Summary
Her presenterer vi en protokoll for genredigering i primære menneskelige T-celler ved hjelp av CRISPR Cas Technology for å modifisere CAR-T-celler.
Abstract
Adoptivcellebehandlinger ved hjelp av chimeric antigenreseptor T-celler (CAR-T-celler) har vist bemerkelsesverdig klinisk effekt hos pasienter med hematologiske maligniteter og blir for tiden undersøkt for ulike faste svulster. CAR-T-celler genereres ved å fjerne T-celler fra pasientens blod og konstruere dem for å uttrykke en syntetisk immunreseptor som omdirigerer T-cellene for å gjenkjenne og eliminere målsvulstceller. Genredigering av CAR-T-celler har potensial til å forbedre sikkerheten til dagens CAR-T-cellebehandlinger og ytterligere øke effekten av CAR-T-celler. Her beskriver vi metoder for aktivering, utvidelse og karakterisering av humane CRISPR-konstruerte CD19-styrte CAR-T-celler. Dette omfatter transduksjon av CAR lentiviral vektor og bruk av enkelt guide RNA (sgRNA) og Cas9 endonuclease å målrette gener av interesse i T-celler. Metodene beskrevet i denne protokollen kan brukes universelt på andre CAR-konstruksjoner og målgener utover de som brukes til denne studien. Videre diskuterer denne protokollen strategier for gRNA-design, bly gRNA-seleksjon og målgen knockout validering for å reprodusere oppnå høy effektivitet, multipleks CRISPR-Cas9 engineering av klinisk klasse menneskelige T-celler.
Introduction
Chimeric antigen reseptor (CAR)-T celle terapi har revolusjonert feltet adoptivcelle terapier og kreft immunterapi. CAR-T-celler er konstruerte T-celler som uttrykker en syntetisk immunreseptor som kombinerer et antigenspesifikt enkeltkjedet antistofffragment med signaldomener avledet fra TCRzeta-kjeden og costimulatoriske domener som er nødvendige og tilstrekkelige for T-celleaktivering og kostimulering1,2,3,4 . Produksjonen av CAR-T-celler starter med å trekke ut pasientens egne T-celler, etterfulgt av ex vivo viral transduksjon av CAR-modulen og utvidelse av CAR-T-celleproduktet med magnetiske perler som fungerer som kunstig antigen som presenterer cellene5. Utvidede CAR-T-celler blir re-infundert til pasienten der de kan engraft, eliminere mål tumorceller og til og med vedvare i flere år etter infusjon6,7,8. Selv om CAR-T celleterapi har resultert i bemerkelsesverdige responsrater i B-celle maligniteter, klinisk suksess for faste svulster har blitt utfordret av flere faktorer, inkludert dårlig T-celle infiltrasjon9, en immundempende tumormikromiljø10, antigendekning og spesifisitet, og CAR-T celle dysfunksjon11,12 . En annen begrensning av nåværende CAR-T celleterapi inkluderer bruk av autologe T-celler. Etter flere runder med kjemoterapi og høy tumorbyrde, kan CAR-T-celler være av dårlig kvalitet sammenlignet med allogene CAR-T-produkter fra friske donorer i tillegg til tid og utgifter forbundet med produksjon av autologe CAR-T-celler. Genredigering av CAR-T-celleproduktet av CRISPR/Cas9 representerer en ny strategi for å overvinne gjeldende begrensninger i CAR-T-cellene13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 er et tokomponentsystem som kan brukes til målrettet genomredigering i pattedyrcelle18,19. CRISPR-assosiert endonuclease Cas9 kan indusere stedsspesifikke dobbeltstrengsbrudd styrt av små RNAer gjennom baseparing med mål-DNA-sekvensen20. I mangel av en reparasjonsmal repareres dobbeltstrengsskift av den feilutsatte banen for ikke-hjemmekoblende (NHEJ), noe som resulterer i frameshift-mutasjoner eller for tidlig stoppkokoner gjennom innsettings- og slettingsmutasjoner (INDELer)19,20,21. Effektivitet, brukervennlighet, kostnadseffektivitet og muligheten for multiks genomredigering gjør CRISPR/Cas9 til et kraftig verktøy for å forbedre effektiviteten og sikkerheten til autologe og allogene CAR-T-celler. Denne tilnærmingen kan også brukes til å redigere TCR-styrte T-celler ved å erstatte CAR-konstruksjonen med en TCR. I tillegg kan allogene CAR-T-celler som har begrenset potensial til å forårsake graft versus vertssykdom, også genereres ved genredigering av TCR-, b2m- og HLA-locus.
I denne protokollen viser vi hvordan CRISPR-engineering av T-celler kan kombineres med viral vektormediert levering av CAR-Transgene for å generere genom-redigerte CAR-T celleprodukter med forbedret effekt og sikkerhet. Et skjematisk diagram over hele prosessen vises i figur 1. Ved hjelp av denne tilnærmingen har vi demonstrert høyeffektiv gen knockout i primære menneskelige CAR-T celler. Figur 2A beskriver i detalj tidslinjen for hvert trinn for redigering og produksjon av T-celler. Strategier for guide RNA design og knockout validering diskuteres også for å anvende denne tilnærmingen til ulike målgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human T-celler ble anskaffet gjennom University of Pennsylvania Human Immunology Core, som opererer under prinsipper for Good Laboratory Practice med etablerte standard driftsprosedyrer og / eller protokoller for prøvemottak, behandling, frysing og analyse i samsvar med MIATA og University of Pennsylvania etiske retningslinjer.
1. Lentiviral vektorproduksjon
MERK: De virale produktene har blitt gjort replikasjonsdestruert ved separasjon av emballasjekonstruksjoner (Rev, gag/pol/RRE, VSVg og overføringsplasmid) til fire separate plasmider, noe som i stor grad reduserer sannsynligheten for rekombinasjonshendelser som kan resultere i replikasjons-kompetent virus.
- Forbered HEK293T-celler en dag før transfeksjonen. Plate ca 6 x 106 celler i T150 kulturfartøy i 30 ml standard kulturmedier (referert til som R10: RPMI 1640 supplert med 10% fosterkalv serum, 10 mM HEPES, 1% Penn/Strep, 1% L-glutamin) og inkuberes over natten ved 37 °C. 18-24 timer senere skal cellene være 60-70% konfluente og se sunne ut (dendritiske projeksjoner og jevn fordeling over kolben). Hvis cellene ser friske ut, går du videre til trinn 1.2.
- Forbered transfeksjonsblandingen som inneholder lipofeksjonsreagens (96 μL), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 μg) emballasjeplasmider og 15 μg uttrykksplasmid (CD19bbz scFv klonet i pTRPE).
- For hver transfeksjonsreaksjon, lag ett rør som inneholder 1 ml redusert serum minimalt med essensielle medier pluss de fire plasmidene som er beskrevet i trinn 1.2, samt ett rør som inneholder 2 ml redusert serum minimalt essensielle medier pluss 90 μL lipofeksjonsreagens. Kombiner disse to løsningene ved dråpevis tilsetning av 1 ml plasmidblanding til 2 ml lipofeksjonsreagensblanding. Pass på å blande løsningen kraftig ved å pipettere opp og ned flere ganger. Inkuber løsningen i 15 min ved romtemperatur.
- I mellomtiden aspirerer du mediene fra HEK293T-celleflasken og vasker forsiktig celler med 10 ml redusert serum minimalt med essensielle medier og aspirerer igjen.
- Tilsett transfeksjonsblandingen forsiktig (3 ml) fra trinn 1.2.1 til det nederste hjørnet av cellekulturflasken ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette. Vipp kolben forsiktig for å fordele transfeksjonsblandingen jevnt over cellekulturflasken og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur. Pass på at du ikke forstyrrer cellemonolayeren. Etter en 10 min inkubasjon, tilsett 35 ml R10-medier og returner kolbe til inkubatoren i 24 timer.
- Etter 24 timer, samle supernatant fra HEK293T cellekulturflasker og overfør til 50 ml koniske rør. Tilsett fersk R10 i HEK29T-cellene og legg cellene tilbake i inkubatoren i ytterligere 24 timer. Snurr ned supernatanten (300 x g) for å fjerne cellerester og filtrere supernatanten gjennom et 0,45 μm filter.
- Konsentrer filtratet fra trinn 1.3 ved høyhastighets ultracentrifugation (25.000 x g i 2,5 timer eller 8000 x g over natten (O / N)). Oppbevar 24 h viruspellet ved 4 °C mens du samler viruset på 48 timer.
- Gjenta trinn 1.3-1.4 for 48 h-samlingen, og kombiner virussamlinger på 24 timer og 48 timer. Pellets fra 48 h-samlingen vil inneholde en kombinert høsting av lentiviruset.
- Resuspend viral pellets i ca 1 ml kald R10 og aliquot i 100 μL hetteglass. Umiddelbart trykk på fryse aliquots ved hjelp av tørris og lagre ved -80 °C.
- Beregn funksjonell viral titer i transduseringsenheter/ml ved å transdusere en fast mengde CD3/CD28 perleaktiverte primære menneskelige T-celler med serielle fortynninger av lentiviral supernatant. Mål CAR-Transduksjon etter 72 timer ved strømningscytometri.
- Flekk for CD19-rettet CAR med et anti-FCM63 scFv antistoff. For andre chimeric antigen reseptorer, flekk ved hjelp av fluorofor-merket rekombinant protein som er spesifikk for CAR scFv. Virusfortynning som genererer under 20% CAR positive celler ved flow-cytometri er den mest nøyaktige fortynning å beregne viral titer fra. Over 20% CAR-positive celler øker sjansen for at hver positiv celle blir transdusert to ganger, noe som resulterer i en underestimering av antall transduserende partikler. Beregn transduseringsenhetene per ml (TU/ml ) = (antall celler transdusert x prosent CAR positive celler x fortynningsfaktor)/(transduksjonsvolum i ml).
2. Design av sgRNAer og genforstyrrelser i primære menneskelige T-celler
- Designe CRISPR sgRNA-er
MERK: Flere servere og programmer forenkler utformingen av målspesifikke sgRNA-er. I denne protokollen ble CRISPR sgRNAer designet ved hjelp av CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no), og gRNA-designportalen fra Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- For hvert målgen designer du seks til ti sgRNA-sekvenser for å målrette tidlige kodeeksonsekvenser.
MERK: sgRNA skal ha høy effekt på målet og lav måleffekt. Hver maskinlæringsalgoritme for å bestemme sgRNA-effekten fungerer litt annerledes. Derfor anbefales det å sammenligne flere sgRNA-designverktøy og kuratere en liste på seks til ti sgRNA for screening.
- For hvert målgen designer du seks til ti sgRNA-sekvenser for å målrette tidlige kodeeksonsekvenser.
- Genforstyrrelser i primære menneskelige T-celler
- Få autologe perifere mononukleære celler i blodet (PBMCs) fra friske frivillige givere. En skjematisk tidslinje for protokollen er beskrevet i figur 2A og beskrevet nedenfor.
- Isoler CD4+ og CD8+ T-celler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige CD4- og CD8-utvalgssett.
- Kombiner CD4+ og CD8+ T-celler med et 1:1-forhold og inkuber over natten ved 3x106 celler / ml i R10 supplert med 5 ng / ml huIL-7 og huIL-15 hver. Tillegg av IL-7 og IL-15 anbefales som de er kjent for å fremme en sentral minne fenotype og CAR-T celler utvidet med IL-7 og IL-15 har overlegen anti-tumor effekt sammenlignet med IL-2 utvidet CAR-T celler22,23,24.
- Neste dag teller du T-celler og sentrifuger 5-10 x 106 celler ved 300 x g i 5 minutter. Kast all supernatant og vask cellepelleten i redusert serum minimalt med essensielle medier. Resuspend pellet i 100 μL nukleofeksjonsløsning i henhold til produsentens instruksjoner (Materialliste).
- Mens du vasker cellene, lag ribonucleoprotein (RNP) kompleks med Cas9 og gRNA ved å inkubere 10 μg Cas9-nuklease med 5 μg sgRNA i 10 minutter ved romtemperatur (RT). Molarforholdet mellom Cas9 og sgRNA er 1:2.4. En mock-kontroll som inneholder Cas9 og elektroporasjonsforsterker, men ingen sgRNA, anbefales.
MERK: Multiplex genredigering kan utføres på dette trinnet ved å lage RNP-komplekser for hvert mål separat og kombinere dem med celler på det tidspunktet kjernen som beskrevet i neste trinn. Å velge reagensene for å montere RNP-komplekset er nøkkelen til å få høy KO-effektivitet. For eksempel har Cas9-nukleaser fra forskjellige leverandører varierende off-target effekter og kjemisk modifisert gRNA redusere toksisitet til T-celler, og dermed øke KO effektivitet. - Kombiner de resuspenderte cellene fra trinn 2.2.4 med RNP-komplekset fra trinn 2.2.5 og tilsett 4,2 μL 4 μM elektroporasjonsforsterker (ssDNA oligonukleotid som ikke er homologt for menneskelig genom). Bland godt og overfør til elektroporasjonspovetter. Unngå bobler da de svekker elektroporasjonseffektiviteten.
- Elektroporateceller ved hjelp av pulskode EH111. Etter elektroporasjon, inkubere celler i R10 supplert med 5 ng/ml huIL-7 og huIL-15 ved 5x106 celler/ml ved 30 °C i 48 timer i 12-brønnsplater. Etter 48 timer, fortsett med T-celleaktivering og utvidelse.
3. T celleaktivering, lentiviral transduksjon og utvidelse
MERK: For screening av sgRNA-er er det ikke nødvendig med lentiviral transduksjon (trinn 3.2) av CAR-konstruksjonen.
- Tell elektroporerte T-celler og fortynn til en konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml ved hjelp av varm R10 supplert med 5 ng / ml huIL-7 og huIL-15. Aktiver celler ved å legge til anti-CD3/anti-CD28 monoklonale antistoffbelagte magnetiske perler med et forhold på 3 perler per levende T-celle.
MERK: Elektroporasjon forårsaker betydelig celledød, noe som resulterer i omtrent 60% ± 15% levedyktige celler sammenlignet med ikke-elektroporerte celler. Bruk et levende/dødt celleantall for å bestemme riktig mengde perler. Overfør cellene til 37 °C og inkuber over natten. - Etter stimulering over natten transduserer du CRISPR-konstruerte T-celler med lentiviral supernatant fra trinn 1. Tilsett riktig volum basert på viraltiter beregnet i trinn 1.7 for å oppnå et mangfold av infeksjon (MOI) på 3 og inkuber celler i 72 timer ved 37 °C.
MERK: Viruset pellet resuspended i R10 er ganske enkelt lagt på toppen av cellene i henhold til cellekonsentrasjon, viral titer, og ønsket MOI. - Etter 72 timer, mate celler med 50% av det nåværende kulturvolumet R10 som inneholder 10 ng / ml huIL-7 og huIL-15 og returnere dem til inkubatoren i ytterligere 48 timer. Ikke forstyrr klyngene som har dannet seg mellom T-cellene og perlene.
- Etter 48 timer, fjern perlene fra cellene ved å forsiktig resuspendere celleperleblandingen etterfulgt av magnetisk separasjon. Tell celler etter fjerning av perle og ta med til en konsentrasjon på 0,8 x 106 celler / ml ved hjelp av R10 supplert med 5 ng / ml huIL-7 og huIL-15. Etter de-beading skal cellenumrene være lik celleantallet på dag 1 før elektroporasjon (Figur 2B).
- Etter 24 timer teller du celler og mater til en konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml med R10 + 5 ng / ml huIL-7 og huIL-15. Gjenta dette hver 24 h til vekstkinetikk og cellestørrelse viser at cellene har hvilt fra stimulering.
MERK: Fra dette punktet dobler T-cellene omtrent hver 24. T-celle gjennomgår vanligvis 5-7 befolkningsdoblinger og har et cellevolum på ca. 300 ± 50 ml når de hviler. - Når de er uthvilt, kan du spinne ned CRISPR-konstruerte CAR-T-celler og bruke dem på nytt i frysemedier (1:1 X-Vivo og FBS pluss 10 % DMSO) for kryopreservering. CAR-T celler som brukes skal tines og hviles ved 37 °C i 16 timer før et eksperiment.
MERK: Hold ca. 10x106 celler reservert for måling av knockout-effektivitet og CAR-integrasjon. Forventede befolkningsdoblinger og volumendringer under utvidelsen er vist i figur 2B,2C. I tillegg viser Figur 2D nivåer av CAR-uttrykk på både Mock- og genredigerte CAR-T-celler.
4. CRISPR effektivitet
- Genomisk DNA-ekstraksjon og målgenforsterkning
- Fra hver screeningkultur spinner du ned 3-5 x 106 T-celler. Celler kan enten fryses ned som en tørr pellets eller man kan fortsette med genomisk DNA-ekstraksjon. På tidspunktet for DNA-ekstraksjon, resuspend pellets i 200 μL fosfat buffer saltvann (PBS) og trekke ut genomisk DNA fra elektroporated celler ved hjelp av en standard DNA ekstraksjon kit i henhold til produsenten instruksjon.
- Kort sagt lyser lyse celler med proteinase K og laster lysat på en DNA-bindende kolonne. Under sentrifugering er DNA bindende for membranen, mens forurensninger vil passere gjennom. Etter to vasketrinn for å fjerne gjenværende forurensninger og enzymhemmere, elute DNA i vann.
- Forsterke 200-300 ng genomisk DNA ved hjelp av standard PCR-blanding som inneholder DNA-polymerase, tilbehørsproteiner, salter og dNTPer og 10 μM fremover og omvendt primere som flankerer regionen av den tiltenkte dobbeltstrengspausen.
MERK: For PCR primer design, referansen genomisk sekvens (kan bli funnet ved hjelp av http://www.ensemble.org) flankering gRNA kuttet området er inngått i NCBI primer blast verktøyet (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). PCR primere bør utformes slik at amfinen har en målstørrelse på 600-700bp. Denne lengden gjør det mulig å designe sekvenserende primere som binder seg innenfor amfinen med tilstrekkelig avstand fra gRNA-kuttestedet (minst 150 bp) for å sikre god sekvenseringskvalitet rundt Cas9-induserte indels (se 4.2.1). Hver gRNA krever et unikt primerpar, med mindre gRNA-kuttestedene er i nærheten. - Kjør hele PCR-produktet på en 1% agarose gel og rens forsterkningen ved hjelp av et standard agarose gelrensesett.
MERK: Prosessen med å bestemme den optimale Tm for PCR kan ta flere runder med feilsøking. Dette er fordi KO-sekvensen har indels og målgenet skal være primet for sekvensering der det ikke ville være noen indels vanligvis 100 bp oppstrøms eller nedstrøms av kuttestedet. Dette kan variere mye på grunn av indels som følge av ikke-homolog slutt sammenføyning. Å designe nestede sekvenseringsprimere til PCR-primerne og øke konsentrasjonen av produktsekvenserte kan eliminere problemer med sekvensering.
- Fra hver screeningkultur spinner du ned 3-5 x 106 T-celler. Celler kan enten fryses ned som en tørr pellets eller man kan fortsette med genomisk DNA-ekstraksjon. På tidspunktet for DNA-ekstraksjon, resuspend pellets i 200 μL fosfat buffer saltvann (PBS) og trekke ut genomisk DNA fra elektroporated celler ved hjelp av en standard DNA ekstraksjon kit i henhold til produsenten instruksjon.
- Gjenkjenning av sekvensering og indel
- Design sekvensering primere som binder seg til gel renset amplikon og sende mock og knockout amplikoner for Sanger sekvensering. Når sekvenseringen er fullført, laster du opp sporingsfilene til Desktop Genetics-programvaren (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) for TIDE-analyse.
- For sekvensering av primerdesign, skriv inn sekvensen av PCR-amplikonen i en standard primerdesignprogramvare (NCBI, Eurofins eller andre offentlig tilgjengelige verktøy). Designprogramvaren vil foreslå flere primersekvenser som passer til sangersekvensering.
- Velg fremover og bakover primere som binder seg innenfor amfinen minst 150 bp oppstrøms eller nedstrøms gRNA-kuttestedet for å sikre god sekvenseringskvalitet rundt indels. Sekvenseringskromatogrammet vil bli brukt i 4.2 for TIDE-analyse, derfor er det viktig at sekvenseringskvaliteten er god for nøyaktig nedbrytning av indel (se Hultquist et al.) 25.
- Bruk TIDE-analyse (Tracking of Indels by DEcomposition) til å oppdage utstansingseffektivitet (KO) på genomisk nivå26. Algoritmen rekonstruerer nøyaktig spekteret av indels fra sekvenssporene og beregner R2-verdier, noe som gjenspeiler god passform etter ikke-negativ lineær modellering av TIDE-programvaren.
- Design sekvensering primere som binder seg til gel renset amplikon og sende mock og knockout amplikoner for Sanger sekvensering. Når sekvenseringen er fullført, laster du opp sporingsfilene til Desktop Genetics-programvaren (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) for TIDE-analyse.
- Målproteindeteksjon
- For målgener hvis genprodukt uttrykkes på overflaten av T-celler, flekk ca. 1 x 105 celler fra hver screeningkultur med et fluorokrommerket antistoff som er spesifikt for målproteinet. Sammenlign uttrykksnivåene til målproteinet mellom spottekontrollen og utstansingsgruppene ved strømningscytometri som vist i figur 3A,3B.
- For målgener hvis genprodukt uttrykkes intracellulært, lyser ca. 3 x 106 millioner celler per screeninggruppe i lysisbuffer og følger standardprotokoller for SDS-PAGE og vestlig blotting. Alternativt kan overflate eller intracellulær strømningscytometri brukes til å sonde for målproteinet.
5. Overvåking av off-target effekter ved hjelp av iGUIDE - Bibliotek forberedelse, DNA-sekvensering, og analyse
MERK: iGUIDE-teknikken gjør det mulig å oppdage steder av Cas9-styrt spalting og kvantifisere distribusjonene av disse DNA-dobbeltstrengede pausene.
- Utfør iGUIDE som beskrevet av Nobles et al.21. Off-target effekten av sgRNA rettet mot TRAC locus ved hjelp av iGUIDE teknikken har blitt vist i Stadtmauer et al, 202013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver her en protokoll for genmodifiserte T-celler, som kan brukes til å generere både autologe og allogene CAR-T-celler, samt TCR omdirigerte T-celler.
Figur 1 gir en detaljert beskrivelse av stadiene som er involvert i prosessen med produksjon av CRISPR-redigerte T-celler. Prosessen begynner med å designe sgRNA til genet av interesse. Når sgRNA er designet og syntetisert, brukes de deretter til å lage RNP-komplekser med riktig Cas-protein. T-celler er isolert fra enten en sunn donor eller en pasientaferese, og RNP-komplekser leveres enten ved elektroporasjon eller kjerneofeksjon. Etter redigering aktiveres og transduseres T-cellene med lentiviral vektorkoding for CAR- eller TCR-konstruksjonen. Etter aktivering utvides T-celler i kultur og kryopreserveres for fremtidige studier. Den detaljerte protokollen som følges i laboratoriet, er beskrevet i figur 2. Under utvidelsen spores populasjonens dobling og volumendringer gjennom hele protokollen, og et eksempel vises i figur 2B og C for både mock og redigerte CAR-T-celler. Figur 2B,C viser at KO av genet av interesse ikke forårsaket noen betydelige endringer i spredning og aktivering under utvidelsen. Disse resultatene avhenger imidlertid av at målgenet redigeres og dermed kan føre til endringer i spredning og ekspansjon.
Når cellene er kryopreservert, bestemmes også nivåene av CAR-uttrykk for videre funksjonelle studier. I dette tilfellet, som vist i figur 2D, sjekket vi CD19 CAR-uttrykket på både Mock-redigerte og KO CAR-T-celler og så ingen betydelige endringer. Dette vil igjen avhenge av at genet av interesse blir redigert. Til slutt kan KO-effektiviteten bestemmes ved hjelp av flere teknikker som strømningscytometri og vestlig flekk for proteinnivådeteksjon og også Sanger-sekvensering for gennivådeteksjon av KO. Figur 3A og 3B viser representative flytcytometriplott der PDCD1- og TRAC-locus er målrettet ved hjelp av sgRNA, som viser en effektivitet på 90% for PDCD1 sgRNA og 98% for TRAC sgRNA på tvers av flere friske givere. Dermed kan denne protokollen oppnå høy effektivitet knockout med minimal tap av levedyktighet.
Figur 1. Skjematisk diagram som viser T-celleredigering ved hjelp av CRISPR Cas9-teknologi og produksjon av primære menneskelige CAR-T-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Utvidelse av redigerte CAR-T celler og deres befolkning doblinger. (A) Tidslinje for CRISPR-redigering og produksjon i primære menneskelige CART-celler. (B) Befolkningsdoblinger i Mock- og CRISPR-redigerte CD19 CAR-T-celler målt ved hjelp av en Coulter Counter under utvidelsen av CAR-T-cellene (n = 3 friske givere; KO=knockout) (C) Cellestørrelse (μm3) målt ved hjelp av en Coulter Counter under utvidelsen av CAR-T-cellene (n =3 friske donorer). (D) Representative flow cytometri tomter som viser CAR farging og gjennomsnitt i flere givere viser CAR uttrykk i både mock og redigert CAR-T celler. CAR-uttrykk ble oppdaget ved hjelp av et anti-idiotype antistoff som ble konjugert til en fluorofor og inngjerdet på lymfocytter/singlets/levende celler (n =3 friske donorer, UTD =utransdusert,). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Karakteriserer KO-effektivitet i redigerte CAR-T-celler ved hjelp av strømningscytometri. (A) Representative flow cytometri tomter som viser PD-1 farging og gjennomsnitt i flere givere som viser PD-1 KO effektivitet ved hjelp av en gRNA rettet mot TRAC locus i mock og redigert CAR-T celler. PD-1-uttrykk ble påvist ved hjelp av PD-1 antistoff (Klone EH12.2H7) som ble konjugert til fluorofor og inngjerdet på lymfocytter/singlets/levende celler (n=3 friske donorer). Feilfelt indikerer middelmavn±standardfeil for gjennomsnittet (SEM). p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 av Welchs t-test. (B) Representative flow cytometriplott som viser CD3-farging og gjennomsnitt i flere givere som viser CD3 KO-effektivitet ved hjelp av en gRNA rettet mot TRAC-locus i mock og redigerte CAR-T-celler. CD3-uttrykk ble oppdaget ved hjelp av CD3 antistoff (Klone OKT3) konjugert til fluorofor og inngjerdet på lymfocytter / singlets / levende celler (n = 3 friske givere). Feilfelt indikerer middelmavn±standardfeil for gjennomsnittet (SEM). p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 av Welchs t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi tilnærminger til genredigering av CAR-T-celler ved hjelp av CRISPR Cas9-teknologi og produserer produkter for ytterligere testing for funksjon og effekt. Ovennevnte protokoll er optimalisert for å utføre CRIPSR genredigering i primære menneskelige T-celler kombinert med tekniske T-celler med chimeriske antigenreseptorer. Denne protokollen gir høy knockout-effektivitet med minimal donor-til-donor-variasjon. Modifikasjon ved hjelp av CRISPR kan forbedre både effekt og sikkerhet av CAR-T celler ved å eliminere reseptorer som hemmer T celler funksjon og produksjon allogen CAR-T celler.
For utvidelsesprotokoller i liten skala fører fra og med 106 celler per gruppe til rundt 5006 CAR-T-celler med et gjennomsnitt på 6 befolkningsdoblinger i en sunn normaldonor. Dette kan imidlertid variere avhengig av om genet av interesse påvirker T-celleaktivering, transduksjon og spredning. Fem hundre millioner celler er tilstrekkelige til å bekrefte KO-effektivitet, in vitro-analyser og in vivo-analyser. Det er forskjellige variasjoner i protokollen der CRISPR-redigering kan utføres før eller etter aktivering og CAR-Transduksjon. Ren et al beskrev en slik variasjon der celler redigeres etter perlestimulering og CAR-Transduksjon15. Fordelen med CRISPR-redigering før perlestimulering er lavere cellemengder må redigeres siden T-cellene ikke har spredt seg ennå, noe som gjør prosedyren mindre tidkrevende og mer kostnadseffektiv. I tillegg kan redigering på forhånd oversettes direkte til klinikken. Faktisk har mange trinn i denne protokollen blitt informert av hva som kan vedtas i klinikken som øker konsistensen av KO-effektiviteten når du flytter fra benk til sengeside.
Det finnes flere variabler som kan velges i hvert trinn i protokollen. For eksempel kan T-celler elektroporated eller nukleofected. Mens begge oppnår sammenlignbar KO-effektivitet, har vi etter vår erfaring med å bruke nukleofektoren høyere levedyktighet etter redigering og er derfor foretrukket. Bruk av elektroporatoren kan imidlertid vise seg å være mer kostnadseffektivt i det lange løp. Begge disse utstyret brukes til småskala T-celleutvidelser. For utvidelser i stor skala og klinisk skala må protokoller optimaliseres på nytt for å utføre redigering og krever forskjellig utstyr for kjerneofeksjon. Det er flere teknologiske plattformer som kan brukes til både småskala og storskala redigering og utvidelse avhengig av brukerens behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Human Immunology Core for å gi normale donor T-celler og Flow Cytometry Core ved University of Pennsylvania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
