Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעריכת גנים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas לשינוי תאי CAR-T.
Abstract
טיפולים תאיים מאמצים באמצעות תאי T קולטן אנטיגן כימרי (תאי CAR-T) הראו יעילות קלינית יוצאת דופן בחולים עם ממאירות המטולוגית והם נחקרים כעת עבור גידולים מוצקים שונים. תאי CAR-T נוצרים על ידי הסרת תאי T מדמו של המטופל והנדסתם כדי לבטא קולטן חיסוני סינתטי הנותב מחדש את תאי ה- T לזהות ולחסל תאי גידול ממוקדים. עריכת גנים של תאי CAR-T יש פוטנציאל לשפר את הבטיחות של טיפולים בתא CAR-T הנוכחי ולהגדיל עוד יותר את היעילות של תאי CAR-T. כאן, אנו מתארים שיטות להפעלה, הרחבה ואפיון של תאי CAR-T מכוונים של CD19 מהונדסים על ידי CRISPR האנושיים. זה כולל טרנס-אדוקציה של וקטור LENTIVIRAL CAR ושימוש ב- RNA מדריך יחיד (sgRNA) ו- Cas9 endonuclease כדי למקד גנים של עניין בתאי T. השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות באופן אוניברסלי על מבנים אחרים של CAR ולמקד גנים מעבר לאלה המשמשים למחקר זה. יתר על כן, פרוטוקול זה דן באסטרטגיות עבור עיצוב gRNA, בחירת gRNA להוביל ואימות נוקאאוט גן היעד כדי להשיג באופן פורה יעילות גבוהה, הנדסת CRISPR-Cas9 מולטיפלקס של תאי T אנושיים ברמה קלינית.
Introduction
קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T טיפול בתאים חולל מהפכה בתחום הטיפולים האימוצים בתאים ואימונותרפיה של סרטן. תאי CAR-T מהונדסים תאי T המבטאים קולטן חיסוני סינתטי המשלב שבר נוגדן יחיד ספציפי לאנטיגן עם תחומי איתות הנגזרים משרשרת TCRzeta ותחומים עלותיים הכרחיים ומספיקים להפעלה של תאי T וגירוי משותף1,2,3,4 . הייצור של תאי CAR-T מתחיל על ידי חילוץ תאי T של המטופל עצמו, ואחריו transduction ויראלי ex vivo של מודול CAR והרחבת המוצר תא CAR-T עם חרוזים מגנטיים המתפקדים כאנטיגן מלאכותי המציג תאים5. תאי CAR-T מורחבים מוחדרים מחדש לחולה שבו הם יכולים לחרוט, לחסל תאים סרטניים היעד ואפילו להתמיד במשך מספר שנים לאחר עירוי6,7,8. למרות טיפול בתא CAR-T הביא שיעורי תגובה יוצאי דופן ממאירות תאי B, הצלחה קלינית עבור גידולים מוצקים כבר מאותגר על ידי גורמים מרובים כולל חדירה לקויה של תאי T9, microenvironment גידול מדכאחיסון 10, כיסוי אנטיגן וספציפיות, ותפקוד לקוי של תא CAR-T11,12 . מגבלה נוספת של הטיפול הנוכחי בתאי CAR-T כוללת שימוש בתאי T אוטולוגיים. לאחר סבבים מרובים של כימותרפיה ונטל גידול גבוה, תאי CAR-T יכולים להיות באיכות ירודה בהשוואה למוצרי CAR-T אלוגניים מתורמים בריאים בנוסף לזמן ולהוצאות הקשורים לייצור תאי CAR-T אוטולוגיים. עריכת גנים של מוצר תא CAR-T על ידי CRISPR/ Cas9 מייצגת אסטרטגיה חדשה להתגבר על המגבלות הנוכחיות של תאי CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 היא מערכת שני רכיבים שניתן להשתמש בה לעריכת גנום ממוקדת בתאי יונקים18,19. ה- Endonuclease Cas9 הקשור ל- CRISPR יכול לגרום להפסקות גדיל כפול ספציפיות לאתר בהנחיית RNAs קטנות באמצעות שיוך בסיס לרצף ה- DNA היעד20. בהיעדר תבנית תיקון, הפסקות גדיל כפול מתוקנות על-ידי נתיב ההצטרפות הלא-ההומולוגי (NHEJ) המועד לשגיאות, וכתוצאה מכך מוטציות של שינוי מסגרת או קודונים של עצירה מוקדמת באמצעות מוטציות הוספה ומחיקה (INDELs)19,20,21. יעילות, קלות שימוש, עלות-תועלת ויכולת לעריכת גנום מולטיפלקס הופכים את CRISPR/Cas9 לכלי רב עוצמה לשיפור היעילות והבטיחות של תאי CAR-T אוטולוגיים ואלוגניים. גישה זו יכולה לשמש גם לעריכת תאי TCR מכוונים TCR על-ידי החלפת מבנה הרכב ב- TCR. בנוסף, תאי CAR-T אלוגניים בעלי פוטנציאל מוגבל לגרום למחלות שתל לעומת מחלה מארחת יכולים להיווצר גם על ידי עריכת גנים של ה- TCR, b2m ו- HLA לוקוס.
בפרוטוקול זה, אנו מראים כיצד ניתן לשלב הנדסת CRISPR של תאי T עם משלוח וקטורי ויראלי בתיווך של CAR-Transgene כדי ליצור מוצרי תאי CAR-T בעריכת גנום עם יעילות ובטיחות משופרות. דיאגרמה סכמטית של התהליך כולו מוצגת באיור 1. באמצעות גישה זו, הדגמנו נוקאאוט גנים ביעילות גבוהה בתאי CAR-T אנושיים ראשוניים. איור 2A מתאר בפירוט את ציר הזמן של כל שלב לעריכה וייצור של תאי T. אסטרטגיות לעיצוב RNA מדריך ואימות נוקאאוט נדונות גם כדי ליישם גישה זו על גני יעד שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תאי T אנושיים נצברו באמצעות ליבת האימונולוגיה האנושית של אוניברסיטת פנסילבניה, הפועלת תחת עקרונות של תרגול מעבדה טובה עם נהלי הפעלה סטנדרטיים שנקבעו ו / או פרוטוקולים לקבלת מדגם, עיבוד, הקפאה וניתוח התואמים את הנחיות האתיקה של MIATA ואוניברסיטת פנסילבניה.
1. ייצור וקטורי לנטיוויראלי
הערה: המוצרים הנגיפיים הפכו לפגומים בשכפול על ידי הפרדת מבני אריזה (Rev, gag/pol/RRE, VSVg והעברת פלסמיד) לארבעה פלסמידים נפרדים, מה שמקטין מאוד את הסבירות לאירועי רקומבינציה שעלולים לגרום לווירוס המוסמך לשכפול.
- הכן תאי HEK293T יום אחד לפני ההדבקה. צלחת כ 6 x 106 תאים בכלי תרבות T150 ב 30 מ"ל של מדיה תרבותית סטנדרטית (המכונה R10:RPMI 1640 בתוספת 10% סרום עגל עוברי, 10 mM HEPES, 1% Pen / Strep, 1% L-גלוטמין) ודגרה לילה ב 37 °C. 18-24 שעות מאוחר יותר, תאים צריכים להיות 60-70% משפיעים ולהיראות בריאים (תחזיות דנדריטיות והפצה אחידה על פני הבקבוק). אם התאים נראים בריאים, המשך לשלב 1.2.
- הכן את תערובת ההדבקה המכילה ריאגנט ליפופקטיון (96 μL), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 מיקרוגרם), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-3) (18 מיקרוגרם), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 מיקרוגרם) פלסמידים אריזה ו-15 מיקרוגרם של ביטוי פלסמיד (CD19bbz scFv משובט ב- pTRPE).
- עבור כל תגובת טרנס-זיהום, הכינו צינור אחד המכיל 1 מ"ל של מדיה חיונית מינימלית בסרום מופחת בתוספת ארבעת הפלסמידים המתוארים בשלב 1.2, כמו גם צינור אחד המכיל 2 מ"ל של מדיה חיונית מינימלית בסרום מופחת בתוספת 90 μL של ריאגנט ליפוזיה. שלב שני פתרונות אלה על ידי תוספת dropwise של תערובת plasmid 1 מ"ל ל 2 מ"ל של תערובת ריאגנט ליפופקטיון. הקפד לערבב במרץ את הפתרון על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים. לדגור על הפתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- בינתיים, שאפו את המדיה מבקבוקון התא HEK293T ושטפו בעדינות תאים עם 10 מ"ל של מדיה חיונית מינימלית בסרום מופחת ושאפו שוב.
- מוסיפים בעדינות את תערובת הטרנספקטיון (3 מ"ל) משלב 1.2.1 לפינה התחתונה של בקבוקון תרבית התאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל. הטה בעדינות את הבקבוק כדי להפיץ באופן שווה את תערובת ההדבקה על פני בקבוקון תרבית התא ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הקפד לא להפריע לפולת התא. לאחר דגירה של 10 דקות, להוסיף 35 מ"ל של מדיה R10 ולהחזיר בקבוקון לחממה במשך 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, לאסוף את supernatant מן צלוחיות תרבית התא HEK293T ולעבור לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל. הוסף R10 טרי לתאי HEK29T והחזיר את התאים לאינקובטור למשך 24 שעות נוספות. סובבו את הסופר-נט (300 x g) כדי להסיר פסולת תאים ולסנן את ה-supernatant דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
- מרכז את הסינון מצעד 1.3 על-ידי אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה (25,000 x גרם למשך 2.5 שעות או 8000 x גרם לילה (O/N)). לאחסן את גלולה וירוס 24 שעות ב 4 °C (70 °F) בעת איגום הווירוס 48 שעות.
- חזור על שלבים 1.3-1.4 עבור אוסף 48 שעות ולשלב אוספים וירוסים 24 שעות ביממה ו 48 שעות. כדוריות מאוסף 48 שעות יכילו קציר משולב של הנגיף.
- גלולה ויראלית Resuspend בכ 1 מ"ל של R10 קר aliquot לתוך 100 בקבוקונים μL. מיד להקפיא את aliquots באמצעות קרח יבש ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
- חשב טיטר ויראלי פונקציונלי ביחידות טרנסדוקציה/mL על-ידי התמלת כמות קבועה של תאי T אנושיים ראשוניים המופעלים על-ידי CD3/CD28 עם דילול טורי של סופר-נטנטי lentiviral. מדוד את ה-CAR-Transduction לאחר 72 שעות על ידי ציטומטריית זרימה.
- כתם לרכב מכוון CD19 עם נוגדן נגד FCM63 scFv. עבור קולטני אנטיגן כימריים אחרים, כתם באמצעות חלבון רקומביננטי שכותרתו פלואורופור כי הוא ספציפי scFv CAR. דילול וירוסים שמייצר מתחת ל-20% תאים חיוביים של CAR על ידי ציטומטריית זרימה הוא הדילול המדויק ביותר לחישוב טיטר ויראלי ממנו. מעל 20% תאים חיוביים לרכב, הסיכוי של כל תא חיובי להיות transduced פעמיים עולה, וכתוצאה מכך לזלזל במספר החלקיקים transducing. חשב את יחידות ההחלמה לכל mL(TU/mL ) = (מספר התאים המועברים x אחוז CAR תאים חיוביים x גורם דילול)/(נפח התמחה ב- mL).
2. תכנון sgRNAs ושיבוש גנים בתאי T אנושיים ראשוניים
- עיצוב SgRNA של CRISPR
הערה: מספר שרתים ותוכניות מקלים על העיצוב של sgRNA ספציפיים למטרה. בפרוטוקול זה, SgRNAs CRISPR תוכננו באמצעות CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no), ואת פורטל העיצוב gRNA ממכון ברוד (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- עבור כל גן יעד, עצב שישה עד עשרה רצפי sgRNA כדי למקד רצפי אקסון קידוד מוקדם.
הערה: sgRNA צריך להיות יעילות גבוהה על היעד ויעילות נמוכה של היעד. כל אלגוריתם למידת מכונה לקביעת יעילות sgRNA פועל מעט אחרת. לכן, מומלץ להשוות בין כלי עיצוב sgRNA מרובים ולאצור רשימה של שישה עד עשרה sgRNA להקרנה.
- עבור כל גן יעד, עצב שישה עד עשרה רצפי sgRNA כדי למקד רצפי אקסון קידוד מוקדם.
- הפרעה גנטית בתאי T אנושיים ראשוניים
- להשיג תאים מונונוקלאריים אוטומטיים של דם היקפי (PBMC) מתורמים מתנדבים בריאים. ציר זמן סכמטי של הפרוטוקול מתואר באיור 2A ומתואר להלן.
- בודד את CD4+ ו- CD8+ תאי T באמצעות ערכות בחירה זמינות מסחרית CD4 ו- CD8.
- שלב CD4+ ו- CD8+ תאי T ביחס של 1:1 ודגרה למשך הלילה ב- 3x106 תאים /מ"ל ב- R10 בתוספת 5 ng/mL huIL-7 ו- huIL-15 כל אחד. תוספת של IL-7 ו- IL-15 מומלצת מכיוון שהם ידועים בקידום פנוטיפ זיכרון מרכזי ותאי CAR-T מורחבים עם IL-7 ו- IL-15 יש יעילות מעולה נגד גידולים בהשוואה לתאי CAR-T מורחבים IL-22,23,24.
- למחרת, לספור תאי T וצנטריפוגה 5-10 x 106 תאים ב 300 x g במשך 5 דקות. יש להשליך את כל ה-supernatant ולשטוף את גלולה התא במינימום-סרום. Resuspend הכדור ב 100 μL של פתרון נוקלאוfection על פי הוראות היצרן (טבלת החומרים).
- בעת שטיפת התאים, להכין מתחם ריבונוקליאופרוטאין (RNP) עם Cas9 ו- gRNA על ידי דגירה של 10 מיקרוגרם של נוקלאז Cas9 עם 5 מיקרוגרם של sgRNA במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). היחס הטוחן של Cas9 ל sgRNA הוא 1:2.4. מומלץ לשלוט בדמה המכיל Cas9 ומשפר אלקטרופורציה, אך ללא sgRNA.
הערה: ניתן לבצע עריכת גנים Multiplex בשלב זה על-ידי יצירת מתחמי RNP עבור כל יעד בנפרד ושילובם עם תאים בזמן נוקלאופקטציה כמתואר בשלב הבא. בחירת ריאגנטים להרכיב את מתחם RNP הם המפתח כדי לקבל יעילות KO גבוהה. לדוגמה, גרעיני Cas9 מספקים שונים יש השפעות שונות מחוץ למטרה ו gRNA שונה כימית להקטין את הרעילות לתאי T, ובכך להגדיל את יעילות KO. - שלב את התאים המופנים מחדש משלב 2.2.4 עם קומפלקס RNP משלב 2.2.5 והוסף 4.2 μL של משפר אלקטרופורציה 4 מיקרומטר (ssDNA oligonucleotide שאינו הומולוג לגנום האנושי). מערבבים היטב ומעבירים לקובטות אלקטרופורציה. הימנע בועות כפי שהם פוגעים יעילות electroporation.
- תאי אלקטרופוראט באמצעות קוד דופק EH111. לאחר אלקטרופורציה, תאי דגירה ב R10 בתוספת 5 ng/mL huIL-7 ו huIL-15 ב 5x106 תאים / מ"ל ב 30 °C (48 שעות ב 12-טוב צלחות. לאחר 48 שעות, המשך עם הפעלה והרחבה של תאי T.
3. הפעלת תאי T, טרנסדוקציה והרחבה לנטיוויראליים
הערה: עבור הקרנת sgRNA של, טרנסדוקציה lentiviral (שלב 3.2) של מבנה המכונית אינו הכרחי.
- לספור תאי T אלקטרופורציה לדלל לריכוז של 1 x 106 תאים / מ"ל באמצעות R10 חם בתוספת 5 ng / mL huIL-7 ו huIL-15. הפעל תאים על-ידי הוספת נוגדנים חד-שבטיים נגד CD3/אנטי-CD28 מצופים חרוזים מגנטיים ביחס של 3 חרוזים לכל תא T חי.
הערה: אלקטרופורציה גורמת למוות תאים משמעותי וכתוצאה מכך בערך 60% ± 15% תאים קיימא לעומת תאים שאינם אלקטרופורציה. השתמש בספירת תאים חיים/מתים כדי לקבוע את הכמות המתאימה של חרוזים. מעבירים את התאים ל-37 מעלות צלזיוס ודגרים בן לילה. - לאחר גירוי בן לילה, החליש תאי T מהונדסים על-ידי CRISPR עם על-טבעי לנטיוויראלי מהשלב 1. הוסף את הנפח המתאים בהתבסס על טיטר ויראלי מחושב בשלב 1.7 כדי להשיג ריבוי של זיהום (MOI) של 3 ותאי דגירה עבור 72 שעות ב 37 °C (7 °F).
הערה: גלולה וירוס resuspended ב R10 הוא פשוט מתווסף על גבי התאים על פי ריכוז התא, טיטר ויראלי, ו MOI הרצוי. - לאחר 72 שעות, להאכיל תאים עם 50% של נפח התרבות הנוכחי R10 המכיל 10 ng / mL huIL-7 ו huIL-15 ולהחזיר אותם לחממה במשך 48 שעות נוספות. אל תפריע לאשכולות שנוצרו בין תאי ה- T לבין החרוזים.
- לאחר 48 שעות, להסיר את החרוזים מהתאים על ידי שימוש חוזר בעדינות תערובת חרוזי התא ואחריו הפרדה מגנטית. לספור תאים לאחר הסרת חרוזים ולהביא לריכוז של 0.8 x 106 תאים / מ"ל באמצעות R10 בתוספת 5 ng/ mL huIL-7 ו huIL-15. לאחר ביטול החרוזים, מספרי התאים צריכים להיות דומים לספירת התאים ביום הראשון לפני האלקטרופורציה(איור 2B).
- לאחר 24 שעות, לספור תאים להאכיל לריכוז של 1 x 106 תאים / מ"ל עם R10 + 5 ng / mL huIL-7 ו huIL-15. חזור על זה כל 24 שעות עד קינטיקה צמיחה וגודל התא להפגין תאים נחו מגירוי.
הערה: מנקודה זו, תאי T מכפילים בערך כל 24 השעות. תאי T עוברים בדרך כלל הכפלת אוכלוסייה של 5-7 ויש להם נפח תא של כ -300 ± 50 fL כאשר נח. - לאחר שנח, סובבו למטה תאי CAR-T מהונדסים של CRISPR ועבדו מחדש במדיה קפואה (1:1 X-Vivo ו- FBS בתוספת 10% DMSO) לצורך שימור קריופרציה. תאי CAR-T המשמשים צריכים להיות מופשרים ונחו ב 37 °C (50 °F) במשך 16 שעות לפני ניסוי.
הערה: שמור כ- 10x106 תאים השמורים למדידת יעילות נוקאאוט ואינטגרציית רכב. הכפלת האוכלוסייה הצפויה ושינויי נפח במהלך ההרחבה הוצגו באיור 2B, 2C. בנוסף, איור 2D מציג רמות של ביטוי CAR הן בתאי CAR-T בעריכה של Mock והן בתאי CAR-T ערוכים גנטית.
4. יעילות CRISPR
- מיצוי דנ"א גנומי והגברת גנים ממוקדים
- מכל תרבית הקרנה, ספין למטה 3-5 x 106 תאי T. תאים יכולים להיות קפואים כמו גלולה יבשה או אחד יכול להמשיך עם מיצוי DNA גנומי. בזמן מיצוי DNA, resuspend כדורי 200 μL של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ולהפיק DNA גנומי מתאים אלקטרופורציה באמצעות ערכת מיצוי DNA סטנדרטית על פי הוראת היצרן.
- בקצרה, יש ללקק תאים עם פרוטאינאז K ולטעון ליסאט על עמודת כריכת DNA. במהלך צנטריפוגה, DNA מחייב את הממברנה בעוד מזהמים יעברו. לאחר שני שלבי כביסה להסרת מזהמים ומעכבי אנזימים שנותרו, יש לחמוק מהדנ"א במים.
- להגביר 200-300 ננוגרם של DNA גנומי באמצעות תערובת PCR סטנדרטית המכילה פולימראז DNA, חלבונים אביזר, מלחים, dNTPs ו 10 μM קדימה והפוך פריימרים לאגף את האזור של שבירת גדיל כפול המיועד.
הערה: עבור עיצוב פריימר PCR, רצף הגנומי הפניות (ניתן למצוא באמצעות http://www.ensemble.org) אגף אתר gRNA לחתוך מוזנים לתוך כלי פיצוץ פריימר NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). פריימרים PCR צריך להיות מתוכנן כך אמפליסון יש גודל יעד של 600-700bp. אורך זה מאפשר לעצב פריימרים ריצוף כי להיקשר בתוך אמפליסון עם מרחק מספיק מאתר לחתוך gRNA (לפחות 150 bp) כדי להבטיח איכות רצף טובה סביב Indels המושרה Cas9 (ראה 4.2.1). כל gRNA דורש זוג פריימר ייחודי, אלא אם כן אתרי חיתוך gRNA נמצאים בסמיכות. - הפעל את כל מוצר ה- PCR על ג'ל אגרוז 1% וטהר את האמפליקון באמצעות ערכת טיהור ג'ל אגרוז סטנדרטית.
הערה: התהליך של קביעת Tm האופטימלי עבור PCR יכול לקחת סבבים מרובים של פתרון בעיות. הסיבה לכך היא שלרצף KO יש נדידה וגינו היעד צריך להיות מוכן לרצף שבו לא יהיו indels בדרך כלל 100 bp במעלה הזרם או במורד הזרם של אתר החיתוך. זה יכול להשתנות במידה רבה עקב indels הנובעים הצטרפות קצה לא הומולוגי. עיצוב פריימרים מקוננים רצף פריימרים PCR והגברת הריכוז של רצף המוצר יכול למנוע בעיות עם רצף.
- מכל תרבית הקרנה, ספין למטה 3-5 x 106 תאי T. תאים יכולים להיות קפואים כמו גלולה יבשה או אחד יכול להמשיך עם מיצוי DNA גנומי. בזמן מיצוי DNA, resuspend כדורי 200 μL של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ולהפיק DNA גנומי מתאים אלקטרופורציה באמצעות ערכת מיצוי DNA סטנדרטית על פי הוראת היצרן.
- רצף וזיהוי אי-גילוי
- עצב פריימרים לרצף שנקשרים לגבר הג'ל המטוהר ושולחים אמפליקולים מדומים ונוקאאוטים לרצף סנגר. לאחר השלמת הרצף, העלה את קבצי המעקב לתוכנת גנטיקה שולחנית (tide.deskgen.com, גנטיקה שולחנית) לניתוח TIDE.
- לרצף עיצוב פריימר, הזן את הרצף של אמפלייקון PCR לתוך תוכנת עיצוב פריימר סטנדרטית (NCBI, Eurofins או כלים אחרים הזמינים לציבור). תוכנת העיצוב תציע רצפי פריימר מרובים המתאימים לרצף sanger.
- בחר פריימרים קדמיים והופכים שנקשרים בתוך האמפליקון לפחות 150 bp במעלה הזרם או במורד הזרם של אתר חיתוך gRNA כדי להבטיח איכות רצף טובה סביב indels. כרומטוגרמה ריצוף ישמש 4.2 לניתוח TIDE, ולכן חשוב כי איכות הרצף טובה עבור פירוק לא מדויק (ראה Hultquist ואח'). 25.
- השתמש בניתוח TIDE (מעקב אחר Indels by DEcomposition) כדי לזהות יעילות נוק-אאוט (KO) ברמה הגנומית26. האלגוריתם משחזר במדויק את הספקטרום של indels מעקבות הרצף ומחשב ערכי R2, המשקף את טוב ההתאמה לאחר מידול ליניארי לא שלילי על ידי תוכנת הגאות והשפל.
- עצב פריימרים לרצף שנקשרים לגבר הג'ל המטוהר ושולחים אמפליקולים מדומים ונוקאאוטים לרצף סנגר. לאחר השלמת הרצף, העלה את קבצי המעקב לתוכנת גנטיקה שולחנית (tide.deskgen.com, גנטיקה שולחנית) לניתוח TIDE.
- זיהוי חלבון יעד
- עבור גנים ממוקדים שמוצר הגנים שלהם מתבטא על פני השטח של תאי T, מכתימים כ-1 x 105 תאים מכל תרבית הקרנה עם נוגדן מתויג פלואורוכרום הספציפי לחלבון היעד. השווה את רמות הביטוי של חלבון היעד בין קבוצות השליטה המדומה לבין קבוצות הנוקאאוט לפי ציטומטריית זרימה כפי שמוצג באיור 3A,3B.
- עבור גנים ממוקדים שמוצר הגנים שלהם מתבטא באופן תאי, lyse כ 3 x 106 מיליון תאים לכל קבוצת הקרנה במאגר תמוגה ופעל לפי פרוטוקולים סטנדרטיים עבור SDS-PAGE וחולצה מערבית. לחלופין, ניתן להשתמש בציטומטריית זרימה תאית או תאית כדי לחפש את חלבון היעד.
5. ניטור אפקטים מחוץ למטרה באמצעות iGUIDE - הכנת ספריה, ריצוף DNA וניתוח
הערה: טכניקת iGUIDE מאפשרת לזהות מיקומים של מחשוף מונחה Cas9 ולכומת את ההפצות של הפסקות כפולות DNA אלה.
- בצע iGUIDE כפי שתואר על ידי נובלס ואח'21. ההשפעות מחוץ למטרה של sgRNA מיקוד לוקוס TRAC באמצעות טכניקת iGUIDE הוצגו Stadtmauer ואח ', 202013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מתארים כאן פרוטוקול להנדס גנטית תאי T, שניתן להשתמש בהם כדי ליצור הן תאי CAR-T אוטולוגיים ואלוגניים, כמו גם תאי TCR מנותבים מחדש.
איור 1 מספק תיאור מפורט של השלבים המעורבים בתהליך ייצור תאי T ערוכים CRISPR. התהליך מתחיל על ידי עיצוב sgRNA לגן העניין. ברגע sgRNA מעוצבים מסונתזים הם משמשים לאחר מכן כדי להפוך מתחמי RNP עם חלבון Cas המתאים. תאי T מבודדים מתורם בריא או ממתחמי רנ"פ מטופלים מועברים על ידי אלקטרופורציה או נוקלאופקט. לאחר העריכה, תאי ה- T מופעלים ומועברים עם קידוד וקטור lentiviral עבור המכונית או מבנה TCR. לאחר ההפעלה, תאי T מורחבים בתרבית והקפאה שמורה למחקרים עתידיים. הפרוטוקול המפורט שנרשם במעבדה מתואר באיור 2. במהלך ההרחבה, מתבצע מעקב אחר הכפלת האוכלוסייה ושינויי אמצעי האחסון לאורך הפרוטוקול ודוגמה מוצגת באיור 2B וב- C עבור תאי CAR-T מדומים וערוכים כאחד. איור 2B,C מראה כי KO של גן העניין לא גרם לשינויים משמעותיים בשגשוג ובהפעלה במהלך ההתרחבות. תוצאות אלה, עם זאת, תלויות בגן היעד שנערך ולכן עשויות או לא עשויות להוביל לשינויים בשגשוג ובהרחבה.
לאחר התאים cryopreserved, רמות של ביטוי CAR נקבעים גם למחקרים פונקציונליים נוספים. במקרה זה, כפי שמוצג באיור 2D בדקנו את ביטוי CD19 CAR הן בתאי Mock ערוך והן בתאי KO CAR-T ולא ראינו שינויים משמעותיים. זה יהיה תלוי שוב בגן העניין שנערך. לבסוף, יעילות KO ניתן לקבוע באמצעות טכניקות מרובות כגון ציטומטריית זרימה כתם מערבי לזיהוי רמת חלבון וגם רצף סנגר לזיהוי רמת הגן של KO. איור 3A ו- 3B מציגים עלילות ציטומטריית זרימה מייצגות שבהן PDCD1 ו- TRAC לוקוס ממוקדים באמצעות sgRNA, המציגים יעילות של 90% עבור SGRNA PDCD1 ו-98% עבור TRAC sgRNA על פני תורמים בריאים מרובים. לכן, פרוטוקול זה יכול להשיג נוקאאוט יעילות גבוהה עם אובדן מינימלי הכדאיות.
איור 1. דיאגרמה סכמטית המציגה עריכת תאי T באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas9 וייצור של תאי CAR-T אנושיים ראשוניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. הרחבת תאי CAR-T ערוכים והכפלת האוכלוסייה שלהם. (A)ציר הזמן של עריכה וייצור CRISPR בתאי CART אנושיים ראשוניים. (B)הכפלת אוכלוסין בתאי CD19 CAR-T ערוכים של Mock ו- CRISPR שנמדדו באמצעות מונה קולטר במהלך התרחבות תאי CAR-T (n = 3 תורמים בריאים; KO = נוקאאוט) (C) גודל תא (μm3) נמדד באמצעות מונה קולטר במהלך התרחבות תאי CAR-T (n = 3 תורמים בריאים). (D)עלילות ציטומטריית זרימה מייצגות המציגות כתמי רכב וממוצע בתורמים מרובים המציגים ביטוי CAR בתאי CAR-T מדומים וערוכים כאחד. ביטוי CAR זוהה באמצעות נוגדן אנטי אידיוטי התידד לפלורופור מגודר על לימפוציטים / סינגלים / תאים חיים (n = 3 תורמים בריאים, UTD = untransduced,). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. אפיון יעילות KO בתאי CAR-T ערוכים באמצעות ציטומטריית זרימה. (A)חלקות ציטומטריה זרימה מייצגת המציגות כתמי PD-1 וממוצע בתורמים מרובים המציגים יעילות PD-1 KO באמצעות gRNA המתמקד בלוקוס TRAC בתאי CAR-T מדומים וערוכים. ביטוי PD-1 זוהה באמצעות נוגדן PD-1 (Clone EH12.2H7) מצומד לפלורופור ומגולגל בלימפוציטים/סינגלים/תאים חיים (n=3 תורמים בריאים). קווי שגיאה מציינים שגיאה ממוצעת±עמידה של הממוצע (SEM). p<0.0001, *** p = 0.0005, ** p = 0.001 על ידי מבחן t של וולש. (B)התוויות ציטומטריית זרימה מייצגות המציגות כתמי CD3 וממוצע בתורמים מרובים המציגים יעילות CD3 KO באמצעות gRNA המתמקד בלוקוס TRAC בתאי CAR-T מדומים וערוכים. ביטוי CD3 זוהה באמצעות נוגדן CD3 (Clone OKT3) מצומד לפלורופור וגודר על לימפוציטים / סינגלים / תאים חיים (n = 3 תורמים בריאים). קווי שגיאה מציינים שגיאה ממוצעת±עמידה של הממוצע (SEM). p<0.0001, *** p = 0.0005, ** p = 0.001 על ידי מבחן t של וולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים גישות לעריכת תאי CAR-T בגנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas9 וייצור מוצרים לבדיקה נוספת לתפקוד ויעילות. הפרוטוקול לעיל עבר אופטימיזציה לביצוע עריכת גנים CRIPSR בתאי T אנושיים ראשוניים בשילוב עם תאי T הנדסיים עם קולטני אנטיגן כימריים. פרוטוקול זה מאפשר יעילות נוקאאוט גבוהה עם שונות מינימלית בין תורם לתורם. שינוי באמצעות CRISPR יכול לשפר הן את היעילות והן את הבטיחות של תאי CAR-T על ידי ביטול קולטנים המעכבים את תפקוד תאי T וייצור תאי CAR-T אלוגניים.
עבור פרוטוקולי הרחבה בקנה מידה קטן, החלמ-10 6 תאים לכל קבוצה מוביל לכ-500 תאי CAR-T עם ממוצע של 6 מכפילים אוכלוסיה בתורם נורמלי בריא. עם זאת, זה יכול להשתנות בהתאם אם הגן של עניין משפיע על הפעלת תא T, transduction והתפשטות. חמש מאות מיליון תאים מספיקים לאישור יעילות KO, במבחנה ובצ'קים של ויוו. קיימות וריאציות שונות לפרוטוקול שבו ניתן לבצע עריכת CRISPR לפני או אחרי ההפעלה והעברת רכב. רן ואח ' תיאר וריאציה אחת כזו שבה תאים נערכים לאחר גירוי חרוזים ו- CAR-Transduction15. היתרון של עריכת CRISPR לפני גירוי חרוזים הוא כמויות תאים נמוכות יותר צריך להיות ערוך מאז תאי T עדיין לא התרבו, מה שהופך את ההליך פחות זמן רב יותר חסכוני. בנוסף, ביצוע עריכה מראש ניתן לתרגום ישיר למרפאה. למעשה, צעדים רבים בפרוטוקול זה עודכנו על ידי מה ניתן לאמץ במרפאה אשר מגביר את העקביות של יעילות KO בעת מעבר מספסל למיטה.
ישנם משתנים מרובים שניתן לבחור בכל שלב של הפרוטוקול. לדוגמה, תאי T יכולים להיות אלקטרופוריים או נוקליאודבקים. בעוד שניהם להשיג יעילות KO דומה, מניסיוננו באמצעות nucleofector יש כדאיות גבוהה יותר לאחר עריכה ולכן הוא מועדף. עם זאת, שימוש באלקטרופורטור עשוי להתברר כחסכוני יותר בטווח הארוך. שני ציוד אלה משמשים להרחבות תאי T בקנה מידה קטן. להרחבות בקנה מידה גדול ובקנה מידה קליני, יש למטב מחדש את הפרוטוקולים לביצוע עריכה ודורש ציוד שונה עבור נוקלאופקטיון. ישנן פלטפורמות טכנולוגיות מרובות שניתן להשתמש בהן הן עבור עריכה והתרחבות בקנה מידה גדול בהתאם לצרכי המשתמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין גילויים.
Acknowledgments
אנו מכירים בליבת אימונולוגיה אנושית על אספקת תאי T תורמים רגילים ואת ליבת Cytometry הזרימה באוניברסיטת פנסילבניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
