Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة سهلة وغير مكلفة لتشكيل كرات السليلوز البكتيرية (BC). يمكن أن تعمل هذه المادة الحيوية كوسيط تغليف للمواد الصلبة ، بما في ذلك الشحن الحيوي ، ومجالات البوليمر ، ونفايات المناجم.
Abstract
وقد تم بحث مجالات السليلوز البكتيرية (قبل الميلاد) بشكل متزايد منذ تعميم قبل الميلاد كمادة جديدة. يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وبأسعار معقولة لإنتاج المجال قبل الميلاد. وبالإضافة إلى إنتاج هذه المجالات، تم أيضا تحديد طريقة لتغليف الجسيمات الصلبة. لإنتاج مجالات قبل الميلاد، يتم الجمع بين الماء والشاي الأسود والسكر والخل والثقافة البكتيرية في قارورة حائرة ومحتويات هي هياج. بعد تحديد ظروف الثقافة المناسبة لتشكيل الكرة قبل الميلاد ، تم اختبار قدرتها على تغليف الجسيمات الصلبة باستخدام الفحم الحيوي ، حبات البوليمر ، ونفايات المناجم. وتميزت المجالات باستخدام برنامج ImageJ والتحليل الحراري gravimetric (TGA). تشير النتائج إلى أن المجالات ذات أقطار 7.5 مم يمكن صنعها في 7 أيام. إضافة جزيئات مختلفة يزيد من متوسط نطاق حجم كبسولات BC. المجالات مغلفة 10 -20٪ من كتلتها الجافة. تظهر هذه الطريقة إنتاج المجال منخفض التكلفة والتغليف الممكن باستخدام مواد يمكن الحصول عليها بسهولة. يمكن استخدام مجالات BC في المستقبل كمساعد لإزالة الملوثات ، أو طلاء الأسمدة الخاضع للرقابة ، أو تعديل التربة.
Introduction
وقد لوحظ السليلوز البكتيري (قبل الميلاد) لاستخدامه الصناعة المحتملة نظرا لقوتها الميكانيكية، والنقاء العالي والبلورة، وقدرات الاحتفاظ بالماء، وهيكل الأليافالمعقدة 1،2،3،4. هذه الخصائص تجعل قبل الميلاد مادة حيوية مواتية لمجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك الطب الحيوي، وتجهيز الأغذية، والمعالجة البيئية يستخدم1. تشكيل فيلم قبل الميلاد يمكن القيام به مع الثقافات كائن حي واحد أو الثقافات المختلطة مثل تلك المستخدمة لكومبوتشا5، مشروب الشاي المخمرة. تختمر kombucha يعتمد على "ثقافة التكافل من البكتيريا والخميرة"، والمعروفة باسم سكوبي. باستخدام هذه الثقافة التكافلية للكائنات الحية ، يتم استخدام تقنية مماثلة لإنشاء مجالات BC. ويمكن استخدام هذه المادة الحيوية للمساعدة في عزل الملوثات البيئية وتثبيت التعديلات الزراعية مثل الفحم الحيوي لتحقيق إنتاج المحاصيل بشكل أكثر كفاءة.
وقد ناقش الأدب السابق كيف أن خصائص BC المنتجة في ظروف مهتاجة تقارن ب BC المنتجة في ثقافة ثابتة. ينتج عن الثقافة الثابتة فيلم يتشكل في واجهة الهواء السائل ، في حين أن الثقافة المهزوزة تؤدي إلى جزيئات وخيوط ومجالات مختلفة قبل الميلاد معلقة داخل السائل6. وقد أشارت العديد من الدراسات إلى الادعاء بأن الإنتاج التجاري من قبل الميلاد هو أكثر جدوى في الظروف الديناميكية6،7، وتوفير الأساس المنطقي لتطبيق طريقة هذه الورقة. وبالإضافة إلى ذلك، أجريت تحقيقات مختلفة بشأن هيكل وخصائص مجالات كولومبيا البريطانية. Toyosaki وآخرون6 مقارنة حيرة وسلس الجدران قارورة Erlenmeyer في إنتاجها قبل الميلاد المهتاج. حددت دراسة أجراها هو و Catchmark4 الشروط لمجالات BC التي تم استخدامها كإرشادات لعملية إنتاج الكرة الحالية قبل الميلاد ، وتشير نتائجها إلى أن حجم الكرة لا يستمر في الزيادة بعد 60 ساعة. ويشير استعراض إنتاج BC من قبل محمد وآخرون1 إلى أن هز ثقافة BC يضمن حتى إمدادات الأوكسجين وتوزيعه، وهو أمر ضروري لنمو BC ناجحة. هولندا وآخرون8 وقد درس البلورة والبنية الكيميائية من قبل الميلاد باستخدام الحيود الأشعة السينية وفورييه تحويل الطيف الأشعة تحت الحمراء. ومن المفترض أن كبسولات BC سوف تظهر خصائص مماثلة والبحوث المستقبلية سوف تحقق في الخصائص الهيكلية. كما استكشفت الدراسات الآثار المفيدة لاستخدام BC لإنتاج الكومبيوات الحيوية المحسنة. باستخدام الايبوكسي الراتنج كقاعدة، وقد أظهرت الباحثين أن إضافة قبل الميلاد يحسن الخصائص المادية مثل الحياة التعب، وصلابة الكسر، وقوة الشد والانثناء9،10. كما هو مبين في البحوث السابقة والحالية ، وكثير من المهتمين في تسويق استخدام قبل الميلاد.
وقد حقق العديد من الباحثين السليلوز البكتيري في أنظمة الإفراج التي تسيطر عليها، والأسلوب الموصوف هنا يولد كبسولات التي يمكن استخدامها كأنظمة الإفراج التي تسيطر عليها. يركز الكثير من هذه الأبحاث على الإطلاق الخاضع للرقابة في مجال الطب الحيوي ، بالإضافة إلى بعض الاستكشاف في إدارة الأسمدة المتحكم فيها (CRF). استنادا إلى نجاح إطلاق BC الخاضعة للرقابة من أموكسيسيلين11، ليدوكائين12، و ايبوبروفين13، قبل الميلاد قد تظهر خصائص التسليم مماثلة مع مواد أخرى ، مثل الأسمدة بيليه. نظرة عامة على CRF من Shaviv وMikkelsen14 يعترف بأن CRF هي أكثر كفاءة ، وتوفير العمالة ، وتسبب عموما تدهورا بيئيا أقل من استخدام الأسمدة التقليدية. السليلوز البكتيري قد تعمل كمادة تغليف مواتية لCRF. قد تتسرب الأسمدة من أغشية BC أو التفريغ كماتحلل بيولوجيا قبل الميلاد15،16. BC قدرة تورم المياه العالية يمكن أيضا أن تكون بمثابة تعديل التربةمفيدة 17،18،19 لأن كل من المواد المغذية والأسمدة والرطوبة قد تطلق في الأرض من خلال تطبيق مجالات قبل الميلاد. مع هذه الصفات، قد يكون CRF التي شكلتها تغليف الكرة قبل الميلاد ميزة على غيرها من مواد طلاء الأسمدة التي يمكن أن يكون لها آثار سلبية خلال مراحل الإنتاج والتخلص منها. قد يؤدي تكييف BC إلى طلاء الأسمدة إلى زيادة تحسين تقنيات CRF. ومن خلال خفض معدل إطلاق الأسمدة، سيكون لدى المحاصيل الوقت الكافي لامتصاص الأسمدة ومنع الجريان السطحي الزائد في المسطحات المائية، وبالتالي الحد من التمغذيات والمناطق غير المتجانسة. وقد تم إعداد الأسمدة بطيئة الإفراج مماثلة وتجريبها باستخدام الطلاء البوليمر20.
على عكس البروتوكولات المبينة في البحوث السابقة، وهذا واحد يركز على إنتاج مجال موحد ومتماسك بدلا من غلة السليلوز عالية. وعلاوة على ذلك، تمت دراسة تغليف قبل الميلاد من المواد الصلبة الأخرى مع أفلام السليلوز، ولكن ليس المجالات21. من خلال توسيع نطاق البحث على مجالات السليلوز البكتيرية ، يمكن اتخاذ المزيد من الخطوات لإنتاج BC تجاريا ، وهو أمر مفيد بسبب ميزات BC الآمنة بيئيا. هذه الطريقة من تصنيع المجال قبل الميلاد يستخدم غير مكلفة، والمكونات المتاحة بسهولة الطهي. بعد التجميع الأولي ، تبدأ مجالات BC في التشكل في غضون يومين دون تدخل. إنتاج مجالات قبل الميلاد من خلال هذه الاستراتيجية يتطلب مساحة صغيرة ولديه منتج ثانوي صالح للأكل، والشاي المخمرة 'kombucha'. تقنيات التغليف المذكورة في دراسات أخرى تشمل الطلاء التي تشكلت من خلال تقنية انعكاس المرحلة22،23، تشكيل مصفوفة24، رذاذالتجفيف 25، والتغليف المباشر أثناء التوليف26. طريقة التغليف المباشر المبينة في هذه المخطوطة مفيدة لأولئك الذين يرغبون في عملية سهلة وغير مكلفة تستخدم المواد المتاحة بسهولة.
من خلال هذا البحث، تم إنشاء بروتوكول ناجح لإنتاج الكرة قبل الميلاد والتغليف. يمكن أن تغلف مجالات BC الجسيمات الصلبة من الفحم الحيوي ومخلفات المناجم والميكروبات البوليسترين داخل هياكلها الفردية. على الرغم من عدم استخدامها على نطاق واسع في الصناعة حتى الآن ، فإن BC هي مادة عملية ومستدامة وناطعة يمكن استخدامها للتطبيقات المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنشاء وصيانة البكتيريا السليلوز بداية الثقافة
- الحصول على ثقافة بداية من السليلوز البكتيري، ما يقرب من 50 غرام، في شكل سكوبي. ويمكن شراؤها تجاريا (على سبيل المثال، من الثقافات من أجل الصحة). ضع سكوبي في كوب 1 L، مغطى بمنشفة ورقية.
- يغلي 700 مل من الماء المتأين، ونقله إلى وعاء منفصل عن تلك التي تحتوي على سكوبي، وإضافة 85 غرام من السكروز.
- بمجرد أن يذوب السكروز، أضف كيسين من الشاي الأسود (4.87 غرام). حاد الشاي لمدة 1 ساعة، ثم إزالة بعناية أكياس الشاي باستخدام قضيب اثارة.
- أضف 200 مل من الخل الأبيض المقطر إلى الشاي. يترك الخليط ليبرد إلى 25 درجة مئوية. مرة واحدة تبريد، إضافة 700 مل من الشاي درجة حرارة الغرفة إلى الكأس التي تحتوي على سكوبي.
تنبيه: إضافة الشاي الحمضي في حين أنه حار جدا قد يضر الكائنات الحية في سكوبي. - قم بتغطية الكأس بمنشفة ورقية وتأمينها بشريط مرن، وضع الكأس في منطقة تخزين تحافظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية. يشار إلى هذه السفينة عادة باسم ثقافة المخزون أو الفندق.
- للحفاظ على صحة SCOBY ، يلزم الصيانة حوالي مرتين في الشهر.
- باستخدام الأيدي القفازة لكبح الحصير SCOBY، واستنزاف السائل من الفندق إلى كوب منفصل. في الحاوية مع السائل، إضافة ما يكفي من الشاي الحمضية لما مجموعه 700 مل من الحل.
- حل 65 غرام من السكروز في الحاوية مع الشاي الحمضية. في انتظار السكروز لتذوب، شطف بعناية الحصير سكوبي في الماء DI.
- بمجرد أن يذوب السكروز بالكامل ، يمكن إضافة السائل إلى الكأس الذي يحتوي على حصائر SCOBY المشطفة. قم بتغطية الكأس وإعادته إلى منطقة الحضانة.
2. إنتاج كرات السليلوز البكتيرية
ملاحظة: توخي الحذر عند العمل مع الماء المغلي. تأكد من أن الأواني الزجاجية يمكن أن تصمد أمام درجات حرارة الماء المغلي، وخالية من العيوب، والحجم المناسب. ويرد مخطط يصف إنتاج مجالات BC في الشكل 1.
- يغلي 350 مل من الماء deionized باستخدام غلاية الشاي. نقل الماء الساخن إلى كوب 500 مل. حل 42.5 غرام من السكروز الحبيبات في الماء الساخن باستخدام قضيب اثارة.
- عندما يذوب السكروز بالكامل، حاد 1 كيس من الشاي الأسود (2.54 غرام) في قارورة تحتوي على السكروز والماء لمدة 1 ساعة. بعد ذلك، قم بإزالة كيس الشاي بقضيب تحريك، مع الحرص على تجنب كسر كيس الشاي، ومن ثم التخلص منه في سلة المهملات.
- أضف 100 مل من الخل الأبيض المقطر إلى الكأس، ثم يحرك الخليط جيدا. نقل 80 مل من خليط الشاي الحمضية إلى قارورة حيرة 250 مل. السماح لخليط الشاي لتبرد لدرجة حرارة الغرفة، 20-25 درجة مئوية.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن ترك الخليط ليبرد بين عشية وضحاها أو حتى يتم إعداده للخطوة التالية. - بمجرد أن تكون درجة الحرارة السائلة في درجة حرارة الغرفة (20 - 25 درجة مئوية) ، أضف 20 مل من سائل ثقافة المبتدئين الميكروبي إلى القارورة المحيرة. يمكن الحصول على هذا السائل من فندق SCOBY. تغطية قارورة مع البارافيلم.
- ضع القارورة المحيرة على طاولة اهتزاز مدارية وحدد السرعة إلى 125 دوران في الدقيقة (دورة في الدقيقة). السماح للخليط يهز لمدة 3 أيام في غرفة أو حاضنة مع درجة حرارة من 20 -25 درجة مئوية لإنتاج المجالات قبل الميلاد.
ملاحظة: إذا الأشكال غير النظامية شكل في محتويات قارورة أو إذا كتل السليلوز عصا إلى جدران القارورة، ينبغي إزالتها لمنع مزيد من الجماهير BC غير النظامية من تشكيل. استخدم الملاقط لإزالة كتل BC غير المرغوب فيها، بما في ذلك السلاسل الرقيقة والحلقات والأشكال الأنبوبية والأشكال الأخرى غير الكروية بوضوح. - بمجرد تشكيل المجالات ، صبها بلطف من القارورة وتحليلها أو التخلص منها أو استخدامها بطريقة غير موضحة في هذه الورقة.
3. استخدام كرات السليلوز البكتيرية لتغليف الجسيمات أو الملوثات
- اتبع الخطوات 2.1-2.5 أعلاه.
- بعد اهتزاز لمدة 3 أيام، إضافة حوالي 0.01 غرام من الجسيمات الأرضية بدقة إلى قارورة حائرة. وتشمل المواد الصلبة المناسبة الشحن الحيوي (260 ± 140 ميكرومتر)، ونفايات المناجم (350 ± 140 ميكرومتر)، والميكروبات البوليسترين (3 ميكرومتر). وترد بيانات هذه المواد في قسم النتائج التمثيلية. يرجى الاطلاع على جدول المواد المرفق لمزيد من الأوصاف للشار الحيوي ونفايات المناجم والميكروبات.
- تغطية القارورة مرة أخرى مع parafilm ووضعه مرة أخرى على شاكر المدارية، وذلك باستخدام نفس السرعة ودرجة الحرارة المحيطة (20 -25 درجة مئوية) لمدة 3 أيام أخرى. إزالة الجسيمات المغلفة قبل الميلاد للتحليل أو التخلص منها أو استخدامات أخرى.
الشكل 1. بكتيريا السليلوز المجال تلفيق وتغليف الجسيمات الصلبة. الخطوة 1 ينطوي على الجمع بين ثقافة الأسهم البكتيرية مع الشاي الأسود والسكر والخل وسائل الإعلام في قارورة حائرة. تمثل الأقراص الموجودة في ثقافة المخزون الحصير BC. ثم، يتم وضع قارورة حائرة على طاولة اهتزاز المداري لمدة 3 أيام. تظهر الخطوة الوسطى المواد الصلبة التي يتم إضافتها إلى القارورة بمجرد تشكيل كرات BC. اهتزت القارورة لمدة 3 أيام أخرى. في الخطوة الأخيرة ، واصلت مجالات BC زيادة حجمها وتغليف الجسيمات الصلبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المجالات قبل الميلاد لديها أسرع معدل نمو خلال أول 48 ساعة من الثقافة (الشكل 2). ويبين الشكل 2 أيضا كيف تميل المجالات إلى بلوغ متوسط أقصى للحجم ثم تظل ثابتة. في هذه التجربة، وصلت المجالات إلى متوسط قطر 7.5 ± 0.2 ملم. على الرغم من أن المجالات قبل الميلاد لم تتدهور تماما خلال فترة النمو 10 يوما، فإنها لم تبدأ في تشكيل tendrils التي تمتد قبالة الجسم الرئيسي للمجال حول اليوم الثامن. ويمكن رؤية ذلك في الشكل 2E، وبشكل ملحوظ على الكرة الكبيرة في أعلى اليسار.
تطبيق طريقة التغليف المبينة في هذه الورقة يؤدي في المتوسط 57 ± 4 مجالات السليلوز البكتيرية تتراوح في القطر من 3 إلى 12 ملم(الشكل 3). ويمكن أيضا أن نرى في الشكل 3 أن إضافة المواد الصلبة إلى المجالات قبل الميلاد ليس له تأثير ثابت على حجم الكرة أو التردد. ويبدو أن سرعة الهز المدارية، ودرجة الحرارة المحيطة، وتشكيل الجسيمات غير المنتظمة هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على شكل الجسيمات الكروية وحجمها وتكرارها. يوضح الشكل 4 كيف يمكن أن يؤدي الارتفاع الشديد لدرجة حرارة الغرفة والإزالة غير السليمة للجماهير غير المنتظمة إلى تغيير BC من كرة سليمة(الشكل 4B)إلى الجسيمات النجمية(الشكل 4A)أو الكتل الوترية(الشكل 4C).
لتحديد جزء من المواد الصلبة المغلفة في مجالات BC ، تم إجراء تحليل حراري للجاذبية على أربع عينات مختلفة من BC. وكانت العينات الأربع التي تم اختبارها قبل الميلاد، قبل الميلاد مع biochar، قبل الميلاد مع الميكروبات البوليسترين، وقبل الميلاد مع نفايات المناجم. ويبين الشكل 5 كيف تصرفت العينات الفردية عندما تعرضت لدرجة حرارة عالية في غاز النيتروجين. ويمكن رؤية من خط متقطع يمثل المجالات قبل الميلاد مع نفايات المناجم أن 18.7٪ من تلك العينة كانت نفايات المناجم من حيث الوزن، مما يكشف عن تغليف ناجح. ويبين الخط المنقط أن 14.5 في المائة من تلك العينة تحتوي على شحن حيوي. تم حساب هذه النسب المئوية عن طريق طرح الكتلة العادية قبل الميلاد من النسبة المئوية للكتلة من العينات ذات المواد الصلبة المضافة. لأن BC والبوليسترين تتحلل في درجات حرارة مماثلة، تم تفكيك منحنيات كتلة مشتقة لفصل تحلل البوليمر من أن من السليلوز(الشكل 6). ويبين هذا التحليل أن 13٪ من فقدان الكتلة في هذه العينة يتوافق مع التدهور الحراري للبوليسترين. لأن التدهور الحراري للبوليسترين أنيق يؤدي إلى فقدان كتلة من حوالي 100٪27،ويقدر أن جميع 13٪ من كتلة العينة يتوافق مع حبات البوليسترين مغلفة. ويبين الشكل 7 أن محلول الميكروبات البوليسترين الأزرق أدى إلى الأزرق قبل الميلاد(الشكل 7D). هذه الكتل BC المجففة هي العينات التي استخدمت ل TGA.
الشكل 2. نمو السليلوز البكتيري. (أ) قطر كبسولات السليلوز البكتيرية مع مرور الوقت؛ صور من كبسولات السليلوز البكتيرية في (ب) 1 يوم، (ج) 3 أيام، (D)، 7 أيام، و (ه) 10 أيام. نمت السليلوز البكتيرية في 20 -25 درجة مئوية في قارورة إرلينماير حائرة على شاكر المدارية في 125 دورة في الدقيقة. تم التقاط صور لمجالات السليلوز البكتيرية باستخدام جل دوك XR وتم إجراء تحليل الحجم باستخدام ImageJ. يتم تمثيل البيانات في اللوحة A على أنها متوسطة مع أشرطة الخطأ التي تشير إلى الانحراف المعياري (n ≥ 8). تمثل أشرطة المقياس 10 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. حجم توزيع الكبسولات في 7 أيام. مع (أ) لا المواد الصلبة المضافة; (ب) الشحن الحيوي؛ (ج) الميكروبات البلاستيكية؛ و (د) نفايات المناجم الصلبة. نمت السليلوز البكتيري في درجات حرارة تتراوح بين 20-25 درجة مئوية في قارورة إرلينماير حائرة على شاكر المدارية في 145 دورة في الدقيقة. تحتوي وسائط النمو على إضافات بنسبة 0.0101-0.0114٪. تم التقاط صور لمجالات السليلوز البكتيرية باستخدام جل دوك XR وتم إجراء تحليل الحجم باستخدام ImageJ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. النتائج المحتملة من التجارب دون المستوى الأمثل. (أ)جزيئات السليلوز البكتيرية التي تشكلت عند 30 درجة مئوية و 140 دورة في الدقيقة؛ (ب)الجرم السماوي الكروي قبل الميلاد التي شكلت في 20 -25 درجة مئوية و 125 دورة في الدقيقة؛ و (C) قبل الميلاد الكريات شكلت في 20 -25 درجة مئوية و 140 دورة في الدقيقة عندما لا تتم إزالة الأشكال غير النظامية من قارورة لأنها تشكل. تم التقاط صور بالأبيض والأسود مع جل دوك XR وتم التقاط الصورة الملونة مع Surface Pro. تم تحليل جميع الصور باستخدام ImageJ وجميع أشرطة المقياس تمثل 10 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. جزء من المواد الصلبة المغلفة. (أ) آثار gravimetric الحرارية من كبسولات؛ مع (ب) لا المواد الصلبة المضافة; (ج) الشحن الحيوي؛ (د) الميكروبات البلاستيكية؛ و (ه) نفايات المناجم. قبل TGA، تم تجفيف العينات على منشفة ورقية لمدة 3 أيام لإزالة المياه الزائدة. وأجريت تحليلات الجاذبية الحرارية مع منحدر التدفئة من 4 درجة مئوية / دقيقة إلى 800 درجة مئوية في غاز النيتروجين. تم التقاط صور لمجالات السليلوز البكتيرية مع جل دوك XR. تشير الأسهم الحمراء إلى جزيئات صلبة مغلفة. تمثل أشرطة المقياس 10 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. الكتلة في المئة من التغليف كما هو محدد بالمقارنة مع ملامح TGA التفاضلية من (A) قبل الميلاد مع الميكروبات البوليسترين و (ب) عادي قبل الميلاد. يمكن تركيب ملف تعريف TGA التفاضلي ل BC العادي مع أربعة منحنيات غاوسية تظهر في مقادير متطابقة تقريبا في BC مع حبات البوليسترين. ومع ذلك ، تظهر ذروة خامسة (موضحة باللون الأحمر) تتمحور حول درجة حرارة تحلل البوليسترين أيضا في الأخير. وقد عزي هذا الذروة إلى التحلل الحراري المرتبطة حبات البوليسترين. المنطقة تحت, 13٪, يتوافق مع فقدان الكتلة في المئة المرتبطة البوليسترين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. قبل الميلاد عينات التجفيف على منشفة ورقية في طبق بتري مغطاة. (أ) و (ب) السليلوز البكتيرية عادي; (ج) قبل الميلاد مع biochar؛ (د) قبل الميلاد مع الميكروبات البلاستيكية. و (E) قبل الميلاد مع نفايات المناجم. تم التقاط الصورة باستخدام Surface Pro وتحليلها باستخدام ImageJ. يمثل شريط المقياس 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحدد هذا البروتوكول أساليب إنتاج وتغليف المجال قبل الميلاد التي يسهل تنفيذها وفعالة من حيث التكلفة. ومن خلال التعديلات المختلفة التي أدخلت على البروتوكول الأصلي، تم تحديد عملية ملائمة. ويجب اتخاذ خطوات حاسمة لضمان وجود مجالات قابلة للحياة. جميع المكونات المشاركة في تشكيل قبل الميلاد تلعب دورا رئيسيا في صحة ومتانة المجالات. السكروز يغذي الكائنات الحية، والشاي يوفر النيتروجين، والخل يخفض درجة الحموضة إلى الظروف المثلى لمنع الملوثات غير المرغوب فيها28. متغير آخر مهم في هذه الطريقة هو درجة الحرارة. يجب تبريد الشاي إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 25 درجة مئوية) قبل إضافة ثقافة المبتدئين الميكروبية. إذا تعرضت الكائنات الحية لدرجات حرارة عالية ، فقد يتم تثبيط نمو الكرة قبل الميلاد. درجة حرارة الغرفة التي تهتز فيها القارورة تؤثر أيضا على نمو الكرة3،28،29. الهز في درجات حرارة الغرفة أكثر من 30 درجة مئوية يسبب الأشكال BC غير النظامية لتشكيل (الشكل 4A). في عملية التغليف ، وخطوة رئيسية هي السماح للمجالات قبل الميلاد لتشكيل قبل إضافة جزيئات صلبة. ويرجع ذلك إلى ملاحظة أن وجود أجسام غريبة في القارورة أعاق نمو BC.
تؤثر الظروف الثقافية المختلفة على نجاح إنتاج كرة BC ، كما هو موضح أيضا من قبل Hu و Catchmark4. BC شكلت أفضل في قوارير حائرة على طاولة اهتزاز المدارية. وجود يحير تسريع تطوير المجال مقارنة مع قوارير على نحو سلس الجدران6. منع التحريك التقليدي مع شريط مغناطيسي تشكيل الكرة. بالإضافة إلى ذلك، أثرت نسب مختلفة من ثقافة المبتدئين الميكروبية وخليط الشاي على توليد الكرة ووفرتها. في البداية، تمت إضافة 3 مل من ثقافة المبتدئين (2.10 في المئة كتلة من الحل) إلى 140 مل من وسائل الإعلام الشاي. بعد مواصلة التجارب، تم زيادة كمية ثقافة المبتدئين الميكروبية مع تقليل حجم وسائل الإعلام الشاي. وكانت الكميات النهائية المستخدمة 20 مل من ثقافة المبتدئين الميكروبية (20٪) و 80 مل من خليط الشاي. بالنسبة لسرعة الدوران، لم يكن تشكيل كرة BC ناجحا عندما اهتزت بسرعة أقل من 100 دورة في الدقيقة. تنتج سرعات 125 و140 و150 دورة في الدقيقة مجالات ولكن لها تباين في حجم الكرة وعددها وشكلها ، كما ورد سابقا6و29.
كعملية تشكيل قبل الميلاد ، الثقافة المهتاجة أفضل من الثقافة الثابتة ، كما ذكر سابقا2. بالمقارنة مع الأساليب الموضحة في دراسات أخرى ، وهذا واحد هو أقل تعقيدا ويتطلب مواد أقل. يذكر أدب آخر إعداد ثقافة الأسهم قبل الميلاد عن طريق تخمير أولا وسيط ثابت أو مهتاج ثم حصاد خلايا BC للتلقيح في الثقافة الرئيسية3و4و6و28و29و30. وتشمل بعض أساليب حصاد الخلايا هز قوية ثم الترشيح30، ثم مزج الترشيح4، والطرد المركزي3،29. خلايا BC المدمجة في عملية الإنتاج هذه متوفرة دائما في حاويات ثقافة المبتدئين الميكروبية ، لذلك ليس من الضروري حصاد الخلايا. وعلاوة على ذلك ، من خلال المساهمة بطريقة أخرى لتشكيل الكرة قبل الميلاد في الأدب القائم ، واستخدام قبل الميلاد التجارية هو أكثر قابلية للتحقيق. هذا مفيد بسبب خصائص المواد الصديقة للبيئة في BC29،31.
على الرغم من أن BC مادة بيولوجية مثيرة للاهتمام ويحتمل أن تكون قيمة ، لا تزال هناك تحديات لاستخدامها على نطاق واسع كما تشير الدراسات السابقة إلى18،32. في هذه الطريقة، هناك تناقضات مع حجم الكرة BC والشكل. الهياكل أنبوبي وخيط مثل شكل في بعض الأحيان في وسائل الإعلام2،18،32. قبل الميلاد العصي أيضا على جدران القوارير، وتشكيل الحلقات التي تصبح في بعض الأحيان معلقة في السائل، وينبغي إزالتها لمنع المزيد من المخالفات من تشكيل. وفي حين أن المجالات الموحدة تمكن من إجراء تحليل علمي متسق، فإنها قد لا تكون مطلوبة لبعض الاستخدامات الصناعية. وثمة تحد آخر هو الوقت الثقافة، مع الحد الأدنى لمدة لا تقل عن 2 أيام. وللتغلب على فترة الانتظار، يمكن للمصنعين إنتاج مجالات على دفعات متداخلة أو مفاعل تدفق مستمر لتوفير إمدادات ثابتة من مجالات BC. حتى في ضوء هذه التحديات ، تقدم مجالات BC طريقة مثيرة للاهتمام للإنتاج المستدام للسليلوز البكتيري والقدرة على تغليف مواد مختلفة داخل مصفوفة BC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
هذا العمل هو استمرار لمشروع برنامج مساعد الإرشاد في مونتانا للتكنولوجيا من قبل أدولفو مارتينيز وكاثرين مولهولاند وتايلر سومرفل ولوريل ميرمان. وقد رعت المؤسسة الوطنية للعلوم البحوث في إطار المنحة رقم OIA-1757351 ومختبر أبحاث الجيش لقيادة تطوير القدرات القتالية (الاتفاق التعاوني رقم W911NF-15-2-0020). أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم أو مختبر أبحاث الجيش. كما نود أن نشكر إيمي كوينزي ولي ريتشاردز وكاتيلين آلي وكريس غامونز وماكس وولغنانت وكريس بوش على مساهماتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL graduated cylinder | |||
| 1000 mL beaker | |||
| 25 mL graduated cylinder | |||
| 250 mL Erlenmeyer baffled flask | Chemglass | CLS-2040-02 | |
| 500 mL beaker | |||
| Balance | |||
| Biochar | Ponderosa pine heat treated under argon gas, heated at 15 °C per minute to 800 °C | ||
| Black tea | |||
| Deionized water | |||
| Distilled white vinegar | |||
| Elastic band | |||
| Microbial starter culture | Cultures for Health | ||
| Mine waste | Collected from Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mine waste contains soil and metals originating from past copper mining. Mn, Si, Ca, Al, and Fe were the five most prevalent elements measured in the mine waste through x-ray diffraction. | ||
| Mortar and pestle | |||
| Orbital shaker | Used various brands | ||
| Paper towel | |||
| Polystyrene microbeads | Polybead | 17138 | 3 micron diameter |
| Stir rod | |||
| Sucrose | |||
| Tea kettle | |||
| TGA | TA Instruments | TA Q500 | 400 °C/min to 800 °C, 100 mL/min N2 |
| Thermometer | |||
| XRF Analyzer | ThermoFisher Scientific | 10131166 |
References
- Mohainin Mohammad, S., Abd Rahman, N., Sahaid Khalil, M., Rozaimah Sheikh Abdullah, S. An Overview of Biocellulose Production Using Acetobacter xylinum Culture. Advances in Biological Research. 8 (6), 307-313 (2014).
- Dufresne, A. Bacterial cellulose. Nanocellulose. , 125-146 (2017).
- Czaja, W., Romanovicz, D., Brown, R. M. Structural investigations of microbial cellulose produced in stationary and agitated culture. Cellulose. 11 (3-4), 403-411 (2004).
- Hu, Y., Catchmark, J. M. Formation and characterization of spherelike bacterial cellulose particles produced by acetobacter xylinum JCM 9730 strain. Biomacromolecules. 11 (7), 1727-1734 (2010).
- Goh, W. N., Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A. A., Bhat, R. Microstructure and physical properties of microbial cellulose produced during fermentation of black tea broth (kombucha). International Food Research Journal. 19 (1), 153-158 (2012).
- Toyosaki, H., Naritomi, T., Seto, A., Matsuoka, M., Tsuchida, T., Yoshinaga, F. Screening of Bacterial Cellulose-producing Acetobacter Strains Suitable for Agitated Culture. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 59 (8), 1498-1502 (1995).
- Shi, Z., Zhang, Y., Phillips, G. O., Yang, G. Utilization of bacterial cellulose in food. Food Hydrocolloids. 35, 539-545 (2014).
- Holland, M. C., Eggensperger, C. G., Giagnorio, M., Schiffman, J. D., Tiraferri, A., Zodrow, K. R. Facile Postprocessing Alters the Permeability and Selectivity of Microbial Cellulose Ultrafiltration Membranes. Environmental Science and Technology. 54 (20), 13249-13256 (2020).
- Le Hoang, S., Vu, C. M., Pham, L. T., Choi, H. J. Preparation and physical characteristics of epoxy resin/ bacterial cellulose biocomposites. Polymer Bulletin. 75 (6), 2607-2625 (2018).
- Vu, C. M., Nguyen, D. D., Sinh, L. H., Pham, T. D., Pham, L. T., Choi, H. J. Environmentally benign green composites based on epoxy resin/bacterial cellulose reinforced glass fiber: Fabrication and mechanical characteristics. Polymer Testing. 61, 150-161 (2017).
- Pavaloiu, R. D., Stoica, A., Stroescu, M., Dobre, T. Controlled release of amoxicillin from bacterial cellulose membranes. Central European Journal of Chemistry. 12 (9), 962-967 (2014).
- Trovatti, E., et al. Biocellulose membranes as supports for dermal release of lidocaine. Biomacromolecules. 12 (11), 4162-4168 (2011).
- Trovatti, E., et al. Bacterial cellulose membranes applied in topical and transdermal delivery of lidocaine hydrochloride and ibuprofen: In vitro diffusion studies. International Journal of Pharmaceutics. 435 (1), 83-87 (2012).
- Shaviv, A., Mikkelsen, R. L. Controlled-release fertilizers to increase efficiency of nutrient use and minimize environmental degradation - A review. Fertilizer Research. 35 (1-2), 1-12 (1993).
- Eggensperger, C. G., et al. Sustainable living filtration membranes. Environmental Science and Technology Letters. 7 (3), 213-218 (2020).
- Schröpfer, S. B., et al. Biodegradation evaluation of bacterial cellulose, vegetable cellulose and poly (3-hydroxybutyrate) in soil. Polimeros. 25 (2), 154-160 (2015).
- Orts, W. J., Glenn, G. M. Reducing soil erosion losses with small applications of biopolymers. ACS Symposium Series. 723, 235-247 (1999).
- Mohite, B. V., Patil, S. V. A novel biomaterial: Bacterial cellulose and its new era applications. Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 101-110 (2014).
- Mikkelsen, R. L. Using hydrophilic polymers to control nutrient release. Fertilizer Research. 38 (1), 53-59 (1994).
- Du, C. W., Zhou, J. M., Shaviv, A. Release characteristics of nutrients from polymer-coated compound controlled release fertilizers. Journal of Polymers and the Environment. 14 (3), 223-230 (2006).
- Serafica, G., Mormino, R., Bungay, H. Inclusion of solid particles in bacterial cellulose. Applied Microbiology and Biotechnology. 58 (6), 756-760 (2002).
- Tomaszewska, M., Jarosiewicz, A. Use of polysulfone in controlled-release NPK fertilizer formulations. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (16), 4634-4639 (2002).
- González, M. E., et al. Evaluation of biodegradable polymers as encapsulating agents for the development of a urea controlled-release fertilizer using biochar as support material. Science of the Total Environment. 505, 446-453 (2015).
- Shavit, U., Shaviv, A., Shalit, G., Zaslavsky, D. Release characteristics of a new controlled release fertilizer. Journal of Controlled Release. 43 (2-3), 131-138 (1997).
- Kolakovic, R., Laaksonen, T., Peltonen, L., Laukkanen, A., Hirvonen, J. Spray-dried nanofibrillar cellulose microparticles for sustained drug release. International Journal of Pharmaceutics. 430 (1-2), 47-55 (2012).
- Zaharia, A., et al. Bacterial cellulose-poly(acrylic acid-: Co-N, N ′-methylene-bis-acrylamide) interpenetrated networks for the controlled release of fertilizers. RSC Advances. 8 (32), 17635-17644 (2018).
- Peterson, J. D., Vyazovkin, S., Wight, C. A. Kinetics of the thermal and thermo-oxidative degradation of polystyrene, polyethylene and poly(propylene). Macromolecular Chemistry and Physics. 202 (6), 775-784 (2001).
- Goh, W. N., Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A. A., Bhat, R. Fermentation of black tea broth (kombucha): I. effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose. International Food Research Journal. 19 (1), 109-117 (2012).
- Zhu, H., Jia, S., Yang, H., Jia, Y., Yan, L., Li, J. Preparation and application of bacterial cellulose sphere: A novel biomaterial. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 25 (1), 2233-2236 (2011).
- Nguyen, V. T., Flanagan, B., Gidley, M. J., Dykes, G. A. Characterization of cellulose production by a Gluconacetobacter xylinus strain from Kombucha. Current Microbiology. 57 (5), 449-453 (2008).
- Costa, A. F. S., Almeida, F. C. G., Vinhas, G. M., Sarubbo, L. A. Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter hansenii using corn steep liquor as nutrient sources. Frontiers in Microbiology. 8, 1-12 (2017).
- Watanabe, K., Tabuchi, M., Morinaga, Y., Yoshinaga, F. Structural features and properties of bacterial cellulose produced in agitated culture. Cellulose. 5 (3), 187-200 (1998).
