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Immunology and Infection

मानव CRISPR-इंजीनियर कार-टी कोशिकाओं का उत्पादन

Published: March 15, 2021 doi: 10.3791/62299
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम कार-टी कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए CRISPR कैस प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में जीन संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

क दत्तक कोशिका चिकित्सा चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं (कार-टी कोशिकाओं) का उपयोग कर हेमेटोलॉजिकल घातक के साथ रोगियों में उल्लेखनीय नैदानिक प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है और वर्तमान में विभिन्न ठोस ट्यूमर के लिए जांच की जा रही है । कार-टी कोशिकाओं को एक मरीज के रक्त से टी कोशिकाओं को हटाने और उन्हें इंजीनियरिंग करने के लिए एक सिंथेटिक प्रतिरक्षा रिसेप्टर है कि टी कोशिकाओं को पहचानने और लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए redirects व्यक्त करने के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं । कार-टी कोशिकाओं के जीन संपादन में वर्तमान कार-टी सेल चिकित्सा की सुरक्षा में सुधार करने और कार-टी कोशिकाओं की प्रभावकारिता को और बढ़ाने की क्षमता है । यहां, हम मानव CRISPR-इंजीनियर CD19 निर्देशित कार-टी कोशिकाओं की सक्रियता, विस्तार और लक्षण वर्णन के तरीकों का वर्णन करते हैं। इसमें कार लेंटीवायरल वेक्टर का लेनदेन और टी कोशिकाओं में रुचि के जीन को लक्षित करने के लिए एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) और Cas9 एंडोन्यूलेज का उपयोग शामिल है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों को सार्वभौमिक रूप से इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों से परे अन्य कार निर्माण और लक्ष्य जीन पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल ग्रेना डिजाइन, लीड जीआरएनए चयन और नैदानिक ग्रेड मानव टी कोशिकाओं के उच्च दक्षता, मल्टीप्लेक्स CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग को पुन: उत्पन्न करने के लिए जीन नॉकआउट सत्यापन के लिए रणनीतियों पर चर्चा करता है।

Introduction

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -टी सेल थेरेपी ने दत्तक कोशिका चिकित्सा और कैंसर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। कार-टी-कोशिकाएं एक सिंथेटिक प्रतिरक्षा रिसेप्टर को व्यक्त करने वाली टी-कोशिकाओं को इंजीनियर करती हैं जो टीसीआर्ज़ेटा श्रृंखला से प्राप्त संकेत डोमेन के साथ एक एंटीजन-विशिष्ट एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़े को जोड़ती है और टी-सेल सक्रियण और सह-उत्तेजना1,2,3,4 के लिए आवश्यक और पर्याप्त डोमेन है। . कार-टी कोशिकाओं का निर्माण रोगी की अपनी टी-कोशिकाओं को निकालने से शुरू होता है, जिसके बाद कार मॉड्यूल के पूर्व वीवो वायरल ट्रांसडक्शन और चुंबकीय मोतियों के साथ कार-टी सेल उत्पाद का विस्तार होता है जो कृत्रिम एंटीजन पेश कोशिकाओं के रूप में कार्य करता है5। विस्तारित कार-टी कोशिकाओं को रोगी में फिर से संचार किया जाता है जहां वे एनग्रेफ्ट कर सकते हैं, लक्षित ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म कर सकते हैं और यहां तक किजलसेक6,7,8के बाद कई वर्षों तक बने रहते हैं। हालांकि कार-टी सेल थेरेपी बी-सेल घातक में उल्लेखनीय प्रतिक्रिया दरों में हुई है, ठोस ट्यूमर के लिए नैदानिक सफलता गरीब टी सेल घुसपैठ9,एक इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट10,एंटीजन कवरेज और विशिष्टता, और कार-टी सेल शिथिलता11,12 सहित कई कारकों द्वारा चुनौती दी गई है . वर्तमान कार-टी सेल थेरेपी की एक और सीमा में ऑटोलॉगस टी-कोशिकाओं का उपयोग शामिल है। कीमोथेरेपी और उच्च ट्यूमर बोझ के कई दौर के बाद, कार-टी कोशिकाओं के समय और autologous कार टी कोशिकाओं के निर्माण के साथ जुड़े खर्च के अलावा स्वस्थ दाताओं से एलोजेनिक कार टी उत्पादों की तुलना में खराब गुणवत्ता की हो सकती है । CRISPR/Cas9 द्वारा कार-टी सेल उत्पाद का जीन-संपादन कार-टी कोशिकाओं13, 14, 15,16,17की वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए एक नई रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है ।

CRISPR/Cas9 एक दो घटक प्रणाली है जिसका उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं18,19में लक्षित जीनोम संपादन के लिए किया जा सकता है । CRISPR से जुड़े एंडो न्यूक्लियीज Cas9 लक्ष्य डीएनए अनुक्रम20के साथ आधार-बांधना के माध्यम से छोटे आरएनए द्वारा निर्देशित साइट-विशिष्ट डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित कर सकता है । मरम्मत टेम्पलेट के अभाव में, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत त्रुटि प्रवण गैर-होम्योपैथी अंत जुड़ने (एनएचईजे) मार्ग द्वारा की जाती है, जिसकेपरिणामस्वरूप 19,20,21के दौरान डालने और विलोपन म्यूटेशन (INDELs) के माध्यम से फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन या समय से पहले बंद हो जाते हैं। दक्षता, उपयोग में आसानी, लागत प्रभावशीलता और मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन की क्षमता CRISPR/Cas9 को ऑटोलॉगस और एलोजेनिक कार-टी कोशिकाओं की प्रभावकारिता और सुरक्षा को बढ़ाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाती है । इस दृष्टिकोण का उपयोग टीसीआर के साथ कार निर्माण को बदलकर टीसीआर निर्देशित टी कोशिकाओं को संपादित करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एलोजेनिक कार-टी कोशिकाओं जिनमें भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग पैदा करने की सीमित क्षमता है, उन्हें टीसीआर, बी2एम और एचएलए लोकस के जीन संपादन द्वारा भी उत्पन्न किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम दिखाते हैं कि कैसे टी कोशिकाओं के CRISPR-इंजीनियरिंग को बढ़ी हुई प्रभावकारिता और सुरक्षा के साथ जीनोम-संपादित कार-टी सेल उत्पादों को उत्पन्न करने के लिए कार-ट्रांसजीन के वायरल वेक्टर मध्यस्थता वितरण के साथ जोड़ा जा सकता है। पूरी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में दिखाया गयाहै । इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने प्राथमिक मानव कार-टी कोशिकाओं में उच्च दक्षता वाले जीन नॉकआउट का प्रदर्शन किया है। चित्रा 2A टी कोशिकाओं के संपादन और विनिर्माण के लिए प्रत्येक चरण की समयरेखा का विस्तार से वर्णन करता है। गाइड आरएनए डिजाइन और नॉकआउट सत्यापन के लिए रणनीतियों पर भी विभिन्न लक्ष्य जीन के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करने पर चर्चा कर रहे हैं ।

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Protocol

मानव टी कोशिकाओं पेंसिल्वेनिया मानव इम्यूनोलॉजी कोर है, जो स्थापित मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं और/या नमूना रसीद, प्रसंस्करण, ठंड के लिए प्रोटोकॉल के साथ अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास के सिद्धांतों के तहत संचालित के माध्यम से खरीदा गया था, और विश्लेषण MIATA और पेंसिल्वेनिया नैतिकता के दिशा निर्देशों के विश्वविद्यालय के अनुरूप ।

1. लेंटीवायरल वेक्टर उत्पादन

नोट: वायरल उत्पादों को चार अलग प्लाज्मिड में पैकेजिंग संरचनाओं (रेव, गैग/पोल/आरआरई, वीएसवीजी और ट्रांसफर प्लाज्मिड) को अलग करके प्रतिकृति-दोषपूर्ण बना दिया गया है, जिससे पुनर्संयोजन की घटनाओं की संभावना बहुत कम हो जाती है जिसके परिणामस्वरूप प्रतिकृति-सक्षम वायरस हो सकता है ।

  1. ट्रांसफैक्शन से एक दिन पहले HEK293T कोशिकाओं को तैयार करें। मानक संस्कृति मीडिया के 30 एमएल में T150 संस्कृति जहाजों में लगभग 6 x 106 कोशिकाओं की प्लेट (जिसे R10 के रूप में संदर्भित किया जाता है: आरएमआई 1640 10% भ्रूण बछड़े सीरम के साथ पूरक, 10 mM HEPES, 1% कलम/स्ट्रेप, 1% एल-ग्लूटामाइन) और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट 18-24 घंटे बाद, कोशिकाओं को 60-70% ढुलमुल होना चाहिए और स्वस्थ दिखना चाहिए (फ्लास्क में डेंड्रिटिक अनुमान और यूनिफॉर्म डिस्ट्रीब्यूशन)। यदि कोशिकाएं स्वस्थ दिखती हैं, तो 1.2 चरण के लिए आगे बढ़ें।
  2. लिपोफेक्शन रीएजेंट (96 माइक्रोन), पीटीआरपी गैग/पोल (Lot # RR13EP19A) (18 माइक्रोग्राम), पीटीआरपी आरएसवी-रेव (लॉट # RR13SEP19B-3) युक्त ट्रांसफैक्शन मिक्स तैयार करें (18 μg), pTRP VSVG (Lot # RR13SEP19C) (7 μg) पैकेजिंग प्लाज्मिड और 15 माइक्रोग्राम अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (CD19bbz scFv pTRPE में क्लोन) ।
    1. प्रत्येक ट्रांसफेक्शन रिएक्शन के लिए, कम-सीरम न्यूनतम आवश्यक मीडिया के 1 एमएल युक्त एक ट्यूब तैयार करें और साथ ही चरण 1.2 में वर्णित चार प्लाज्मिड के साथ-साथ एक ट्यूब जिसमें कम-सीरम न्यूनतम आवश्यक मीडिया के 2 एमएल के साथ-साथ 90 माइक्रोन लिपोफेक्शन रीएजेंट शामिल हैं। इन दोनों समाधानों को 1 एमएल प्लाज्मिड मिश्रण के ड्रॉपवाइज इसके अलावा लिपोफेक्शन रीएजेंट मिक्स के 2 एमएल में मिलाएं। कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समाधान को तेजी से मिलाना सुनिश्चित करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए समाधान को इनक्यूबेट करें।
    2. इस बीच, HEK293T सेल फ्लास्क से मीडिया को आकांक्षी करें और धीरे-धीरे कम-सीरम न्यूनतम आवश्यक मीडिया के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं और फिर से एस्पिरेट करें।
    3. धीरे-धीरे 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सेल कल्चर फ्लास्क के नीचे के कोने में स्टेप 1.2.1 से ट्रांसफैक्शन मिक्स (3 एमएल) जोड़ें। धीरे से फ्लास्क झुकाव समान रूप से सेल संस्कृति फ्लास्क भर में ट्रांसफेक्शन मिश्रण वितरित करने के लिए और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट । सेल मोनोलेयर को परेशान न करें। 10 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, R10 मीडिया के 35 एमएल जोड़ें और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में फ्लास्क वापस करें।
  3. 24 घंटे के बाद, HEK293T सेल कल्चर फ्लास्क से सुपरनैंट इकट्ठा करें और 50 एमएल शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करें। HEK29T कोशिकाओं में ताजा R10 जोड़ें और कोशिकाओं को एक और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया । सेल मलबे को हटाने और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सुपरनैंट को फ़िल्टर करने के लिए सुपरनैंट (300 x ग्राम) को स्पिन करें।
  4. हाई-स्पीड अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन (2.5 घंटे या 8000 एक्स ग्राम ओवरनाइट (ओ/एन)) के लिए 25,000 एक्स ग्राम) द्वारा चरण 1.3 से फिल्ट्रेट को केंद्रित करें। 48 घंटे के वायरस को पूल करते हुए 24 एच वायरस पेलेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 48 एच संग्रह के लिए 1.3-1.4 चरण दोहराएं और 24 एच और 48 एच वायरस संग्रह को जोड़ें। 48 एच संग्रह से छर्रों लेंटीवायरस की एक संयुक्त फसल शामिल होंगे।
  6. कोल्ड आर 10 के लगभग 1 मिलील में वायरल गोली को फिर से 10 और एलिकोट में 100 माइक्रोन शीशियों में रीसुस्पेंड करें। तुरंत स्नैप सूखी बर्फ का उपयोग कर aliquots फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  7. लेंटीविरायल सुपरनेटेंट के धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ सीडी 3/सीडी28 मनका-सक्रिय प्राथमिक मानव टी-कोशिकाओं की एक निश्चित राशि को स्थानांतरित करके ट्रांसड्यूरिंग इकाइयों/एमएल में कार्यात्मक वायरल टाइटर की गणना करें । प्रवाह-साइटोमेट्री द्वारा 72 घंटे के बाद कार-ट्रांसडक्शन को मापें।
    1. CD19 के लिए दाग-एक विरोधी FCM63 scFv एंटीबॉडी के साथ कार निर्देशित । अन्य चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर्स के लिए, फ्लोरोफोर-लेबल वाले रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन का उपयोग करके दाग जो कार एससीएफवी के लिए विशिष्ट है। वायरस कमजोर पड़ने कि प्रवाह-साइटोमेट्री द्वारा 20% कार सकारात्मक कोशिकाओं के तहत उत्पन्न करता है से वायरल टाइटर की गणना करने के लिए सबसे सटीक कमजोर पड़ने है। 20% से ऊपर कार सकारात्मक कोशिकाओं, प्रत्येक सकारात्मक कोशिका के लिए मौका दो बार बढ़ जाती है, ट्रांसड्यूरिंग कणों की संख्या का एक अनुमान में जिसके परिणामस्वरूप । प्रति एमएल (टीयू/एमएल) प्रति ट्रांसड्यूरिंग इकाइयों की गणना करें = (कोशिकाओं की संख्या एक्स प्रतिशत कार पॉजिटिव कोशिकाओं एक्स कमजोर पड़ने कारक) /

2. प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में एसजीआरएनए और जीन व्यवधान की डिजाइनिंग

  1. डिजाइन कर रहा है CRISPR sgRNA
    नोट: कई सर्वर और कार्यक्रम लक्ष्य-विशिष्ट एसजीआरएनए के डिजाइन की सुविधा प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, CRISPR sgRNAs को CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) और व्यापक संस्थान (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) से जीआरएनए डिजाइन पोर्टल का उपयोग करके डिजाइन किया गया था।
    1. प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए, जल्दी कोडिंग एक्सोन दृश्यों को लक्षित करने के लिए छह से दस sgRNA दृश्यों डिजाइन ।
      नोट: SgRNA उच्च पर लक्ष्य प्रभावकारिता और कम लक्ष्य प्रभावकारिता होना चाहिए । SgRNA प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक मशीन लर्निंग एल्गोरिथ्म थोड़ा अलग ढंग से काम करता है। इसलिए, स्क्रीनिंग के लिए छह से दस sgRNA की सूची को क्यूरेट करने और कई sgRNA डिजाइन उपकरणों की तुलना करने की सिफारिश की जाती है।
  2. प्राथमिक मानव टी-कोशिकाओं में जीन व्यवधान
    1. स्वस्थ स्वयंसेवक दाताओं से ऑटोलॉगस पेरिफेरल रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी) प्राप्त करें। प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध समय रेखा चित्रा 2A में वर्णित है और नीचे वर्णित है ।
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीडी4 और सीडी 8 चयन किट का उपयोग करके सीडी 4 + और सीडी 8+ टी-कोशिकाओं को अलग करें।
    3. CD4+ और CD8+ टी-कोशिकाओं को 1:1 अनुपात में मिलाएं और R10 में 3x106 कोशिकाओं/एमएल में रात भर इनक्यूबेट 5 एनजी/एमएल एचयूआईएल-7 और एचयूआईएल-15 प्रत्येक के साथ पूरक किया गया । आईएल-7 और आईएल-15 के अलावा आईएल-7 और आईएल-15 की सिफारिश की जाती है क्योंकि वे आईएल-7 के साथ विस्तारित केंद्रीय मेमोरी फेनोटाइप और कार-टी कोशिकाओं को बढ़ावा देने के लिए जाने जाते हैं और आईएल-15 में आईएल-2 विस्तारित कार-टी कोशिकाओं की तुलना में बेहतर एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता है22,23,24।
    4. अगले दिन, 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर टी-कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र 5-10 x 106 कोशिकाओं की गणना करें। सभी सुपरनेट को छोड़ दें और कम-सीरम न्यूनतम आवश्यक मीडिया में सेल पेलेट को धोएं। निर्माता के निर्देशों(सामग्रियोंकी तालिका) के अनुसार न्यूक्लियोफेक्शन समाधान के 100 माइक्रोल में गोली को फिर से खर्च करें।
    5. कोशिकाओं को धोते समय, कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए SgRNA के 5 माइक्रोन के साथ Cas9 और gRNA के 10 माइक्रोन इनक्यूबेटिंग द्वारा Cas9 और gRNA के साथ ribonucleoprotein (आरएनपी) परिसर तैयार करें । SgRNA के लिए Cas9 का मोलर अनुपात 1:2.4 है । एक नकली नियंत्रण जिसमें Cas9 और इलेक्ट्रोपॉनेशन बढ़ाने वाला होता है, लेकिन कोई sgRNA, की सिफारिश नहीं की जाती है।
      नोट: मल्टीप्लेक्स जीन संपादन इस कदम पर प्रत्येक लक्ष्य के लिए RNP परिसरों को अलग से बनाने और अगले चरण में वर्णित नाभिक के समय उन्हें कोशिकाओं के साथ जोड़कर किया जा सकता है । आरएनपी परिसर को इकट्ठा करने के लिए अभिकर् थों का चयन उच्च KO दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न विक्रेताओं के Cas9 नाभिक में अलग-अलग ऑफ-टारगेट प्रभाव होते हैं और रासायनिक रूप से संशोधित जीआरएनए टी कोशिकाओं में विषाक्तता को कम करते हैं, जिससे KO दक्षता में वृद्धि होती है।
    6. चरण 2.2.5 से आरएनपी परिसर के साथ चरण 2.2.4 से पुनर्निपित कोशिकाओं को मिलाएं और 4 माइक्रोन इलेक्ट्रोप्यूशन एन्हांसर (एसएसडीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जो मानव जीनोम के अनुसार न हो) के 4.2 माइक्रोन जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और इलेक्ट्रोपॉरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें। बुलबुले से बचें क्योंकि वे इलेक्ट्रोपॉजेशन दक्षता को ख़राब करते हैं।
    7. पल्स कोड EH111 का उपयोग कर इलेक्ट्रोपोरेट कोशिकाओं। इलेक्ट्रोपाउशन के बाद, R10 में इनक्यूबेट कोशिकाओं को 5 एनजी/एमएल एचआईएल-7 और एचयूआईएल-15 के साथ 5x106 कोशिकाओं/एमएल पर 12-वेल प्लेटों में ४८ घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पूरक किया जाता है । 48 घंटे के बाद, टी-सेल सक्रियण और विस्तार के साथ आगे बढ़ें।

3. टी सेल एक्टिवेशन, लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन और विस्तार

नोट: स्क्रीनिंग के लिए SgRNA, कार निर्माण के lentiviral ट्रांसडक्शन (चरण 3.2) आवश्यक नहीं है।

  1. 5 एनजी/एमएल ह्यूआईएल-7 और ह्यूआईएल-15 के साथ पूरक गर्म R10 का उपयोग करके 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए इलेक्ट्रोपेटेड टी-कोशिकाओं और पतला की गणना करें । एंटी-सीडी 3/एंटी-सीडी28 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कोटेड चुंबकीय मोतियों को 3 मोतियों के अनुपात में लाइव टी-सेल के अनुपात में जोड़कर कोशिकाओं को सक्रिय करें।
    नोट: इलेक्ट्रोपाउशन महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु का कारण बनता है जिसके परिणामस्वरूप गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की तुलना में लगभग 60% ± 15% व्यवहार्य कोशिकाएं होती हैं। मोतियों की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए लाइव/डेड सेल काउंट का उपयोग करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें और रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. रात भर उत्तेजना के बाद, कदम 1 से लेंटीवायरल सुपरनेट के साथ CRISPR-इंजीनियर टी-कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। 3 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता प्राप्त करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए चरण 1.7 में गणना किए गए वायरल टाइटर के आधार पर उपयुक्त मात्रा जोड़ें।
    नोट: R10 में वायरस गोली को फिर से निलंबित किया गया कोशिका एकाग्रता, वायरल टाइटर और वांछित एमओआई के अनुसार कोशिकाओं के शीर्ष पर जोड़ा जाता है।
  3. 72 घंटे के बाद, वर्तमान संस्कृति मात्रा R10 के 50% के साथ फ़ीड कोशिकाओं 10 एनजी/ टी-सेल और मोतियों के बीच बनने वाले गुच्छों को परेशान न करें।
  4. 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं से मोतियों को धीरे-धीरे सेल-मनका मिश्रण को फिर से खर्च करके हटा दें जिसके बाद चुंबकीय पृथक्करण होता है। मनका हटाने के बाद कोशिकाओं की गिनती और 0.8 x 106 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए लाने/ डी-बीडिंग के बाद, सेल नंबर इलेक्ट्रोपॉशन(चित्रा 2 बी)से पहले 1 दिन पर सेल काउंट के समान होना चाहिए।
  5. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं की गणना करें और R10 + 5 एनजी/एमएल एचयूआईएल-7 और एचआईएल-15 के साथ 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता को खिलाएं । यह हर 24 घंटे दोहराएं जब तक विकास काइनेटिक्स और सेल आकार का प्रदर्शन कोशिकाओं उत्तेजना से विश्राम किया है ।
    नोट: इस बिंदु से, टी कोशिकाओं को लगभग हर 24h डबल । टी सेल आमतौर पर 5-7 जनसंख्या दोहरीकरण से गुजरना और विश्राम करते समय लगभग 300 ± 50 एफएल की सेल मात्रा होती है।
  6. एक बार विश्राम करने के बाद, क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए CRISPR-इंजीनियर कार-टी कोशिकाओं को स्पिन करें और फ्रीज मीडिया (1:1 एक्स-वीवो और एफबीएस प्लस 10% डीएमएसओ) में रिसिपेंड करें। उपयोग की जाने वाली कार-टी कोशिकाओं को गल जाना चाहिए और एक प्रयोग से पहले 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर विश्राम किया जाना चाहिए।
    नोट: नॉकआउट दक्षता और कार एकीकरण को मापने के लिए लगभग 10x106 कोशिकाओं को आरक्षित रखें। विस्तार के दौरान अपेक्षित जनसंख्या दोहरीकरण और मात्रा में परिवर्तन चित्रा 2बी, 2Cमें दिखाया गया है । इसके अतिरिक्त, चित्रा 2D नकली और जीन संपादित कार-टी कोशिकाओं दोनों पर कार अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाता है।

4. CRISPR दक्षता

  1. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और लक्ष्य जीन प्रवर्धन
    1. प्रत्येक स्क्रीनिंग संस्कृति से, 3-5 x 106 टी-कोशिकाओं को स्पिन करें। कोशिकाओं को या तो एक सूखी गोली के रूप में नीचे जमे हुए किया जा सकता है या एक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ सकते हैं । डीएनए निष्कर्षण के समय, फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 200 माइक्रोन में छर्रों को फिर से रखना और निर्माता निर्देश के अनुसार एक मानक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालता है।
      1. संक्षेप में, प्रोटीन के साथ कोशिकाओं को lyse और लोड एक डीएनए बाध्यकारी कॉलम पर lysate । अपकेंद्रित्र के दौरान, डीएनए झिल्ली के लिए बाध्यकारी है, जबकि संदूषकों के माध्यम से पारित हो जाएगा । शेष संदूषकों और एंजाइम अवरोधकों को हटाने के लिए दो धोने के कदम के बाद, पानी में डीएनए को एल्यूट करें।
    2. डीएनए पॉलीमरेज, सहायक प्रोटीन, लवण, और dNTPs और 10 माइक्रोन फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर युक्त मानक पीसीआर मिश्रण का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए के 200-300 एनजी को बढ़ाना, जो अभीष्ट डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के क्षेत्र को फ्लैंक कर रहा है।
      नोट: पीसीआर प्राइमर डिजाइन के लिए, संदर्भ जीनोमिक अनुक्रम (http://www.ensemble.org का उपयोग करके पाया जा सकता है) फ्लैंकिंग जीआरएनए कट साइट एनसीबीआई प्राइमर ब्लास्ट टूल (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) में प्रवेश कर रहे हैं। पीसीआर प्राइमर को इस तरह डिजाइन किया जाना चाहिए कि एम्प्लीकॉन का टारगेट साइज 600-700bp हो। यह लंबाई सीक्वलिंग प्राइमर डिजाइन करने की अनुमति देती है जो जीआरएनए कट साइट (कम से कम 150 बीपी) से पर्याप्त दूरी के साथ एम्प्लीकॉन के भीतर बांधते हैं ताकि Cas9 प्रेरित इनडेल्स के आसपास अच्छी अनुक्रमण गुणवत्ता सुनिश्चित की जा सके (4.2.1 देखें)। प्रत्येक gRNA एक अद्वितीय प्राइमर जोड़ी की आवश्यकता है, जब तक GRNA कटौती साइटों के करीब निकटता में हैं ।
    3. पूरे पीसीआर उत्पाद को 1% एगर उठे हुए जेल पर चलाएं और एक मानक एगर उठे जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग करके एम्प्लिकॉन को शुद्ध करें।
      नोट: पीसीआर के लिए इष्टतम टीएम निर्धारित करने की प्रक्रिया समस्या निवारण के कई दौर ले सकती है। इसका कारण यह है कि KO अनुक्रम indels है और लक्ष्य जीन अनुक्रमण के लिए प्रिम किया जाना चाहिए, जहां कोई indels आमतौर पर १०० बीपी अपस्ट्रीम या कट साइट के नीचे होगा । यह गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने के परिणामस्वरूप इनलिटरों के कारण व्यापक रूप से भिन्न हो सकता है। पीसीआर प्राइमर के लिए नेस्टेड अनुक्रमण प्राइमर डिजाइन करना और अनुक्रमित उत्पाद की एकाग्रता बढ़ाना अनुक्रमण के साथ समस्याओं को खत्म कर सकता है।
  2. अनुक्रमण और इंडेल डिटेक्शन
    1. डिजाइन अनुक्रमण प्राइमर जो जेल शुद्ध एम्प्लिकॉन से बांधते हैं और सेंगर सीक्वेंसिंग के लिए नकली और नॉकआउट एम्प्लिकोन भेजते हैं। एक बार अनुक्रमण पूरा हो जाने के बाद, टाइड विश्लेषण के लिए ट्रेस फाइलों को डेस्कटॉप जेनेटिक्स सॉफ्टवेयर (tide.deskgen.com, डेस्कटॉप जेनेटिक्स) पर अपलोड करें।
      1. प्राइमर डिजाइन अनुक्रम के लिए, पीसीआर एम्प्लिकॉन के अनुक्रम को एक मानक प्राइमर डिजाइन सॉफ्टवेयर (एनसीबीआई, यूरोफिन या अन्य सार्वजनिक रूप से उपलब्ध उपकरण) में दर्ज करें। डिजाइन सॉफ्टवेयर कई प्राइमर दृश्यों का सुझाव देगा जो सेंगर अनुक्रमण के लिए उपयुक्त हैं।
      2. आगे और रिवर्स प्राइमर चुनें जो एम्प्लिकॉन के भीतर कम से कम 150 बीपी अपस्ट्रीम या जीआरएएन कट साइट के डाउनस्ट्रीम को बांधते हैं ताकि इनडेल्स के आसपास अच्छी अनुक्रमण गुणवत्ता सुनिश्चित की जा सके। ज्वार विश्लेषण के लिए अनुक्रमण क्रोमेटोग्राम का उपयोग 4.2 में किया जाएगा, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि सटीक अडेल अपघटन के लिए अनुक्रमण गुणवत्ता अच्छी है (हल्टक्विस्ट एट अल देखें। 25.
    2. जीनोमिक स्तर26पर नॉक आउट (KO) दक्षता का पता लगाने के लिए ज्वार (DEcomposition द्वारा इनडेल्स की ट्रैकिंग) विश्लेषण का उपयोग करें। एल्गोरिदम अनुक्रम निशान से indels के स्पेक्ट्रम का सटीक पुनर्निर्माण करता है और आर2 मूल्यों की गणना करता है, जो ज्वार सॉफ्टवेयर द्वारा गैर-नकारात्मक रैखिक मॉडलिंग के बाद फिट की अच्छाई को दर्शाता है।
  3. लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने
    1. लक्ष्य जीन जिसका जीन उत्पाद टी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किया जाता है के लिए, एक फ्लोरोक्रोम टैग एंटीबॉडी लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट के साथ प्रत्येक स्क्रीनिंग संस्कृति से लगभग 1 x10 5 कोशिकाओं दाग । नकली नियंत्रण और नॉकआउट समूहों के बीच लक्ष्य प्रोटीन के अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना फ्लो साइटोमेट्री द्वारा करें जैसा कि चित्र 3 ए, 3बीमें दिखाया गया है ।
    2. लक्ष्य जीन जिनके जीन उत्पाद इंट्रासेल्युलर रूप से व्यक्त किया जाता है, लाइसिस बफर में स्क्रीनिंग समूह के प्रति लगभग 3 x10 6 मिलियन कोशिकाओं को लाइसे और एसडीएस-पेज और पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन करें। वैकल्पिक रूप से, सतह या इंट्रासेलुलर प्रवाह-साइटोमेट्री का उपयोग लक्षित प्रोटीन के लिए जांच करने के लिए किया जा सकता है।

5. iGUIDE का उपयोग करके ऑफ-टारगेट प्रभावों की निगरानी करना - लाइब्रेरी की तैयारी, डीएनए अनुक्रमण और विश्लेषण

नोट: iGUIDE तकनीक Cas9 निर्देशित दरार के स्थानों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है और उन डीएनए डबल फंसे टूट के वितरण की मात्रा ।

  1. रईसों एट अल21द्वारा वर्णित iGUIDE प्रदर्शन करें । iGUIDE तकनीक का उपयोग कर TRAC लोकस को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए के ऑफ-टारगेट प्रभाव स्टैडमौर एट अल, 202013में दिखाए गए हैं।

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Representative Results

हम यहां आनुवंशिक रूप से इंजीनियर टी कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग ऑटोलॉगस और एलोजेनिक कार-टी कोशिकाओं के साथ-साथ टीसीआर रीडायरेक्टेड टी कोशिकाओं दोनों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।

चित्रा 1 CRISPR संपादित टी कोशिकाओं के निर्माण की प्रक्रिया में शामिल चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। यह प्रक्रिया ब्याज के जीन को sgRNA डिजाइन करके शुरू होती है। एक बार जब SgRNA डिजाइन और संश्लेषित कर रहे है वे तो उपयुक्त कैस प्रोटीन के साथ RNP परिसरों बनाने के लिए उपयोग किया जाता है । टी कोशिकाओं को या तो एक स्वस्थ दाता या एक रोगी apheresis और RNP परिसरों से अलग कर रहे है या तो इलेक्ट्रोपॉरेशन या नाभिक द्वारा दिया जाता है । संपादन के बाद, टी कोशिकाओं को सक्रिय किया जाता है और कार या टीसीआर निर्माण के लिए लेंटीवियरल वेक्टर कोडिंग के साथ स्थानांतरित किया जाता है। सक्रियण के बाद, टी कोशिकाओं को संस्कृति में विस्तारित किया जाता है और भविष्य के अध्ययनों के लिए क्रायोप्रेप किया जाता है। प्रयोगशाला में अपनाई गई विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन चित्र 2में किया गया है . विस्तार के दौरान, जनसंख्या दोहरीकरण और मात्रा में परिवर्तन प्रोटोकॉल भर में ट्रैक कर रहे है और एक उदाहरण दोनों नकली और संपादित कार टी कोशिकाओं के लिए चित्रा 2B और सी में दिखाया गया है । चित्रा 2B,सी बताते हैं कि ब्याज के जीन के KO विस्तार के दौरान प्रसार और सक्रियण में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन का कारण नहीं था। हालांकि, ये परिणाम संपादित किए जा रहे लक्ष्य जीन पर निर्भर करते हैं और इसलिए प्रसार और विस्तार में परिवर्तन हो सकता है या नहीं हो सकता है ।

एक बार कोशिकाओं क्रायोप्रीवित हो जाने के बाद, कार अभिव्यक्ति के स्तर भी आगे कार्यात्मक अध्ययन के लिए निर्धारित किए जाते हैं। इस मामले में, जैसा कि चित्रा 2D में दिखाया गया है, हमने मॉक एडिटेड और को कार-टी कोशिकाओं दोनों पर CD19 कार अभिव्यक्ति की जांच की और कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा। यह फिर से संपादित किए जा रहे ब्याज के जीन पर निर्भर करेगा। अंत में, KO दक्षता प्रोटीन स्तर का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री और पश्चिमी दाग और भी KO के जीन स्तर का पता लगाने के लिए Sanger अनुक्रमण के रूप में कई तकनीकों का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । चित्रा 3 ए और 3B शो प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंड जहां पीडीसीडी 1 और TRAC लोकस को SgRNA का उपयोग करके लक्षित किया गया है, जो पीडीसीडी 1 एसजीआरएनए के लिए 90% और कई स्वस्थ दानदाताओं में TRAC SgRNA के लिए 98% की दक्षता दिखा रहा है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल व्यवहार्यता में न्यूनतम हानि के साथ उच्च दक्षता नॉकआउट प्राप्त कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1। योजनाबद्ध आरेख CRISPR Cas9 प्रौद्योगिकी और प्राथमिक मानव कार-टी कोशिकाओं के निर्माण का उपयोग कर टी सेल संपादन दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। संपादित कार-टी कोशिकाओं और उनकी जनसंख्या का विस्तार दोगुना हो जाता है। (A) प्राथमिक मानव कार्ट कोशिकाओं में CRISPR संपादन और विनिर्माण की समयरेखा। (ख)मॉक और CRISPR संपादित सीडी 19 कार-टी कोशिकाओं में जनसंख्या दोहरीकरण कार-टी कोशिकाओं के विस्तार के दौरान एक कल्टर काउंटर का उपयोग कर मापा (n = 3 स्वस्थ दाताओं; KO =नॉकआउट)(C)सेल आकार (μm3)कार-टी कोशिकाओं (n= 3 स्वस्थ दाताओं) के विस्तार के दौरान एक कल्टर काउंटर का उपयोग कर मापा । (घ)प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों में कार धुंधला और कई दानदाताओं में औसत दिखा नकली और संपादित कार-टी कोशिकाओं में कार अभिव्यक्ति दिखा । कार अभिव्यक्ति एक विरोधी मूर्खतापूर्ण एंटीबॉडी का उपयोग कर एक फ्लोरोफोर के लिए conjugated और Lymphocytes/Singlets/Live कोशिकाओं (n = 3 स्वस्थ दाताओं, UTD = untransduced,) पर gated का पता चला था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके संपादित कार-टी कोशिकाओं में KO दक्षता की विशेषता। (A)प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों में पीडी-1 धुंधला और औसत दिखाते हुए कई दानदाताओं में पीडी-1 को दक्षता दिखाते हुए नकली और संपादित कार-टी कोशिकाओं में TRAC लोकस को लक्षित करने वाले जीआरएनए का उपयोग करके । पीडी-1 अभिव्यक्ति का पता पीडी-1 एंटीबॉडी (क्लोन EH12.2H7) का उपयोग करके फ्लोरोफोर के लिए संयुग्मित किया गया था और लिम्फोसाइट्स/सिंगल्स/लाइव सेल (एन = 3 स्वस्थ दानदाताओं) पर गेट किया गया था । त्रुटि सलाखों का संकेत मतलब± मतलब (SEM) की मानक त्रुटि । पी<0.0001, *** पी = 0.0005, वेल्च के टी टेस्ट द्वारा ** पी = 0.001। (ख)प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों सीडी 3 धुंधला और कई दानदाताओं में औसत दिखा सीडी 3 KO दक्षता दिखा नकली और संपादित कार टी कोशिकाओं में TRAC लोकस लक्ष्यीकरण GRNA का उपयोग कर । CD3 अभिव्यक्ति का पता चला CD3 एंटीबॉडी (क्लोन OKT3) फ्लोरोफोर के लिए conjugated और Lymphocytes/Singlets/लाइव कोशिकाओं (n= 3 स्वस्थ दाताओं) पर gated का उपयोग कर पाया गया था । त्रुटि सलाखों का संकेत मतलब± मतलब (SEM) की मानक त्रुटि । पी<0.0001, *** पी = 0.0005, वेल्च के टी टेस्ट द्वारा ** पी = 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम CRISPR Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग कर कार-टी कोशिकाओं को संपादित करने और कार्य और प्रभावकारिता के लिए आगे परीक्षण करने के लिए उत्पादों का निर्माण करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। उपरोक्त प्रोटोकॉल को प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में क्रिप्सआर जीन संपादन करने के लिए अनुकूलित किया गया है जो इंजीनियरिंग टी कोशिकाओं के साथ चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर्स के साथ संयुक्त है। यह प्रोटोकॉल न्यूनतम दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता के साथ उच्च नॉकआउट दक्षता की अनुमति देता है। CRISPR का उपयोग कर संशोधन रिसेप्टर्स को नष्ट करके कार-टी कोशिकाओं की प्रभावकारिता और सुरक्षा दोनों में सुधार कर सकता है जो टी कोशिकाओं के कार्य को रोकते हैं और एलोजेनिक कार-टी कोशिकाओं का निर्माण करते हैं।

छोटे पैमाने पर विस्तार प्रोटोकॉल के लिए, प्रति समूह 106 कोशिकाओं के साथ शुरू करने के लिए लगभग ५०० ६ कार टी कोशिकाओं की ओरजाता है 6 जनसंख्या के एक औसत के साथ एक स्वस्थ सामांय दाता में दोहरीकरण । हालांकि, यह इस आधार पर भिन्न हो सकता है कि ब्याज का जीन टी सेल सक्रियण, लेनदेन और प्रसार को प्रभावित करता है। ५००,०,० कोशिकाओं KO दक्षता की पुष्टि के लिए पर्याप्त हैं, इन विट्रो परख और वीवो परख में । प्रोटोकॉल में विभिन्न भिन्नताएं हैं जिनमें CRISPR संपादन सक्रियण और कार-ट्रांसडक्शन से पहले या बाद में किया जा सकता है। रेन एट अल ने ऐसी ही एक भिन्नता का वर्णन किया जहां कोशिकाओं को मनका उत्तेजना और कार-ट्रांसडक्शन15के बाद संपादित किया जाता है । मनका उत्तेजना से पहले CRISPR संपादन का लाभ कम सेल मात्रा को संपादित करने की आवश्यकता है क्योंकि टी कोशिकाओं ने अभी तक प्रसार नहीं किया है, जिससे प्रक्रिया कम समय लेने वाली और अधिक लागत-कुशल हो जाती है। इसके अतिरिक्त, संपादन अग्रिम प्रदर्शन सीधे क्लिनिक के लिए अनुवाद योग्य है । वास्तव में, इस प्रोटोकॉल में कई कदम क्या क्लिनिक में अपनाया जा सकता है जो KO दक्षता की निरंतरता बढ़ जाती है जब बेंच से बिस्तर पर जाने से सूचित किया गया है ।

कई चर हैं जिन्हें प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में चुना जा सकता है। उदाहरण के लिए, टी कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोट या न्यूक्लियोपिक किया जा सकता है। जबकि दोनों तुलनीय KO क्षमता प्राप्त करते हैं, नाभिक का उपयोग करके हमारे अनुभव में उच्च व्यवहार्यता पोस्ट संपादन होता है और इसलिए इसे पसंद किया जाता है। हालांकि, इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग लंबे समय में अधिक लागत प्रभावी साबित हो सकता है। इन दोनों उपकरणों का उपयोग लघु स्तर के टी सेल विस्तार के लिए किया जाता है। बड़े पैमाने पर और नैदानिक पैमाने पर विस्तार के लिए, संपादन करने के लिए प्रोटोकॉल को फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए और नाभिक के लिए विभिन्न उपकरणों की आवश्यकता होती है। कई तकनीकी प्लेटफॉर्म हैं जिनका उपयोग उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर छोटे पैमाने पर और बड़े पैमाने पर संपादन और विस्तार दोनों के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

हम सामान्य दाता टी कोशिकाओं और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में प्रवाह साइटोमेट्री कोर प्रदान करने के लिए मानव इम्यूनोलॉजी कोर स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4D-Nucleofactor Core Unit Lonza AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit Lonza AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix ThermoFisher 12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifuge Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody Biolegend 317322 Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1 Biolegend Clone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancers IDT 1075915
CD3/CD28 Dynabeads ThermoFisher 40203D
CD4+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15062
CD8+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle Corning 430768
Corning T150 cell culture flask Millipore Sigma CLS430825
DMSO Millipore Sigma D2650
DNAeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69504
DynaMag Magnet ThermoFisher 12321D
Glutamax supplement ThermoFisher 35050061
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEPES (1 M) ThermoFisher 15630080
huIL-15 PeproTech 200-15
huIL-7 PeproTech 200-07
Lipofectamine 2000 ThermoFisher 11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanup Takara 740609.25
Opti-MEM ThermoFisher 31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L Lonza V4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016
pTRPE expression Plasmid in house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE CytoArt 200105
RPMI1640 ThermoFisher 12633012
sgRNA IDT
Spy Fi Cas9 Aldevron 9214
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 326823
Viral packaging mix in house
X-Vivo-15 Media Lonza BE02-060F

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References

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Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (169), e62299, doi:10.3791/62299 (2021).

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