Summary
Здесь мы представляем протокол редактирования генов в первичных Т-клетках человека с использованием технологии CRISPR Cas для модификации CAR-T-клеток.
Abstract
Приемная клеточная терапия с использованием Т-клеток рецептора химерного антигена (CAR-T-клетки) продемонстрировала замечательную клиническую эффективность у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время исследуется на предмет различных солидных опухолей. CAR-T-клетки генерируются путем удаления Т-клеток из крови пациента и их разработки для экспрессии синтетического иммунного рецептора, который перенаправляет Т-клетки для распознавания и устранения опухолевых клеток-мишеней. Редактирование генов CAR-T-клеток имеет потенциал для повышения безопасности современных CAR-T-клеточных терапий и дальнейшего повышения эффективности CAR-T-клеток. Здесь мы описываем методы активации, расширения и характеристики CD19-направленных CAR-T-клеток человека, спроектированных CRISPR. Это включает в себя трансдукцию лентивирусного вектора CAR и использование однонаправленной РНК (sgRNA) и эндонуклеазы Cas9 для нацеливания генов, представляющих интерес в Т-клетках. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть универсально применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням, помимо тех, которые используются для этого исследования. Кроме того, в этом протоколе обсуждаются стратегии проектирования гРНК, отбора свинцовой гРНК и валидации нокаута генов-мишеней для воспроизводимого достижения высокоэффективной мультиплексной инженерии CRISPR-Cas9 Т-клеток человека клинического класса.
Introduction
Терапия химерными антигенными рецепторами (CAR)-Т-клетками произвела революцию в области приемной клеточной терапии и иммунотерапии рака. CAR-T-клетки представляют собой инженерные Т-клетки, экспрессирующие синтетический иммунный рецептор, который сочетает антиген-специфический фрагмент одноцепочечного антитела с сигнальными доменами, полученными из цепи TCRzeta, и костимуляторными доменами, необходимыми и достаточными для активации Т-клеток и костимуляции1,2,3,4 . Производство CAR-T-клеток начинается с извлечения собственных Т-клеток пациента, за которыми следует вирусная трансдукция ex vivo модуля CAR и расширение продукта CAR-T-клеток магнитными шариками, которые функционируют как искусственные антиген-презентационные клетки5. Расширенные CAR-T-клетки повторно вводятся пациенту, где они могут приживляться, устранять опухолевые клетки-мишени и даже сохраняться в течение нескольких лет после инфузии6,7,8. Хотя терапия CAR-T-клетками привела к замечательным показателям ответа при злокачественных новообразованиях В-клеток, клинический успех солидных опухолей был поставлен под сомнение несколькими факторами, включая плохую инфильтрацию Т-клеток9,иммуносупрессивную микроокружение опухоли10,охват и специфичность антигена и дисфункцию CAR-T-клеток11,12 . Другое ограничение современной терапии CAR-T-клетками включает использование аутологицных Т-клеток. После нескольких раундов химиотерапии и высокой опухолевой нагрузки CAR-T-клетки могут быть низкого качества по сравнению с аллогенными продуктами CAR-T от здоровых доноров в дополнение ко времени и затратам, связанным с производством аутологичных CAR-T-клеток. Генное редактирование продукта CAR-T-клеток с помощью CRISPR/Cas9 представляет собой новую стратегию преодоления существующих ограничений CAR-T-клеток13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 представляет собой двухкомпонентную систему, которая может быть использована для целенаправленного редактирования генома в клетках млекопитающих18,19. CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9 может индуцировать сайт-специфические двухцепочечные разрывы, управляемые небольшими РНК, путем спаривания оснований с целевой последовательностью ДНК20. При отсутствии шаблона восстановления двухцепочечные разрывы восстанавливаются по подверженному ошибкам пути негомологичных конечных соединений (NHEJ), что приводит к мутациям сдвига кадра или преждевременным стоп-кодонам через мутации вставки и делеции (INDL)19,20,21. Эффективность, простота использования, экономичность и возможность мультиплексного редактирования генома делают CRISPR/Cas9 мощным инструментом для повышения эффективности и безопасности аутологичных и аллогенных CAR-T-клеток. Этот подход также может быть использован для редактирования TCR-направленных Т-клеток путем замены конструкции CAR на TCR. Кроме того, аллогенные CAR-T-клетки, которые имеют ограниченный потенциал вызывать болезнь трансплантата по сравнению с болезнью хозяина, также могут быть сгенерированы путем редактирования генов локуса TCR, b2m и HLA.
В этом протоколе мы показываем, как CRISPR-инженерия Т-клеток может быть объединена с вирусной векторной доставкой CAR-Transgene для генерации отредактированных геномом продуктов CAR-T-клеток с повышенной эффективностью и безопасностью. Принципиальная схема всего процесса показана на рисунке 1. Используя этот подход, мы продемонстрировали высокоэффективный нокаут гена в первичных клетках CAR-T человека. На рисунке 2A подробно описана временная шкала каждого этапа редактирования и изготовления Т-клеток. Также обсуждаются стратегии проектирования направляющей РНК и нокаутной валидации для применения этого подхода к различным генам-мишеням.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человеческие Т-клетки были закуплены через Университет Пенсильвании Human Immunology Core, который работает в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики с установленными стандартными операционными процедурами и / или протоколами для получения, обработки, замораживания и анализа образцов, соответствующих этическим принципам MIATA и Университета Пенсильвании.
1. Лентивирусная векторная продукция
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные продукты были сделаны дефектными репликации путем разделения упаковочных конструкций (Rev, gag/pol/RRE, VSVg и трансферная плазмида) на четыре отдельные плазмиды, что значительно снижает вероятность событий рекомбинации, которые могут привести к репликационно-компетентному вирусу.
- Подготовьте клетки HEK293T за день до трансфекции. Пластинчат примерно 6 х 106 клеток в сосудах культивирования T150 в 30 мл стандартной культуральной среды (называемой R10: RPMI 1640, дополненной 10% сывороткой плодного теленка, 10 мМ HEPES, 1% Ручка / Стрептококк, 1% L-глутамина) и инкубировать в течение ночи при 37 °C. Через 18-24 ч клетки должны быть 60-70% слитыми и выглядеть здоровыми (дендритные выступы и равномерное распределение по колбе). Если клетки выглядят здоровыми, перейдите к шагу 1.2.
- Готовят трансфекционную смесь, содержащую реагент липофекции (96 мкл), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 мкг), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-3) (18 мкг), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 мкг), упаковочные плазмиды и 15 мкг экспрессии плазмиды (CD19bbz scFv, клонированный в pTRPE).
- Для каждой трансфекционной реакции готовят одну трубку, содержащую 1 мл восстановленной сывороточной минимальной существенной среды плюс четыре плазмиды, описанные на этапе 1.2, а также одну трубку, содержащую 2 мл восстановленной сывороточной минимальной существенной среды плюс 90 мкл липофекционного реагента. Объедините эти два раствора путем капельного добавления плазмидной смеси 1 мл к 2 мл смеси липофекционных реагентов. Обязательно энергично перемешайте раствор, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Инкубировать раствор в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Тем временем аспирируйте среду из клеточной колбы HEK293T и осторожно промывайте клетки 10 мл восстановленной сывороточной минимально необходимой среды и снова аспирируйте.
- Осторожно добавьте трансфекционную смесь (3 мл) с этапа 1.2.1 в нижний угол колбы для культивирования клеток с помощью серологической пипетки 5 мл. Осторожно наклоните колбу, чтобы равномерно распределить трансфекционную смесь по колбе для культивирования клеток и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что не нарушается монослой клеток. После 10 мин инкубации добавляют 35 мл среды R10 и возвращают колбу в инкубатор в течение 24 ч.
- Через 24 ч собирают супернатант из колб для культивирования клеток HEK293T и переносят в конические трубки по 50 мл. Добавьте свежий R10 в клетки HEK29T и поместите клетки обратно в инкубатор еще на 24 ч. Открутите супернатант (300 x g) для удаления остатков клеток и фильтруйте супернатант через фильтр 0,45 мкм.
- Концентрировать фильтрат на этапе 1.3 высокоскоростным ультрацентрифугированием (25 000 х г в течение 2,5 ч или 8000 х г в течение ночи (O/N)). Храните 24-ч вирусную гранулу при 4 °C, накапливая 48-ч вируса.
- Повторите шаги 1.3-1.4 для 48-ч сбора и объедините 24-ч и 48 ч вирусных коллекций. Пеллеты из 48-хочного сбора будут содержать комбинированный урожай лентивируса.
- Повторное суспендирование вирусных гранул примерно в 1 мл холодного R10 и аликвота в 100 мкл во флаконах. Немедленно заморозьте аликвоты с помощью сухого льда и храните при -80 °C.
- Рассчитать функциональный вирусный титр в трансдуцированных единицах/мл путем трансдукции фиксированного количества CD3/CD28 активированных шариками первичных Т-клеток человека с последовательным разбавлением лентивирусного супернатанта. Измеряют CAR-трансдукцию через 72 ч с помощью проточной цитометрии.
- Окрашивание для CD19-направленного CAR с антителом против FCM63 scFv. Для других химерных антигенных рецепторов окрашивают с помощью флуорофора меченого рекомбинантного белка, который специфичн для CAR scFv. Разбавление вирусом, которое генерирует менее 20% CAR-положительных клеток с помощью проточной цитометрии, является наиболее точным разбавлением для расчета титра вируса. Выше 20% CAR-положительных клеток вероятность трансдукции каждой положительной клетки увеличивается в два раза, что приводит к недооценке количества трансдуцирующих частиц. Рассчитайте единицы преобразователя на мл (TU/mL) = (количество трансдуцированных клеток x процент положительных клеток CAR x коэффициент разбавления)/(объем трансдукции в мл).
2. Проектирование sgRNAs и разрушение генов в первичных Т-клетках человека
- Проектирование CRISPR sgRNA
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько серверов и программ облегчают проектирование целевых sgRNA. В этом протоколе CRISPR sgRNAs были разработаны с использованием CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) и портала проектирования гРНК от Института Броуда (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- Для каждого гена-мишени разработайте от шести до десяти последовательностей sgRNA для нацеливания на ранние кодирующие последовательности экзонов.
ПРИМЕЧАНИЕ: sgRNA должна иметь высокую эффективность на мишени и низкую эффективность вне цели. Каждый алгоритм машинного обучения для определения эффективности sgRNA работает немного по-разному. Поэтому рекомендуется сравнить несколько инструментов проектирования сгРНК и составить список из шести-десяти сгРНК для скрининга.
- Для каждого гена-мишени разработайте от шести до десяти последовательностей sgRNA для нацеливания на ранние кодирующие последовательности экзонов.
- Разрушение генов в первичных Т-клетках человека
- Получение аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых доноров-добровольцев. Схематическая временная шкала протокола описана на рисунке 2A и описана ниже.
- Изолируйте CD4+ и CD8+ Т-клетки с помощью коммерчески доступных наборов CD4 и CD8.
- Комбинируйте CD4+ и CD8+ Т-клетки в соотношении 1:1 и инкубируйте в течение ночи при 3x106 клеток / мл в R10, дополненном 5 нг / мл huIL-7 и huIL-15 каждый. Рекомендуется добавление IL-7 и IL-15, поскольку они, как известно, способствуют повышению фенотипа центральной памяти, а CAR-T-клетки, расширенные IL-7 и IL-15, имеют превосходную противоопухоляевую эффективность по сравнению с расширенными IL-2 CAR-T клетками22,23,24.
- На следующий день подсчитывают Т-клетки и центрифугу 5-10 х 106 клеток при 300 х г в течение 5 мин. Выбросьте все супернатанты и промыть гранулы клеток в минимально необходимых средах с пониженной сывороткой. Повторно суспендировать гранулу в 100 мкл раствора нуклеофекции согласно инструкции производителя(Таблица материалов).
- При промывке клеток готовят комплекс рибонуклеопротеинов (РНП) с Cas9 и гРНК путем инкубации 10 мкг нуклеазы Cas9 с 5 мкг сгРНК в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Молярное отношение Cas9 к sgRNA составляет 1:2,4. Рекомендуется имитация контроля, которая содержит Cas9 и усилитель электропорации, но без sgRNA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мультиплексное редактирование генов может быть выполнено на этом этапе путем создания комплексов RNP для каждой мишени отдельно и объединения их с клетками на момент нуклеофекции, как описано на следующем этапе. Выбор реагентов для сборки комплекса RNP является ключом к получению высокой эффективности НОКАУТ. Например, нуклеазы Cas9 от разных поставщиков имеют различные нецелевые эффекты, а химически модифицированная гРНК снижает токсичность для Т-клеток, тем самым повышая эффективность КО. - Объедините ресуспендированные клетки со ступени 2.2.4 с комплексом RNP из этапа 2.2.5 и добавьте 4,2 мкл электропорационного энхансера 4 мкМ (олигонуклеотид ssDNA, который не гомологичен геному человека). Хорошо перемешать и переложить в электропорационные кюветы. Избегайте пузырьков, так как они ухудшают эффективность электропорации.
- Электропоратные ячейки с использованием импульсного кода EH111. После электропорации инкубируют клетки в R10, дополненные 5 нг/мл huIL-7 и huIL-15 при 5x106 клеток/мл при 30 °C в течение 48 ч в 12-скважинных пластинах. Через 48 ч приступайте к активации и расширению Т-клеток.
3. Активация Т-клеток, лентивирусная трансдукция и расширение
ПРИМЕЧАНИЕ: Для скрининга сгРНК лентивирусная трансдукция (шаг 3.2) конструкции CAR не требуется.
- Подсчитайте электропорированные Т-клетки и разбавьте до концентрации 1 х 106 клеток/мл с использованием теплого R10, дополненного 5 нг/мл huIL-7 и huIL-15. Активируйте клетки путем добавления магнитных шариков с покрытием моноклональным антителом анти-CD3 / анти-CD28 в соотношении 3 шарика на живую Т-клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорация вызывает значительную гибель клеток, что приводит примерно к 60% ± 15% жизнеспособных клеток по сравнению с неэлектропоратными клетками. Используйте количество живых/мертвых клеток, чтобы определить соответствующее количество бусин. Перенесите клетки до 37 °C и высиживают в течение ночи. - После ночной стимуляции трансдукцию С ПОМОЩЬЮ CRISPR-инженерных Т-клеток с лентивирусным супернатантом с этапа 1. Добавьте соответствующий объем на основе вирусного титра, рассчитанного на этапе 1.7, чтобы достичь кратности инфекции (MOI) 3 и инкубировать клетки в течение 72 ч при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула вируса, повторно суспендированная в R10, просто добавляется поверх клеток в соответствии с концентрацией клеток, вирусным титром и желаемым MOI. - Через 72 ч кормят клетки с 50% текущего объема культуры R10, содержащим 10 нг/мл huIL-7 и huIL-15 и возвращают их в инкубатор еще на 48 ч. Не беспокоить скопления, образовавающиеся между Т-клетками и бусинами.
- Через 48 ч удалите шарики из ячеек, осторожно повторно развернув смесь ячеек и шариков с последующим магнитным разделением. Подсчитать клетки после удаления шарика и довести до концентрации 0,8 х 106 клеток/мл с помощью R10, дополненного 5 нг/мл huIL-7 и huIL-15. После де-бисероплетения количество клеток должно быть аналогично количеству клеток на 1-й день до электропорации(рисунок 2B).
- Через 24 ч подсчитывают клетки и кормят до концентрации 1х 10 6 клеток/мл с R10 + 5 нг/мл huIL-7 и huIL-15. Повторяйте это каждые 24 ч, пока кинетика роста и размер клеток не продемонстрируют, что клетки отдохнули от стимуляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента Т-клетки удваиваются примерно каждые 24 ч. Т-клетки обычно подвергаются 5-7 удвоениям популяции и имеют клеточный объем примерно 300 ± 50 fL в состоянии покоя. - После отдыха откачивайтесь от разработанных CRISPR CAR-T-клеток и повторно суспендируем в морозильных средах (1:1 X-Vivo и FBS плюс 10% DMSO) для криоконсервации. Используемые CAR-T-клетки следует разморозить и покоить при 37 °C в течение 16 часов перед экспериментом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите приблизительно 10x106 ячеек зарезервированными для измерения эффективности нокаута и интеграции CAR. Ожидаемые удвоения населения и изменения объема во время расширения были показаны на рисунке 2B,2C. Кроме того, на рисунке 2D показаны уровни экспрессии CAR как на Mock, так и на генетически отредактированных CAR-T клетках.
4. Эффективность CRISPR
- Геномная экстракция ДНК и амплификация генов-мишеней
- От каждой скрининговой культуры вращайте вниз 3-5 х 106 Т-клеток. Клетки могут быть либо заморожены в виде сухой гранулы, либо можно приступить к геномной экстракции ДНК. Во время экстракции ДНК повторно суспендируют гранулы в 200 мкл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и извлекают геномную ДНК из электропорированных клеток с использованием стандартного набора для экстракции ДНК в соответствии с инструкцией производителя.
- Вкратце, лизируют клетки протеиназой К и загружают лизат на ДНК-связывающую колонку. Во время центрифугирования ДНК связывается с мембраной, в то время как загрязняющие вещества будут проходить через нее. После двух этапов промывки для удаления оставшихся загрязнений и ингибиторов ферментов элюирует ДНК в воде.
- Амплифицировать 200-300 нг геномной ДНК с помощью стандартной ПЦР-смеси, содержащей ДНК-полимеразу, вспомогательные белки, соли и дНТП и 10 мкМ вперед и обратно праймеров, фланкирующих область предполагаемого двухцепочечного разрыва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проектирования праймера ПЦР эталонная геномная последовательность (которую можно найти с помощью http://www.ensemble.org), фланкированная участком разреза гРНК, вводится в бластный инструмент NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Праймеры ПЦР должны быть сконструировались таким образом, чтобы ампликоны были размер мишени 600-700бп. Такая длина позволяет проектировать секвенирование праймеров, которые связываются внутри ампликона на достаточном расстоянии от участка разреза гРНК (не менее 150 bp) для обеспечения хорошего качества секвенирования вокруг индуцированных Cas9 индел (см. 4.2.1). Каждая гРНК требует уникальной пары праймеров, если только участки разреза гРНК не находятся в непосредственной близости. - Запустите весь продукт ПЦР на 1% агарозном гелевом и очистите ампликон с помощью стандартного набора для очистки агарозного геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс определения оптимального Tm для ПЦР может занять несколько раундов поиска и устранения неисправностей. Это связано с тем, что последовательность KO имеет индели, и ген-мишень должен быть праймирован для секвенирования там, где не было бы инделов, обычно 100 bp вверх или вниз по течению от участка разреза. Это может варьироваться в широких масштабах из-за инделей, возникающих в результате негомологичных конечных соединения. Проектирование вложенных праймеров секвенирования к праймерам ПЦР и увеличение концентрации секвенированного продукта может устранить проблемы с секвенированием.
- От каждой скрининговой культуры вращайте вниз 3-5 х 106 Т-клеток. Клетки могут быть либо заморожены в виде сухой гранулы, либо можно приступить к геномной экстракции ДНК. Во время экстракции ДНК повторно суспендируют гранулы в 200 мкл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и извлекают геномную ДНК из электропорированных клеток с использованием стандартного набора для экстракции ДНК в соответствии с инструкцией производителя.
- Секвенирование и обнаружение indel
- Проектируйте грунтовки для секвенирования, которые связываются с гелевым очищенным ампликоном и отправляют макет и нокаутирующие ампликоны для секвенирования Сэнгера. После завершения секвенирования загрузите файлы трассировки в программное обеспечение Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) для анализа TIDE.
- Для секвенирования конструкции грунтовки введите последовательность ампликона ПЦР в стандартное программное обеспечение для проектирования грунтовки (NCBI, Eurofins или другие общедоступные инструменты). Программное обеспечение для проектирования предложит несколько последовательностей праймеров, которые подходят для последовательности сэнгера.
- Выбирайте прямую и обратную праймеры, которые связываются внутри ампликона не менее 150 bp вверх или вниз по течению от участка разреза гРНК, чтобы обеспечить хорошее качество секвенирования вокруг инделей. Секвенирование хроматограммы будет использоваться в 4.2 для анализа TIDE, поэтому важно, чтобы качество секвенирования было хорошим для точного индельного разложения (см. Hultquist et al.) 25 г.
- Используйте анализ TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) для определения эффективности нокаута (KO) на геномном уровне26. Алгоритм точно реконструирует спектр индел из следов последовательности и вычисляет значения R2, отражающие хорошую посадку после неотрицательного линейного моделирования программным обеспечением TIDE.
- Проектируйте грунтовки для секвенирования, которые связываются с гелевым очищенным ампликоном и отправляют макет и нокаутирующие ампликоны для секвенирования Сэнгера. После завершения секвенирования загрузите файлы трассировки в программное обеспечение Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) для анализа TIDE.
- Обнаружение целевого белка
- Для генов-мишеней, генный продукт которых экспрессируется на поверхности Т-клеток, окрашивают примерно 1 х 105 клеток из каждой скрининговой культуры фторхромным антителом, специфичным для белка-мишени. Сравните уровни экспрессии целевого белка между имитацией контрольной и нокаутной группами с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 3A,3B.
- Для генов-мишеней, генный продукт которых экспрессируется внутриклеточным образом, лизирует примерно 3 х 106 миллионов клеток на группу скрининга в буфере лизиса и следует стандартным протоколам для SDS-PAGE и западного блоттинга. Альтернативно, поверхностная или внутриклеточная проточная цитометрия может быть использована для зондирования белка-мишени.
5. Мониторинг нецелевых эффектов с помощью iGUIDE - подготовка библиотеки, секвенирование и анализ ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод iGUIDE позволяет обнаруживать местоположения управляемого расщепления Cas9 и количественно оценивать распределение этих двухцепочечных разрывов ДНК.
- Выполните iGUIDE, как описано Nobles et al.21. Нецелевые эффекты sgRNA, нацеленной на локус TRAC с использованием метода iGUIDE, были показаны в Stadtmauer et al, 202013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы описываем здесь протокол генетической инженерии Т-клеток, который может быть использован для генерации как аутологичных, так и аллогенных CAR-T-клеток, а также TCR-перенаправленных Т-клеток.
На рисунке 1 приведено подробное описание этапов, участвующих в процессе изготовления CRISPR отредактированных Т-клеток. Процесс начинается с проектирования sgRNA для интересующего гена. Как только sgRNA разработаны и синтезированы, они затем используются для создания комплексов RNP с соответствующим белком Cas. Т-клетки выделяют либо у здорового донора, либо у пациента, а комплексы RNP доставляются либо путем электропорации, либо путем нуклеофекции. После редактирования Т-клетки активируются и трансдуцируются лентивирусным векторным кодированием для конструкции CAR или TCR. После активации Т-клетки расширяются в культуре и криоконсервируются для будущих исследований. Подробный протокол, соблюдаемый в лаборатории, описан на рисунке 2. Во время расширения удвоение популяции и изменения объема отслеживаются по всему протоколу, и пример показан на рисунке 2B и C как для имитации, так и для отредактированных CAR-T-клеток. Рисунок 2B,C показывает, что KO интересуемого гена не вызывал каких-либо существенных изменений в пролиферации и активации во время расширения. Эти результаты, однако, зависят от редактируемого гена-мишени и, следовательно, могут или не могут привести к изменениям в пролиферации и расширении.
Как только клетки криоконсервированы, уровни экспрессии CAR также определяются для дальнейших функциональных исследований. В этом случае, как показано на рисунке 2D, мы проверили экспрессию CD19 CAR как на Mock edited, так и на KO CAR-T клетках и не увидели каких-либо существенных изменений. Это снова будет зависеть от редактируемого гена интереса. Наконец, эффективность НОКАУТа может быть определена с использованием нескольких методов, таких как проточная цитометрия и вестерн-блот для определения уровня белка, а также секвенирование Сэнгера для обнаружения KO на уровне генов. На рисунках 3A и 3B показаны репрезентативные участки проточной цитометрии, где PDCD1 и локус TRAC нацелены с использованием sgRNA, показывая эффективность 90% для pDCD1 sgRNA и 98% для TRAC sgRNA у нескольких здоровых доноров. Таким образом, данный протокол позволяет добиться высокой эффективности нокаута с минимальными потерями жизнеспособности.
Рисунок 1. Принципиальная схема на монтаж Т-клеток с использованием технологии CRISPR Cas9 и производство первичных человеческих CAR-T-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Расширение отредактированных CAR-T-клеток и удвоение их популяции. (A) Хронология редактирования и производства CRISPR в первичных клетках CARTчеловека. (B) Удвоение популяции в Mock и CRISPR отредактированных CD19 CAR-T клетках, измеренных с использованием счетчика Coulter во время расширения CAR-T-клеток (n = 3 здоровых донора; KO=нокаут) (C) Размер клеток (мкм3), измеренный с использованием счетчика култера во время расширения CAR-T-клеток (n = 3 здоровых донора). (D)Репрезентативные графики проточной цитометрии, показывающие окрашивание CAR и среднее значение у нескольких доноров, показывающие экспрессию CAR как в макетных, так и в отредактированных CAR-T-клетках. Экспрессия CAR была обнаружена с использованием антиидидидипепного антитела, конъюгированного с флуорофором и закрытого на лимфоциты / синглеты / живые клетки (n = 3 здоровых донора, UTD = нетрансдуцированный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Характеристика эффективности КО в отредактированных CAR-T-клетках с помощью проточной цитометрии. (A)Репрезентативные графики проточной цитометрии, показывающие окрашивание PD-1 и среднее значение у нескольких доноров, показывающие эффективность PD-1 KO с использованием гРНК, нацеленной на локус TRAC в имитационных и отредактированных CAR-T клетках. Экспрессия PD-1 была обнаружена с использованием антитела PD-1 (клон EH12.2H7), конъюгированного с флуорофором и закрытого на лимфоциты / синглеты / живые клетки (n = 3 здоровых донора). Полосы ошибок указывают на средне±стандартную погрешность среднего значения (SEM). p<0,0001, *** p=0,0005, ** p=0,001 по тесту Уэлча t. (B)Репрезентативные графики проточной цитометрии, показывающие окрашивание CD3 и среднее значение у нескольких доноров, показывающие эффективность CD3 KO с использованием гРНК, нацеленной на локус TRAC в имитационных и отредактированных CAR-T клетках. Экспрессия CD3 была обнаружена с использованием антител CD3 (Clone OKT3), конъюгированных с флуорофором и закрытых на лимфоциты / синглеты / живые клетки (n = 3 здоровых донора). Полосы ошибок указывают на средне±стандартную погрешность среднего значения (SEM). p<0,0001, *** p=0,0005, ** p=0,001 по тесту Уэлча t. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем подходы к редактированию генов CAR-T-клеток с использованием технологии CRISPR Cas9 и производству продуктов для дальнейшего тестирования функции и эффективности. Вышеуказанный протокол был оптимизирован для выполнения редактирования генов CRIPSR в первичных Т-клетках человека в сочетании с инженерными Т-клетками с химерными антигенными рецепторами. Этот протокол обеспечивает высокую эффективность нокаута с минимальной вариабельностью от донора к донору. Модификация с использованием CRISPR может повысить как эффективность, так и безопасность CAR-T-клеток, устраняя рецепторы, которые ингибируют функцию Т-клеток и производя аллогенных CAR-T-клеток.
Для небольших протоколов расширения, начиная с 106 клеток в группе, приводит к примерно 5006 CAR-T-клеткам со средним удвоением популяции в среднем 6 популяций у здорового нормального донора. Однако это может варьироваться в зависимости от того, влияет ли интересующий ген на активацию, трансдукцию и пролиферацию Т-клеток. Пятисот миллионов клеток достаточно для подтверждения эффективности НОКАУТ, анализов in vitro и анализов in vivo. Существуют различные варианты протокола, в которых редактирование CRISPR может быть выполнено до или после активации и CAR-Transduction. Ren et al описали одну из таких вариаций, где клетки редактируются после стимуляции шариков и CAR-transduction15. Преимущество редактирования CRISPR перед стимуляцией шариков заключается в том, что необходимо редактировать меньшее количество клеток, поскольку Т-клетки еще не размножились, что делает процедуру менее трудоемкой и более экономичной. Кроме того, выполнение предварительного редактирования может быть непосредственно переведено в клинику. Фактически, многие шаги в этом протоколе были основаны на том, что может быть принято в клинике, что повышает постоянство эффективности нокаута при переходе от скамейки к постели.
Существует несколько переменных, которые могут быть выбраны на каждом шаге протокола. Например, Т-клетки могут быть электропорированы или нуклеозированы. В то время как оба достигают сопоставимой эффективности KO, по нашему опыту использование нуклеофектора имеет более высокую жизнеспособность после редактирования и, следовательно, является предпочтительным. Тем не менее, использование электропоратора может оказаться более экономически эффективным в долгосрочной перспективе. Оба этих оборудования используются для мелкомасштабного расширения Т-клеток. Для крупномасштабных и клинических расширений протоколы должны быть повторно оптимизированы для выполнения редактирования и требуют другого оборудования для нуклеофекции. Существует несколько технологических платформ, которые могут использоваться как для мелкомасштабного, так и для крупномасштабного редактирования и расширения в зависимости от потребностей пользователя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскрывают информацию.
Acknowledgments
Мы признаем ядро иммунологии человека для обеспечения нормальных донорских Т-клеток и ядро проточной цитометрии в Университете Пенсильвании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
