯乙烯珠。 图7 显示蓝色聚苯乙烯微珠溶液产生蓝色BC（图7D）。这些干燥的，因为质量是用于TGA的样品。
图2。细菌纤维素生长。（A）细菌纤维素胶囊的直径：细菌纤维素胶囊的照片在 （B） 1 天， （C） 3 天，（D），7 天， 和 （E）10 天。细菌纤维素生长在20 -25°C的轨道摇床在125转/分钟的令人费解的Erlenmeyer烧瓶中。细菌纤维素球体的图像是用凝胶文档XR拍摄的，并且使用图像J进行大小分析。面板 A 中的数据表示为平均值，错误条表示标准偏差（n ≥ 8）。比例栏表示 10 mm。请单击此处查看此图的较大版本。
图3。胶囊大小分布在7天。 没有添加固体：（B） 生物炭：（C） 塑料微珠：和（D） 固体矿废料。细菌纤维素生长在20-25°C的温度范围在一个困惑的Erlenmeyer烧瓶在轨道摇床在145 rpm。增长介质包含 0.0101-0.0114% 添加剂。细菌纤维素球体的图像是用凝胶文档XR拍摄的，并且使用图像J进行大小分析。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4。次优实验的可能结果。 （A） 细菌纤维素在30°C和140转/米时形成的恒星颗粒：（B） 因为球形球形成于20-25°C和125转/米：和 （C） BC 球形成于 20 - 25 °C 和 140 rpm 时，不规则的形状不会从烧瓶中去除，因为它们形成。黑白图像是用凝胶文档 XR 拍摄的，彩色照片是用 Surface Pro 拍摄的。所有图像都使用 ImageJ 进行分析， 所有比例栏代表 10 毫米。 请单击此处查看此图的更大版本。
图5。封装固体的分数。（A） 胶囊的热重度痕迹：与 （B） 没有添加固体：（C） 生物炭：（D） 塑料微珠：和（E） 矿山废物。在TGA之前，样品在纸巾上干燥3天，以去除多余的水。在氮气中加热坡道为4°C/min至800°C进行热重度分析。细菌纤维素球体的图像是用凝胶文档XR拍摄的。红色箭头指向封装的固体粒子。比例栏表示 10 mm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6。通过比较（A） BC 与聚苯乙烯微珠和（B）普通 BC 的微分 TGA 轮廓来确定封装的质量百分比。平原BC的微分TGA轮廓可以安装四个高斯曲线，出现在几乎相同的幅度在BC与聚苯乙烯珠。然而，围绕聚苯乙烯分解温度的第五个峰值（以红色显示）也出现在后者中。这个峰值被归因于与聚苯乙烯珠相关的热分解。下面的面积，13%，相当于与聚苯乙烯相关的质量损失百分比。请单击此处查看此图的较大版本。
图7。因为样品在有盖的培养皿中的纸巾上干燥。 （A） 和 （B） 普通细菌纤维素：（C） 因为与生物炭：（D） 因为有塑料微珠：和（E） 因为与矿山废物。图像是使用 Surface Pro 拍摄的，并使用图像J进行分析。比例栏表示 1 厘米。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本协议概述了 BC 球体的生产和封装方法，这些方法易于操作且具有成本效益。通过对原始协议的各种调整，确定了一个适当的程序。必须采取关键步骤，以确保有生存能力的领域。BC 形成中涉及的所有成分在球体的健康和耐用性中起着关键作用。蔗糖为生物提供饲料，茶提供氮气，醋将pH到最佳条件，以防止不必要的污染物28。此方法的另一个重要变量是温度。茶必须冷却到室温（约25°C），然后再添加微生物启动培养。如果生物体暴露在高温下，BC球体生长可能会受到抑制。烧瓶摇晃的房间温度也影响球体生长3，28，29。在室温超过 30 °C 时摇晃会导致不规则的 BC 形状形成 （图 4A）。在封装过程中，关键步骤是允许 BC 球体在添加固体颗粒之前形成。这是因为观察到，烧瓶中存在异物会抑制不列颠哥伦比亚省的生长。
不同的文化条件影响BC球体生产的成功，正如胡和Catchmark4所示。因为在轨道震动台上最困惑的烧瓶中形成。与光滑的壁烧瓶6相比，挡板的存在加速了球体的发育。传统的用磁条搅拌可防止球体形成。此外，微生物起动培养和茶混合物的不同比例影响了球体的生成和丰度。最初，3 mL 的起动机培养（2.10 质量百分比的解决方案）被添加到 140 mL 的茶介质中。经过持续试验，微生物启动培养量增加，同时减少茶媒体的体积。最终使用量为20mL的微生物启动培养（20质量%）和80mL的茶混合物。对于旋转速度，BC 球体形成在低于 100 rpm 的速度下摇动时并不成功。速度为125，140和150 rpm产生球体，但在球体大小，数量和形状上有差异，如先前报道的6，29。
作为一个BC形成过程，激动的文化比静态文化更可取，如前所述2。与其他研究中解释的方法相比，这一方法不那么复杂，材料也更少。其他文献提到准备公元前的股票文化，首先发酵静态或搅拌介质，然后收获BC细胞接种的主要文化3，4，6，28，29，30。一些细胞采集方法包括剧烈摇晃，然后过滤30，混合然后过滤4，离心3，29。这种生产过程中所包含的BC细胞始终在微生物启动培养容器中可用，因此无需采集细胞。此外，通过为现有文献贡献另一种BC球体形成方法，商业BC的使用更容易实现。这是有益的，因为不列颠哥伦比亚省的环保材料属性29，31。
虽然不列颠哥伦比亚省是一个有趣和潜在的有价值的生物材料，但正如先前的研究表明的18，32，它的广泛使用仍然面临挑战。在这种方法中，存在与 BC 球体大小和形状不一致的情况。管状和链状结构有时在媒体2，18，32中形成。不列颠哥伦比亚省还粘在烧瓶的墙壁上，形成有时悬浮在液体中的环，应去除，以防止形成进一步的不规则。虽然统一的球体能够进行一致的科学分析，但某些工业用途可能不需要它们。另一个挑战是文化时间，最短持续时间至少为2天。为了克服等待期，制造商可以分批生产球体或连续流动反应堆，以稳定地供应BC球体。即使面临这些挑战，BC球体也提出了一种有趣的方法，用于可持续地生产细菌纤维素，并能够在BC矩阵中封装各种材料。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作是蒙大拿州技术研究助理导师项目由阿道夫·马丁内斯，凯瑟琳·穆赫兰，泰勒·萨默维尔和劳雷尔·比特曼的延续。研究由国家科学基金会根据第1号赠款赞助。OIA-1757351和作战能力发展指挥部陆军研究实验室（合作协议编号W911NF-15-2-0020）。本材料中表达的任何意见、发现和结论或建议均为作者的意见、发现和结论，并不一定反映国家科学基金会或陆军研究实验室的观点。我们还要感谢艾米·昆齐、李·理查兹、凯特琳·艾利、克里斯·加蒙斯、马克斯·沃尔根南特和克里斯·博世的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL graduated cylinder | |||
| 1000 mL beaker | |||
| 25 mL graduated cylinder | |||
| 250 mL Erlenmeyer baffled flask | Chemglass | CLS-2040-02 | |
| 500 mL beaker | |||
| Balance | |||
| Biochar | Ponderosa pine heat treated under argon gas, heated at 15 °C per minute to 800 °C | ||
| Black tea | |||
| Deionized water | |||
| Distilled white vinegar | |||
| Elastic band | |||
| Microbial starter culture | Cultures for Health | ||
| Mine waste | Collected from Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mine waste contains soil and metals originating from past copper mining. Mn, Si, Ca, Al, and Fe were the five most prevalent elements measured in the mine waste through x-ray diffraction. | ||
| Mortar and pestle | |||
| Orbital shaker | Used various brands | ||
| Paper towel | |||
| Polystyrene microbeads | Polybead | 17138 | 3 micron diameter |
| Stir rod | |||
| Sucrose | |||
| Tea kettle | |||
| TGA | TA Instruments | TA Q500 | 400 °C/min to 800 °C, 100 mL/min N2 |
| Thermometer | |||
| XRF Analyzer | ThermoFisher Scientific | 10131166 |
References
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