Summary
Burada, CAR-T hücrelerini değiştirmek için CRISPR Cas Teknolojisini kullanarak birincil insan T hücrelerinde gen düzenleme protokolü sunuyoruz.
Abstract
Kimerik antijen reseptör T hücreleri (CAR-T hücreleri) kullanılarak yapılan evlat edinen hücre tedavileri, hematolojik maligniteleri olan hastalarda dikkat çekici klinik etkinlik göstermiştir ve şu anda çeşitli katı tümörler için araştırılmaktadır. CAR-T hücreleri, T hücrelerini hastanın kanından uzaklaştırarak ve T hücrelerini hedef tümör hücrelerini tanımaya ve ortadan kaldırmaya yönlendiren sentetik bir bağışıklık reseptörü ifade etmek için mühendisliği yapılarak oluşturulur. CAR-T hücrelerinin gen düzenlemesi, mevcut CAR-T hücre tedavilerinin güvenliğini artırma ve CAR-T hücrelerinin etkinliğini daha da artırma potansiyeline sahiptir. Burada, CRISPR tarafından tasarlanmış insan CD19 yönlendirilmiş CAR-T hücrelerinin aktivasyonu, genişletilmesi ve karakterizasyonu için yöntemleri açıklıyoruz. Bu, CAR lentiviral vektörün transdüksiyonunu ve T hücrelerine ilgi genlerini hedeflemek için tek kılavuz RNA (sgRNA) ve Cas9 endonucleaz kullanımını içerir. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bu çalışma için kullanılanların ötesindeki diğer CAR yapılarına ve hedef genlere evrensel olarak uygulanabilir. Ayrıca, bu protokolde gRNA tasarımı, kurşun gRNA seçimi ve hedef gen nakavt doğrulaması için yüksek verimli, çok katlı CRISPR-Cas9 klinik sınıf insan T hücrelerinin mühendisliğini yeniden elde etmek için stratejiler tartışılmaktadır.
Introduction
Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi, evlat edinen hücre tedavileri ve kanser immünoterapisi alanında devrim sağlamıştır. CAR-T hücreleri, antijene özgü tek zincirli antikor parçasını TCRzeta zincirinden elde edilen sinyal etki alanları ve T hücre aktivasyonu ve ko-stimülasyon için gerekli ve yeterli costimülatör etki alanlarıyla birleştiren sentetik bir immün reseptörü ifade eden T hücreleridir. . CAR-T hücrelerinin üretimi hastanın kendi T hücrelerini çıkararak başlar, ardından CAR modülünün ex vivo viral transdüksiyonu ve CAR-T hücre ürününün yapay antijen olarak işlev gören manyetik boncuklarla genişletilmesi5. Genişletilmiş CAR-T hücreleri, hastaya engraft, hedef tümör hücrelerini ortadan kaldırabilecekleri ve hatta infüzyonsonrası 6,7,8. CAR-T hücre tedavisi B hücre malignitelerinde dikkate değer yanıt oranlarına neden olsa da, katı tümörler için klinik başarı, zayıf T hücre infiltrasyon9, immünsüpresif tümör mikroçevrimi10, antijen kapsamı ve özgüllüğü ve CAR-T hücre disfonksiyonu11,12 dahil olmak üzere birden fazla faktör tarafındanzorlandı. . Mevcut CAR-T hücre tedavisinin bir diğer sınırlaması otolog T hücrelerinin kullanımını içerir. Birden fazla kemoterapi ve yüksek tümör yükünden sonra, CAR-T hücreleri, otolog CAR-T hücrelerinin üretimiyle ilişkili zaman ve masrafa ek olarak sağlıklı donörlerden gelen allogeneik CAR-T ürünlerine kıyasla düşük kalitede olabilir. CAR-T hücre ürününün CRISPR/Cas9 tarafından gen düzenlemesi, CAR-T hücrelerinin mevcut sınırlamalarını aşmak için yeni bir stratejiyi temsil eder13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9, memeli hücrelerinde hedeflenen genom düzenleme için kullanılabilecek iki bileşenli bir sistemdir18,19. CRISPR ile ilişkili endonuclease Cas9, hedef DNA dizisi20ile baz eşleştirme yoluyla küçük RNA'lar tarafından yönlendirilen bölgeye özgü çift iplikçik kırılmalarına neden olabilir. Bir onarım şablonunun yokluğunda, çift iplikçik molaları, ekleme ve silme mutasyonları (INDEL' ler) 19,20,21yoluyla frameshift mutasyonları veya erken durdurma kodonları ile sonuçlanan hataya eğilimli nonhomolog son birleştirme(NHEJ)yolu ile onarılır. Verimlilik, kullanım kolaylığı, maliyet etkinliği ve çok katlı genom düzenleme yeteneği CRISPR/Cas9'u otolog ve allogeneik CAR-T hücrelerinin etkinliğini ve güvenliğini artırmak için güçlü bir araç haline getirir. Bu yaklaşım, CAR yapısını bir TCR ile değiştirerek TCR yönlendirilmiş T hücrelerini düzenlemek için de kullanılabilir. Ek olarak, grefte ve konak hastalığa neden olma potansiyeli sınırlı olan allogeneik CAR-T hücreleri de TCR, b2m ve HLA lokus gen düzenlemesi ile üretilebilir.
Bu protokolde, T hücrelerinin CRISPR mühendisliğinin, gelişmiş etkinlik ve güvenliğe sahip genom düzenlemeli CAR-T hücre ürünleri üretmek için CAR-Transgene'in viral vektör aracılı teslimatı ile nasıl birleştirilebileceğini gösteriyoruz. Şekil 1'de tüm işlemin şematik diyagramı gösterilmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, birincil insan CAR-T hücrelerinde yüksek verimli gen nakavtı gösterdik. Şekil 2A, T hücrelerini düzenlemek ve üretmek için her adımın zaman çizelgesini ayrıntılı olarak açıklar. Bu yaklaşımı çeşitli hedef genlere uygulamak için kılavuz RNA tasarımı ve nakavt doğrulaması stratejileri de tartışılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan T hücreleri, MIATA ve Pennsylvania Üniversitesi etik kurallarına uygun numune alma, işleme, dondurma ve analiz için belirlenmiş standart çalışma prosedürleri ve/veya protokolleri ile İyi Laboratuvar Uygulaması ilkeleri altında çalışan Pennsylvania Üniversitesi İnsan İmmünoloji Çekirdeği aracılığıyla temin edilmiştir.
1. Lentiviral vektör üretimi
NOT: Viral ürünler, ambalaj yapılarının (Rev, gag/pol/RRE, VSVg ve transfer plazmid) dört ayrı plazmid içine ayrılmasıyla replikasyon kusurlu hale getirilmiş ve replikasyona yetkin virüsle sonuçlanabilecek rekombinasyon olaylarının olasılığını büyük ölçüde azaltmıştır.
- Hek293T hücrelerini transfectiondan bir gün önce hazırlayın. Standart kültür medyasında 30 mL'lik T150 kültür damarlarında yaklaşık 6 x 106 hücre plaka (%10 fetal baldır serumu ile desteklenmiş R10:RPMI 1640 olarak adlandırılır, 10 mM HEPES, %1 Pen/Strep, %1 L-glutamin) ve 37 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatarak 18-24 saat sonra, hücreler %60-70 bir arada olmalı ve sağlıklı görünmelidir (dendritik projeksiyonlar ve şişe boyunca tek tip dağılım). Hücreler sağlıklı görünüyorsa, 1.2 adımına geçin.
- Lipofeksiyon reaktifi (96 μL), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-8) içeren transfeksiyon karışımını hazırlayın3) (18 μg), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 μg) ambalaj plazmidleri ve 15 μg ifade plazmidi (cd19bbz scFv pTRPE'de klonlanmış).
- Her transfeksiyon reaksiyonu için, 1 mL azaltılmış serum minimal esansiyel ortam içeren bir tüp ve adım 1.2'de açıklanan dört plazmid ve 2 mL azaltılmış serum minimum temel ortam içeren bir tüp ve 90 μL lipofeksiyon reaktifi hazırlayın. Bu iki çözeltiyi, 2 mL lipofeksiyon reaktif karışımına 1 mL plazmid karışımını damla damla ekleyerek birleştirin. Çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyarak kuvvetli bir şekilde karıştırdığından emin olun. Çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Bu arada, HEK293T hücre şişesinden medyayı aspire edin ve hücreleri 10 mL azaltılmış serum minimal esansiyel ortamla hafifçe yıkayın ve tekrar emiş verin.
- Transfeksiyon karışımını (3 mL) 1.2.1 adımından hücre kültürü şişesinin alt köşesine 5 mL serolojik pipet kullanarak hafifçe ekleyin. Transfeksiyon karışımını hücre kültürü şişesine eşit olarak dağıtmak için şişeyi hafifçe eğin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre monolayerini rahatsız etmediğinden emin olun. 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, 35 mL R10 ortam ekleyin ve 24 saat boyunca inkübatöre şişe geri dönün.
- 24 saat sonra, supernatant'ı HEK293T hücre kültürü şişelerinden toplayın ve 50 mL konik tüplere aktarın. HEK29T hücrelerine taze R10 ekleyin ve hücreleri 24 saat daha inkübatöre geri koyun. Hücre kalıntılarını gidermek ve süpernatantı 0,45 μm filtreden filtrelemek için süpernatantı (300 x g) aşağı çevirin.
- Filtratı adım 1.3'ten yüksek hızlı ultrasantrifüjleme (2.5 saat için 25.000 x g veya bir gecede 8000 x g (O/N)) ile konsantre edin. 48 h virüsü birikirken 24 h virüs peletini 4 °C'de saklayın.
- 48 h koleksiyonu için 1.3-1.4 adımlarını yineleyin ve 24 h ve 48 h virüs koleksiyonlarını birleştirin. 48 h koleksiyonundan gelen peletler, lentivirüsun birleşik bir hasadını içerecektir.
- Viral peleti yaklaşık 1 mL soğuk R10 ve aliquot'ta 100 μL şişelere yeniden depolar. Kuru buz kullanarak aliquotları hemen dondurun ve -80 °C'de saklayın.
- Lentiviral süpernatantın seri seyreltmeleri ile sabit miktarda CD3/CD28 boncukla aktive edilmiş birincil insan T hücrelerini geçirerek, transdüksiyon ünitelerinde/mL'de fonksiyonel viral titreyi hesaplayın. 72 saat sonra CAR-Transdüksiyon'u akış-sitometri ile ölçün.
- Anti-FCM63 scFv antikorlu CD19 yönlendirilmiş ARABA için leke. Diğer kimerik antijen reseptörleri için, CAR scFv'ye özgü florofor etiketli rekombinant protein kullanarak leke. Akış-sitometri ile% 20'nin altında CAR pozitif hücre üreten virüs seyreltme, viral titreyi hesaplamak için en doğru seyreltmedir. %20'nin üzerinde CAR pozitif hücreler, her pozitif hücrenin iki kez transdüksiyon şansı artar ve bu da transdüksiyon parçacıklarının sayısının hafife alınmasına neden olur. mL(TU/mL) = başına transdüksiyon birimlerini hesaplayın = (yüzde x üretilen hücre sayısı X CAR pozitif hücreler x seyreltme faktörü)/(mL cinsinden transdüksiyon hacmi).
2. Birincil insan T hücrelerinde sgRNA'ların tasarımı ve gen bozulması
- CRISPR sgRNA'ların tasarımı
NOT: Çeşitli sunucular ve programlar hedefe özgü sgRNA'ların tasarımını kolaylaştırır. Bu protokolde CRISPR sgRNA'lar CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) ve Broad enstitüsünün gRNA tasarım portalı (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) kullanılarak tasarlanmıştır.- Her hedef gen için, erken kodlama ekson dizilerini hedeflemek için altı ila on sgRNA dizisi tasarlayın.
NOT: sgRNA yüksek hedef etkinliği ve düşük hedef etkinliği olmalıdır. SgRNA etkinliğini belirlemek için her makine öğrenimi algoritması biraz farklı çalışır. Bu nedenle, birden fazla sgRNA tasarım aletinin karşılaştırılması ve tarama için altı ila on sgRNA listesinin küratörlüğü önerilir.
- Her hedef gen için, erken kodlama ekson dizilerini hedeflemek için altı ila on sgRNA dizisi tasarlayın.
- Birincil insan T hücrelerinde gen bozulması
- Sağlıklı gönüllü bağışçılardan otolog periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) elde edin. Protokolün şematik zaman çizelgesi Şekil 2A'da açıklanmıştır ve aşağıda açıklanmıştır.
- Piyasada bulunanCD4 ve CD8 seçim kitlerini kullanarak CD4 + ve CD8+ T hücrelerini izole edin.
- CD4+ ve CD8+ T hücrelerini 1:1 oranında birleştirin ve her biri 5 ng/mL huIL-7 ve huIL-15 ile desteklenmiş R10'da 3x106 hücre / mL'de bir gecede kuluçkaya yatırın. IL-7 ve IL-15'in eklenmesi, merkezi bir bellek fenotipini teşvik ettikleri bilindiğinden ve IL-7 ve IL-15 ile genişletilen CAR-T hücrelerinin IL-2 genişletilmiş CAR-T hücrelerine kıyasla üstün anti-tümör etkinliğine sahip olması önerilir22,23,24.
- Ertesi gün, T hücrelerini ve santrifüjleri 5 dakika boyunca 300 x g'da 5-10 x 106 hücreyi sayın. Tüm süpernatant atın ve hücre peletini azaltılmış serum minimum temel ortamda yıkayın. Peleti üreticinin talimatlarına göre 100 μL nükleofeksiyon çözeltisineyenidenuygulayın ( Malzeme Masası ).
- Hücreleri yıkarken, oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 5 μg sgRNA ile 10 μg Cas9 çekirdeğini inkübe ederek Cas9 ve gRNA ile ribonikleoprotein (RNP) kompleksi hazırlayın. Cas9'un sgRNA'ya molar oranı 1:2.4'tür. Cas9 ve elektroporasyon arttırıcı içeren, ancak sgRNA içermeyen sahte bir kontrol önerilir.
NOT: Multipleks gen düzenleme, her hedef için ayrı ayrı RNP kompleksleri yapılarak ve bir sonraki adımda açıklandığı gibi o sırada nükleofeksiyondaki hücrelerle birleştirilerek bu adımda gerçekleştirilebilir. RNP kompleksini birleştirmek için reaktifleri seçmek, yüksek KO verimliliği elde etmenin anahtarıdır. Örneğin, farklı satıcılardan cas9 çekirdekleri farklı hedef dışı etkilere sahiptir ve kimyasal olarak değiştirilmiş gRNA T hücrelerine toksisiteyi azaltır, böylece KO verimliliğini artırır. - 2.2.4 adımındaki yeniden canlandırılmış hücreleri 2.2.5 adımından itibaren RNP kompleksi ile birleştirin ve 4.2 μL 4 μM elektroporasyon arttırıcı (insan genomuna homolog olmayan ssDNA oligonükleotid) ekleyin. İyice karıştırın ve elektroporasyon cuvettes içine aktarın. Elektroporasyon verimliliğini bozduğu için kabarcıklardan kaçının.
- Eh111 darbe kodunu kullanan elektroporat hücreleri. Elektroporasyondan sonra, R10'daki hücreleri 5 ng/mL huIL-7 ve huIL-15 ile 5x106 hücre/mL'de 30 °C'de 12 kuyu plakalarında 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, T hücre aktivasyonu ve genişlemesi ile devam edin.
3. T hücre aktivasyonu, lentiviral transdüksiyon ve genişleme
NOT: SgRNA'ların taranması için CAR yapısına lentiviral transdüksiyon (Adım 3.2) gerekli değildir.
- Elektroporlu T hücrelerini sayın ve 5 ng/mL huIL-7 ve huIL-15 ile desteklenmiş sıcak R10 kullanarak 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin. Canlı T hücresi başına 3 boncuk oranında anti-CD3/anti-CD28 monoklonal antikor kaplı manyetik boncuklar ekleyerek hücreleri etkinleştirin.
NOT: Elektroporasyon, elektroporlanmamış hücrelere kıyasla yaklaşık% 60 ±% 15 yaşayabilir hücrelere neden olan önemli hücre ölümüne neden olur. Uygun miktarda boncuk belirlemek için canlı/ölü hücre sayısı kullanın. Hücreleri 37 °C'ye aktarın ve gece boyunca kuluçkaya yatırın. - Bir gecede stimülasyondan sonra, CRISPR tarafından tasarlanmış T hücrelerini adım 1'den itibaren lentiviral süpernatant ile transdüse edin. 3'lük çok miktarda enfeksiyon (MOI) elde etmek için adım 1.7'de hesaplanan viral titreye göre uygun hacmi ekleyin ve 37 °C'de 72 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın.
NOT: R10'da yeniden süzülen virüs pelet, hücre konsantrasyonuna, viral titreye ve istenen MOI'ye göre hücrelerin üzerine eklenir. - 72 saat sonra, 10 ng/mL huIL-7 ve huIL-15 içeren mevcut kültür hacmi R10'un% 50'sine sahip hücreleri besleyin ve 48 saat daha inkübatöre geri döndürün. T hücreleri ve boncuklar arasında oluşan kümeleri rahatsız etmeyin.
- 48 saat sonra, hücre boncuk karışımını ve ardından manyetik ayırmayı hafifçe yeniden oluşturarak boncukları hücrelerden çıkarın. Boncuk çıkarıldıktan sonra hücreleri sayın ve 5 ng/mL huIL-7 ve huIL-15 ile desteklenmiş R10 kullanarak 0,8 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna getirin. Boncuklardan arındırıldıktan sonra, hücre numaraları elektroporasyondan önceki1.
- 24 saat sonra, hücreleri sayın ve R10 + 5 ng / mL huIL-7 ve huIL-15 ile 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonuna besleyin. Büyüme kinetiği ve hücre büyüklüğü hücrelerin stimülasyondan dinlendiğini gösterene kadar bunu her 24 saat tekrarlayın.
NOT: Bu noktadan itibaren, T hücreleri yaklaşık olarak her 24 saatte bir iki katına çıkarın. T-hücresi genellikle 5-7 popülasyon iki katına çıkar ve dinlendiğinde yaklaşık 300 ± 50 fL hücre hacmine sahiptir. - Dinlendikten sonra CRISPR tarafından tasarlanmış CAR-T hücrelerini aşağı çevirin ve kriyoprezervasyon için donma ortamlarına (1:1 X-Vivo ve FBS artı% 10 DMSO) yeniden harcayın. Kullanılan CAR-T hücreleri bir deneyden önce 16 saat boyunca 37 °C'de çözülmeli ve dinlendirilmelidir.
NOT: Nakavt verimliliğini ve CAR entegrasyonunu ölçmek için yaklaşık 10x106 hücreyi rezerve edin. Genişleme sırasında beklenen nüfus iki katına çıkmaları ve hacim değişiklikleri Şekil 2B ,2C'de gösterilmiştir. Ek olarak, Şekil 2D hem Mock hem de gen tarafından düzenlenmiş CAR-T hücrelerinde CAR ifade seviyelerini gösterir.
4. CRISPR Verimliliği
- Genomik DNA ekstraksiyonu ve hedef gen amplifikasyonu
- Her tarama kültüründen 3-5 x 106 T hücre aşağı çevirin. Hücreler kuru bir pelet olarak dondurulabilir veya genomik DNA ekstraksiyonuna devam edebilir. DNA ekstraksiyonu sırasında, 200 μL Fosfat Tampon Salininde (PBS) peletleri yeniden biriktirin ve üretici talimatına göre standart bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak elektroporize hücrelerden genomik DNA çıkarın.
- Kısaca, proteinaz K ile hücreleri haline ve bir DNA bağlayıcı sütuna lysate yükleyin. Santrifüjleme sırasında DNA membrana bağlanırken kirleticiler geçecektir. Kalan kirleticileri ve enzim inhibitörlerini çıkarmak için iki yıkama adımından sonra, SUDA DNA'yı elüte edin.
- DNA polimeraz, aksesuar proteinleri, tuzlar ve dNTP'ler ve hedeflenen çift iplik kopma bölgesini kuşaten 10 μM ileri ve ters astar içeren standart PCR karışımını kullanarak 200-300 ng genomik DNA'yı güçlendirin.
NOT: PCR astar tasarımı için, gRNA kesim bölgesini kuşayan referans genomik dizi (http://www.ensemble.org kullanılarak bulunabilir) NCBI astar patlatma aracına (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) girilir. PCR astarlar, amplicon'un hedef boyutu 600-700bp olacak şekilde tasarlanmalıdır. Bu uzunluk, Cas9 indüklenen indellerin etrafında iyi sıralama kalitesi sağlamak için amplicon içinde gRNA kesim bölgesinden (en az 150 bp) yeterli mesafe ile bağlanan sıralama astarları tasarlamaya izin verir (bkz. 4.2.1). GRNA kesim alanları yakın olmadığı sürece her gRNA benzersiz bir astar çifti gerektirir. - Tüm PCR ürününü% 1 agarose jel üzerinde çalıştırın ve standart bir agarose jel arıtma kiti kullanarak amplicon'u arındırın.
NOT: PCR için en uygun Tm'yi belirleme işlemi birden fazla sorun giderme turu alabilir. Bunun nedeni, KO dizisinin indellere sahip olması ve hedef genin, kesim bölgesinin genellikle 100 bp yukarı veya aşağı akışta indellerin olmayacağı sıralama için astarlanmış olmasıdır. Bu, homolog olmayan uç birleştirmeden kaynaklanan indeller nedeniyle büyük ölçüde değişebilir. PCR astarlarına iç içe dizme astarları tasarlamak ve sıralı ürün konsantrasyonunun artırılması, sıralama ile ilgili sorunları ortadan kaldırabilir.
- Her tarama kültüründen 3-5 x 106 T hücre aşağı çevirin. Hücreler kuru bir pelet olarak dondurulabilir veya genomik DNA ekstraksiyonuna devam edebilir. DNA ekstraksiyonu sırasında, 200 μL Fosfat Tampon Salininde (PBS) peletleri yeniden biriktirin ve üretici talimatına göre standart bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak elektroporize hücrelerden genomik DNA çıkarın.
- Sıralama ve indel algılama
- Jel saflaştırılmış amplicon'a bağlanan ve Sanger dizilimi için sahte ve nakavt ampliconları gönderen sıralı astarlar tasarlayın. Sıralama tamamlandıktan sonra, tide analizi için izleme dosyalarını Masaüstü Genetiği yazılımına (tide.deskgen.com, Masaüstü Genetiği) yükleyin.
- Astar tasarımını sıralamak için, PCR amplicon'un sırasını standart bir astar tasarım yazılımına (NCBI, Eurofins veya diğer halka açık araçlar) girin. Tasarım yazılımı, sanger dizilimine uygun birden fazla astar dizisi önerecektir.
- İndellerin etrafında iyi sıralama kalitesi sağlamak için gRNA kesim bölgesinin en az 150 bp yukarı veya aşağı akışta amplicon içinde bağlanan ileri ve ters astarları seçin. Sıralama kromatogramı TIDE analizi için 4.2'de kullanılacaktır, bu nedenle sıralama kalitesinin doğru indel ayrışması için iyi olması önemlidir (bkz. Hultquist vd.) 25.
- Genomik düzeyde nakavt (KO) verimliliğini tespit etmek için TIDE (DEcomposition ile Indels'in İzlimi) analizinikullanın. Algoritma, dizi izlemelerinden gelen indel spektrumu doğru bir şekilde yeniden yapılandırır ve TIDE yazılımı tarafından negatif olmayan doğrusal modellemeden sonra uygun iyiliği yansıtan R2 değerlerini hesaplar.
- Jel saflaştırılmış amplicon'a bağlanan ve Sanger dizilimi için sahte ve nakavt ampliconları gönderen sıralı astarlar tasarlayın. Sıralama tamamlandıktan sonra, tide analizi için izleme dosyalarını Masaüstü Genetiği yazılımına (tide.deskgen.com, Masaüstü Genetiği) yükleyin.
- Hedef protein tespiti
- Gen ürünü T hücrelerinin yüzeyinde ifade edilen hedef genler için, hedef proteine özgü florokrom etiketli antikor ile her tarama kültüründen yaklaşık 1 x10 5 hücreyi lekeler. Şekil 3A ,3B'degösterildiği gibi, akış sitometrisine göre hedef proteinin ifade düzeylerini sahte kontrol ve nakavt grupları arasında karşılaştırın.
- Gen ürünü hücre içi olarak ifade edilen hedef genler için, lizis tamponunda tarama grubu başına yaklaşık 3 x10 6 milyon hücreyi meydana getirerek SDS-PAGE ve batı şişkinliği için standart protokolleri izleyin. Alternatif olarak, hedef proteini araştırmak için yüzey veya hücre içi akış sitometrisi kullanılabilir.
5. iGUIDE kullanarak hedef dışı etkileri izleme - Kütüphane hazırlama, DNA dizilimi ve analizi
NOT: iGUIDE tekniği, Cas9 kılavuzlu bölünmenin konumlarının tespit edilmesine ve bu DNA çift iplikli kırılmaların dağılımlarının ölçülmesine olanak tanır.
- Nobles ve ark.21tarafından açıklandığı gibi iGUIDE gerçekleştirin. iGUIDE tekniğini kullanarak TRAC lokusu hedefleyen sgRNA'nın hedef dışı etkileri Stadtmauer ve ark, 202013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, hem otolog hem de allogeneik CAR-T hücrelerinin yanı sıra TCR yönlendirilmiş T hücrelerini oluşturmak için kullanılabilecek genetik mühendisliği T hücrelerine bir protokol açıklıyoruz.
Şekil 1, CRISPR düzenlenmiş T hücrelerinin üretim sürecinde yer alan aşamaların ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Süreç, sgRNA'yı ilgi genine göre tasarlayarak başlar. SgRNA tasarlandıktan ve sentezlendikten sonra, uygun Cas proteini ile RNP kompleksleri yapmak için kullanılırlar. T hücreleri sağlıklı bir donörden izole edilir veya hasta aferez ve RNP kompleksleri elektroporasyon veya nükleofeksiyon ile teslim edilir. Düzenleme sonrası, T hücreleri CAR veya TCR yapısı için lentiviral vektör kodlaması ile etkinleştirilir ve transdüklenir. Aktivasyondan sonra, T hücreleri kültürde genişletilir ve gelecekteki çalışmalar için kriyopreziteserved edilir. Laboratuvarda izlenen ayrıntılı protokol Şekil 2'deaçıklanmıştır. Genişleme sırasında, popülasyon iki katına çıkan ve hacim değişiklikleri protokol boyunca izlenir ve hem sahte hem de düzenlenmiş CAR-T hücreleri için Şekil 2B ve C'de bir örnek gösterilir. Şekil 2B, C, ilgi geninin KO'sunun genişleme sırasında çoğalma ve aktivasyonda önemli bir değişikliğe neden olmadığını göstermektedir. Bununla birlikte, bu sonuçlar düzenlenen hedef genlere bağlıdır ve bu nedenle çoğalma ve genişlemede değişikliklere yol açabilir veya olmayabilir.
Hücreler kriyopreziserv edildikten sonra, daha fazla fonksiyonel çalışma için CAR ekspresyon seviyeleri de belirlenir. Bu durumda, Şekil 2D'de gösterildiği gibi, hem Mock düzenlenmiş hem de KO CAR-T hücrelerinde CD19 CAR ifadesini kontrol ettik ve önemli bir değişiklik görmedik. Bu yine düzenlenen ilgi genine bağlı olacaktır. Son olarak, KO verimliliği protein seviyesi tespiti için akış sitometrisi ve batı lekesi ve ayrıca KO'nun gen seviyesi tespiti için Sanger dizilimi gibi birden fazla teknik kullanılarak belirlenebilir. Şekil 3A ve 3B, PDCD1 ve TRAC locus'un sgRNA kullanılarak hedeflendiği temsili akış sitometrisi çizimlerini göstererek, pdcd1 sgRNA için% 90 ve birden fazla sağlıklı donörde TRAC sgRNA için% 98 verimlilik göstermektedir. Böylece, bu protokol canlılıkta minimum kayıpla yüksek verimli nakavt elde edebilir.
Şekil 1. CRISPR Cas9 Teknolojisi kullanılarak T hücre düzenleme ve birincil insan CAR-T hücrelerinin üretimini gösteren şematik diyagram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Düzenlenmiş CAR-T hücrelerinin genişlemesi ve popülasyonları ikiye katlandı. (A) Birincil insan CART hücrelerinde CRISPR düzenleme ve üretim zamançizelgesi. (B) Mock ve CRISPR'daki Nüfus İkiye Katlamaları, CAR-T hücrelerinin genişlemesi sırasında bir Coulter Sayacı kullanılarak ölçülen CD19 CAR-T hücrelerini düzenlemiş (n=3 sağlıklı donörler; KO=nakavt) (C) Car-T hücrelerinin genişlemesi sırasında bir Coulter Sayacı kullanılarak ölçülen hücre boyutu (μm3) (n=3 sağlıklı donörler). (D) Hem sahte hem de düzenlenmiş CAR-T hücrelerinde CAR ifadesini gösteren birden fazla donörde CAR boyama ve ortalamasını gösteren temsili akış sitometrisi çizimleri. CAR ekspresyosu, florofora konjuge edilmiş ve Lenfositler/Singlet/Canlı Hücreler (n=3 sağlıklı donörler, UTD=untransduced,) üzerine kapılı bir anti-idiyot antikor kullanılarak saptırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Akış sitometrisi kullanılarak düzenlenmiş CAR-T Hücrelerinde KO verimliliğinin karakterizei. (A) Sahte ve düzenlenmiş CAR-T hücrelerinde TRAC lokusunu hedefleyen bir gRNA kullanarak PD-1 KO verimliliğini gösteren birden fazla donörde PD-1 boyama ve ortalamasını gösteren temsili akış sitometrisi çizimleri. PD-1 ekspresyosu, florofora konjuge edilmiş ve Lenfositler/Singlet/Canlı Hücreler (n=3 sağlıklı donörler) üzerine kapılı PD-1 antikoru (Clone EH12.2H7) kullanılarak saptırıldı. Hata çubukları ortalama±ayak hatasını gösterir (SEM). s<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 Welch'in t testi ile. (B) Sahte ve düzenlenmiş CAR-T hücrelerinde TRAC lokusunu hedefleyen bir gRNA kullanarak CD3 KO verimliliğini gösteren birden fazla donörde CD3 boyama ve ortalama gösteren temsili akış sitometrisi çizimleri. CD3 ekspresyosu, florofora konjuge edilmiş ve Lenfositler/Singlet/Canlı Hücreler (n=3 sağlıklı donörler) üzerine kapılı CD3 antikoru (Klon OKT3) kullanılarak saptırıldı. Hata çubukları ortalama±ayak hatasını gösterir (SEM). s<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 Welch'in t testi ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada CRISPR Cas9 teknolojisini kullanarak CAR-T hücrelerini gen düzenleme yaklaşımlarını açıklıyoruz ve işlev ve etkinliği daha fazla test etmek için ürünler üretiyoruz. Yukarıdaki protokol, chimerik antijen reseptörleri ile mühendislik T hücreleri ile birlikte birincil insan T hücrelerinde CRIPSR gen düzenleme yapmak için optimize edilmiştir. Bu protokol, donörden donöre en az değişkenlik ile yüksek nakavt verimliliği sağlar. CRISPR kullanılarak yapılan modifikasyon, T hücrelerinin işlevini engelleyen reseptörleri ortadan kaldırarak ve allogeneik CAR-T hücreleri üreterek CAR-T hücrelerinin hem etkinliğini hem de güvenliğini artırabilir.
Küçük ölçekli genişleme protokolleri için, grup başına 106 hücre ile başlayarak, sağlıklı bir normal donörde ortalama6 popülasyon iki katına çıkarak yaklaşık 500 6 CAR-T hücresine yol açar. Bununla birlikte, bu, ilgi geninin T hücre aktivasyonunu, transdüksiyonunu ve çoğalmasını etkileyip etkilememesine bağlı olarak değişebilir. Ko verimliliğini, in vitro tahlilleri ve in vivo tahlilleri doğrulamak için beş yüz milyon hücre yeterlidir. CRISPR düzenlemesinin etkinleştirme ve CAR-Transdüksiyondan önce veya sonra gerçekleştirilebileceği protokolde farklı varyasyonlar vardır. Ren ve arkadaşları, boncuk stimülasyonu ve CAR-Transdüksiyon15'densonra hücrelerin düzenlendiği böyle bir varyasyonu tanımladı. Boncuk stimülasyonundan önce CRISPR düzenlemenin avantajı, T hücreleri henüz çoğalmadığından, prosedürü daha az zaman alan ve daha uygun maliyetli hale getirdiğinden, daha düşük hücre miktarlarının düzenlenmesi gerekir. Ayrıca, önceden düzenleme yapmak doğrudan kliniğe çevrilebilir. Aslında, bu protokoldeki birçok adım, klinikte benimsenebilecek ve banktan başucuna geçerken KO verimliliğinin tutarlılığını artıran birçok adım hakkında bilgilendirilmiştir.
Protokolün her adımında seçilebilecek birden çok değişken vardır. Örneğin, T hücreleri elektroporlu veya nükleoze bulaşabilir. Her ikisi de karşılaştırılabilir KO verimlilikleri elde ederken, nükleofector'u kullanma deneyimimizde düzenleme sonrası daha yüksek canlılığa sahiptir ve bu nedenle tercih edilir. Bununla birlikte, elektroporatör kullanmak uzun vadede daha uygun maliyetli olabilir. Bu ekipmanların her ikisi de küçük ölçekli T hücre genişletmeleri için kullanılır. Büyük ölçekli ve klinik ölçekli genişletmeler için, protokoller düzenlemeyi gerçekleştirmek için yeniden optimize edilmelidir ve nükleofeksiyon için farklı ekipmanlar gerektirir. Kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak hem küçük ölçekli hem de büyük ölçekli düzenleme ve genişletme için kullanılabilecek birden fazla teknolojik platform vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbir açıklaması yok.
Acknowledgments
İnsan İmmünoloji Çekirdeği'ni normal donör T hücreleri ve Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Akış Sitometri Çekirdeğini sağladığı için kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
