Summary
이 프로토콜은 해수 및 생물학적 표본에서 지질의 결정을 위한 것입니다. 여과류의 지질은 고체의 경우 클로로폼 또는 클로로폼및 메탄올혼합물로 추출됩니다. 지질 클래스는 화염 이온화 감지와 막대 얇은 층 크로마토그래피에 의해 측정되고 그들의 합계는 총 지질 함량을 제공합니다.
Abstract
지질은 주로 탄소와 수소로 구성되어 있으며, 따라서 바다에서 다른 유기 거대 분자보다 더 큰 특정 에너지를 제공합니다. 탄소와 수소가 풍부하기 때문에 소수성이며 유기 오염 물질용 용매 및 흡수 담체 역할을 할 수 있으므로 해양 생태계에서 오염 물질 바이오 축적의 원동력이 될 수 있습니다. 그들의 소수성 특성은 해수 또는 생물학적 표본에서 그들의 격리를 용이하게 합니다: 해양 지질 분석은 수생 매트릭스에 있는 그밖 물질에서 그들의 분리를 위한 편리한 방법을 제공하는 비 극성 유기 용매에 있는 샘플링 그리고 그 때 추출으로 시작됩니다.
해수를 샘플링한 경우, 첫 번째 단계는 일반적으로 여과에 의한 운영 정의된 '용해'와 '미립자' 진영으로 분리하는 것을 포함합니다. 시료는 진정으로 용존된 물질과 콜로이드를 위해 일반적으로 클로로폼을 사용하여 시료 매트릭스로부터 분리된 지질을 수집하고, 고체 및 생물학적 표본을 위한 클로로폼과 메탄올의 혼합물을 포함한다. 이러한 추출 물 생물 발생 및 인위적 소스에서 여러 클래스를 포함 할 수 있습니다. 이때, 총 지질 및 지질 클래스가 결정될 수 있다. 총 지질은 관례적으로 구분된 개별적으로 결정된 지질 클래스를 합산하여 측정할 수 있습니다. 화염 이온화 검출(FID)을 가진 얇은 층 크로마토그래피(TLC)는 해양 샘플에서 지질의 정량적 분석에 정기적으로 사용됩니다. TLC-FID는 시놉틱 지질 클래스 정보를 제공하며, 클래스를 합산하여 총 지질 측정을 제공합니다.
지질 등급 정보는 지질 추출물에서 방출된 후 지방산 및/또는 스테롤과 같은 개별 성분의 측정과 결합될 때 특히 유용합니다. 지질 구조와 기능의 다양한 그들은 생태계 건강과 인류학적 영향에 의해 영향의 정도를 평가 생태 및 생물 지질 연구에 광범위하게 사용 된다는 것을 의미한다. 그들은 해양 동물군 (예 : 아쿠아 피드 및 / 또는 먹이)에 식이 값의 물질을 측정하고 수질 (예 : 탄화수소)의 지표로 사용되었습니다.
Introduction
여기에 설명 된 방법은 해양 지질으로 작동적으로 정의 되는 물질에 관한. 이 정의는 비극성 유기 용매에서 액체 액체 추출에 대한 그들의 편의성을 기반으로하며 수중 매트릭스에서 다른 물질과 분리하는 편리한 방법을 제공합니다. 그들의 소수성 성질은 바닷물 또는 생물학 견본에서 그들의 격리를, 그들의 농축, 소금과 단백질의 제거를 촉진합니다.
지질 함량의 측정과 해양 생물의 구성은 수십 년 동안 식품 웹 생태학, 양식 영양 및 식품 과학에 큰 관심을 가지고 있습니다. 지질은 살아있는 유기체에 있는 보편적인 분대입니다, 세포막에 있는 필수적인 분자로 작동합니다, 생체 이용 가능한 에너지의 주요 근원으로, 단열 및 부력을 제공하고, 신호 분자로 봉사합니다. 다른 분야에서 지질 측정을 위한 절차가 잘 설명되었지만, 해양 샘플과의 사용은 일반적으로1형뿐만 아니라 현장 조건에 적응하기 위해 수정이 필요하다.
해수 샘플의 경우, 첫 번째 단계는 일반적으로 여과(프로토콜 단계 1)에 의해 작동적으로 정의된 '용해'와 '미립자' 분획으로 분리가 필요합니다. 미립자 분획은 필터에 의해 유지되는 것이며, 모공의 크기는 컷오프2를정의하는 데 중요하다. 종종 미립자 물질을 샘플링할 때 지질 농도를 총 질량 농도에 관련시키고 자하며, 이 경우 별도의 더 작은 샘플(예: 10mL)을 이 목적을 위해 취해야 합니다(프로토콜 단계 1, 참고). 정확한 질량 결정을 얻으려면 여과 끝에 암모늄 포메이트 (35 g/L)를 추가하는 것이 중요합니다.
더 큰 시료로부터의 해수 여과는 시료 유형에 따라 250mL에서 1L 사이로 양해야 하며 분리 깔때기에서 액체 액체 추출을 받게 된다(프로토콜 단계 2). 지질의 소수성 성질은 클로로폼과 같은 비극성 용매에서 추출하여 다른 화합물과 분리될 수 있음을 의미한다. 2층 시스템은 지질이 유기 층으로 분할되는 반면 수용성 성분은 수성 층에 유지되도록 생성됩니다.
필터상 미립자 시료, 또는 생물학적 시편은 수정된 Folch 외. 추출3,또한 클로로폼(Protocol step 3)을 수반한다. 다시 말하지만, 유기/수성 시스템은 지질이 유기 상으로 분할되는 반면, 수용성 분자는 수성 상에 남아 있고 단백질이 침전됩니다. 사실, 고형물의 경우, 대부분의 실험실은 엽록소와 메탄올을 포함하는 Folch 외. 추출3 절차의 일부 변형을 사용합니다. 필터의 경우, 첫 번째 단계는 클로로폼 2mL 및 메탄올 1mL로 균질화하는 것입니다.
추출 하는 동안, 주의 화학 또는 효소 수정에서 지질을 보호 하기 위해, 에스 테르 결합 가수 분해 또는 탄소 탄소 이중 결합 산화를 줄이기 위해 얼음에 샘플 및 용매를 유지 하 여. 조직과 세포 지질은 천연 항산화제와 구획화4에의해 아주 잘 보호됩니다. 그러나, 시료의 균질화에 따라, 세포 내용물들은 지질을 더 변경, 화학적 또는 효소적으로 배치하는 렌더링을 결합한다. 대부분의 스테롤과 같은 일부 지질은 매우 안정적이며, 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질과 같은 지질은 화학 적 산화에 더 취약합니다. 이중 결합을 결합한 스테롤과 같은 다른 사람들은 빛5에의해 산화되는 경향이 있다. 추출 후 지질은 화학 적 산화에 훨씬 더 취약하며 샘플은 질소와 같은 불활성 가스 아래에 보관해야합니다. 질소의 부드러운 스트림은 또한 추출 물을 집중 하는 데 사용 됩니다.
농도 후, 지질은 일반적으로 대량으로 정량화 될 것 이다 그들은 높은 농도 의 에너지를 제공 하는 해양 생태계의 중요 한 구성 요소, 탄수화물과 단백질의 두 배 kJ/g 이상. 변함없이 그들은 다음 개별 구성 요소로 정량화 될 것 이다: 지질의 포괄적인 분석 일반적으로 간단한 범주로 분리 포함, 그들의 화학 적 특성에 따라. 따라서 전체 분석은 총 지질, 지질 클래스 및 개별 화합물을 측정하는 것을 포함합니다.
총 지질은 크로마토그래피6에의해 분리된 개별적으로 측정된 지질 클래스의 합을 취함으로써 결정될 수 있다. 해양 지질 추출물은 생생및 인위적 인 공급원으로부터 12 개 이상의 클래스를 포함 할 수 있습니다. 지질 구조의 다양한 구조의 개별 그룹을 결정하 여 많은 정보를 얻을 수 있습니다 의미. 지질 클래스는 개별적으로, 또는 특정 그룹에서, 유기체의 특정 유형의 존재를 신호하는 데 사용되었습니다, 뿐만 아니라 자신의 생리 상태 및 활동2. 그들은 또한 유기 물질의 기원의 지표로 사용 되었습니다., 용존 유기 물질을 포함 하 여 (DOM) 뿐만 아니라 소수성 오염 물질.
트리아실글리세롤, 인지질 및 스테롤은 더 중요한 생체 생성 지질 클래스 중 하나입니다. 처음 두 가지는 2개 또는 3개의 지방산이 에스테르화되는 글리세롤 백본을 소유하기 때문에 생화학적으로 관련되어있다(도 1). 트리아실글리세롤은 왁스 에스테르와 함께 매우 중요한 저장 물질이며, 다른 지방산 함유 지질 클래스는 투석기류, 자유 지방산 및 모노아실글리세롤과 같은 일반적으로 사소한 성분입니다. 불포화 지방산은독성이있을 수 있기 때문에 살아있는 유기체에서 낮은 농도로 존재한다. 스테롤 (그들의 자유롭고 에스테르 화 된 형태로 모두) 지방 알코올은 또한 덜 극성 지질 중 포함, 글리콜리피와 인지질은 극지 지질 동안. 극성 지질에는 세포막에서 발견되는 지질 이중층의 형성을 허용하는 친수성 그룹이 있습니다. 무료 스테롤은 또한 막 구조 성분이며 트리아실글리세롤에 대한 비율로 복용하면8에널리 사용된 상태 또는 영양 지수(TAG : ST)를 제공한다. 인지질(ST : PL)에 대한 비율로 복용하면 염에 대한 식물 민감도를 나타내는 데 사용할 수 있습니다: 높은 값은 구조적 무결성을 유지하고 멤브레인 투과성을 감소시킵니다9. 이 비율의 역 (PL : ST)은 온도 적응10동안 바이 밸브 조직에서 연구되었습니다.
해양 지질 클래스는 실리카 젤 코팅 막대(프로토콜 단계 4)의 얇은 층 크로마토그래피(TLC)로 분리한 다음 자동 FID 스캐너에서 화염 이온화 검출(FID)에 의해 검출및 정량화될 수 있다. TLC/FID는 작은 샘플에서 시놉틱 지질 클래스 데이터를 빠르게 제공하고 전체 지질에 대한 가치인 모든 클래스의 합을 취함으로써 해양 샘플에 일상적으로 사용되었습니다. TLC/FID는 품질 보증(QA) 평가를 받았으며 일관된 외부 교정, 낮은 블랭크 및 정밀 복제분석(11)에필요한 표준을 충족하는 것으로 나타났습니다. 변형계수(CV) 또는 상대적 표준 편차는 약 10%, FID 스캐너 총 지질 데이터는 일반적으로 중력 및 기타방법에의해 얻은 지질 데이터의 약 90%이다. 중력은 FID 스캐너가 비휘발성 화합물만을 측정하고, 또한 중력 측정에 비 지질 물질을 포함할 수 있기 때문에 더 높은 총 지질을 제공합니다.
지질 등급 분석에 의해 제공되는 정보는 개인, 또는 스테롤, 또는 조합에 있는 둘의 결정과 결합될 때 특히 유용합니다. 이러한 분석을 향한 첫 번째 단계는 지질 추출물의 스테롤과 함께 모든 성분 지방산의 방출을 포함한다 (프로토콜 단계 5). 지질 구조와 기능의 다양한 그들은 생태계 건강과 그들이 인류와 지상파 입력에 의해 영향을받은 정도를 평가하는 생태 및 생지구 화학 연구에서 광범위한 사용을 보았다 는 것을 의미한다. 그들은 해양 동물군뿐만 아니라 물 샘플의 품질을 나타내는 식이 값의 물질의 생합성을 측정하는 데 사용되었습니다. 퇴적물 코어 샘플에서 지질을 측정하면 육지-바다 마진 근처의 인간 토지 사용의 변화에 대한 퇴적물의 민감도를 보여주는 데 도움이 됩니다.
개별 지질 화합물을 식별하고 정량화하기 위한 주요 공구는 전통적으로 FID를 가진 가스 크로마토그래피 (GC)이었습니다. 그러나 분석하기 전에, 이러한 화합물은 파생에 의해 더 휘발성이 만들어집니다. 지방산은 아킬 지질클래스(도 1)로부터산성 촉매(H2SO4)의존재에서 방출된다. 유기 화학에서, 아실 군 (R-C=O)은 일반적으로 카복실산 (R-COOH)에서 파생됩니다. 그(것)들은 그 때 GC 열에 더 나은 분리를 주는 지방산 메틸 에스테르 (FAME)에 다시 에스테르 (프로토콜 단계 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 지질 분석을 위한 유리제품, 기기 및 필터를 청소하려면 메탄올로 3회 세척한 다음 엽록소로 3개의 세척을 하거나 최소 8시간 동안 450°C로 가열하십시오.
1. 해수 용해 및 미립지질에 대한 여과 절차
참고: 특정 관심 분수는 여과 절차에 의해 운영적으로 정의됩니다. 이 경우 기공 크기는 1.2 μm입니다.
- 필터없이 여과 매니폴드를 설정하고 여과 된 바닷물로 설정을 헹구습니다.
- 깨끗한 집게를 사용하여 47mm 유리 섬유 (GF / C) 필터를 세척하여 깨끗한 여과 시스템에 넣습니다.
- 샘플을 가져 와서 부드럽게 소용돌이하여 수집 용기의 바닥에 정착 했을 수 있는 모든 재료를 다시 중단합니다. 이 경우 알려진 볼륨을 정확하게 측정하고 필터를 통해 이를 필터링합니다.
참고: 부피는 시료의 미립자 물질의 양에 따라 달라집니다: 일반적으로 계절과 위치에 따라 보통 250mL에서 5L 사이. - 시료를 측정하면 필터를 여과된 바닷물로 부드럽게 적시십시오. 전체 샘플을 여과 시스템에 천천히 추가하고 모든 입자가 필터에 추가되도록 여과된 바닷물로 졸업한 실린더를 헹구킵니다. 모든 입자가 필터에 헹구지 않도록 측면에 여과된 해수로 설정을 헹구어 놓습니다.
- 모든 바닷물이 필터를 통과하도록 허용하지만 필터의 세포를 방해 할 수 있으므로 필터가 완전히 건조되는 것을 허용하지 않습니다. 물의 마지막이 사라짐에 따라 흡입을 끊습니다.
- 깨끗한 집게와 깨끗한 파이펫을 사용하여 필터를 반으로 접은 다음 3분의 1로 반으로 접어 필터를 튜브로 굴려 냅니다. 10mL 유리 유리 바이알로 표시된 깨끗하고 깨끗한 유리 바이알에 넣습니다.
- 필터를 클로로폼 2mL로 덮습니다. 머리 공간을 질소로 채우고 PTFE 테이프로 밀봉하십시오. -20°C 냉동고에 랙에 넣습니다. 샘플은 이 온도에서 최대 1년까지 안정될 것입니다.
참고: 지질 농도를 총 질량 농도에 관련시키기 위해서는 건조 중량 측정도 필요합니다. 여기에는 24mm 의 미리 계량된 필터를 건식 중량 여과 설정에 넣고 샘플을 교반하고 작은 필터에 여과되는 작은 하위 샘플을 채취하는 작업이 포함됩니다. 필터가 거의 건조하면 약 10mL의 3.5% 암모늄용암모늄이 필터에 추가됩니다. 필터는 반으로 접혀, 라벨이 붙은 페트리 접시에 반환하고 냉동실에 놓습니다.
2. 해수 또는 액체 샘플의 액체 액체 추출
-
샘플 준비
- 지질 청정 유리 졸업 실린더에 알려진 양의 여과를 측정합니다. 이 샘플을 깨끗한 1 L 분리 깔때기에 놓습니다. 그런 다음 20mL의 클로로폼을 샘플에 넣고 2분 동안 흔들어 자주 배출합니다.
-
첫 번째 분리 후 첫 번째 추출물 제거 및 산 첨가
- 깔때기를 알루미늄 호일로 감싸고 분리가 발생할 때까지 5~10분 기다립니다. 호일의 바닥을 다시 껍질을 벗기고 두 레이어를 볼 수 있습니다. 스톱콕을 통해 바닥의 유기층을 깨끗한 둥근 바닥 플라스크로 모아 상단 층을 포함하지 않도록 주의하십시오. 둥근 바닥 플라스크를 질소 아래에 캡을 씌운 다음 냉동실에 놓습니다.
- 시료의 각 리터에 대해 0.25 mL의 농축 H2SOSO 4를 추가하여 분리 깔때기의 샘플에 넣고 깔때기를 부드럽게 흔들어 줍니다.
- 10mL의 클로로폼을 넣고 자주 배출하는 동안 2 분 동안 힘차게 흔들어줍니다. 분리가 수행되도록 허용합니다.
-
두 번째 및 세 번째 분리
- 분리를 기다린 후 하단 레이어를 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다.
- 클로로폼의 세 번째 10mL를 추가하고 2 분 동안 흔들어 다시 자주 배출합니다. 분리 후 아래쪽 레이어를 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다.
- 둥근 바닥 플라스크에서 추출물을 회전 증발기로 옮기고, 증발하여 2mL 바이알로 이송한다.
3. 고체에 대한 추출 프로토콜 (수정 된 Folch외. 3 추출)
-
설치
참고: 추출 설정에는 얼음이 채워진 절연 용기가 필요합니다. 용매에는 메탄올, 클로로폼 추출물 및 2:1 클로로폼:메탄올이 포함됩니다. 모든 용매는 추출이 시작될 때까지 추워지도록 얼음 위에 두어야 합니다. 샘플은 또한 얼음에 가서 모든 것이 차가운 상태로 유지되도록합니다.- 모든 튜브와 PTFE 라이닝 캡을 메탄올로 3번 헹구고 클로로폼으로 3회 헹구십시오. 각 추출에는 원심분리기 튜브 1개와 캡이 있는 15mL 바이알 1회가 필요합니다.
- 샘플을 클로로폼 2mL가 함유한 원심분리기 튜브에 놓습니다. 시료의 크기는 지질의 양에 따라 달라 지며, 약 5~10 mg의 지질이 바람직하다.
-
연삭 및 추출
- 약 1mL의 얼음 차가운 메탄올을 넣고 깨끗한 균질화또는 PTFE/금속 형 막대로 샘플을 펄프로 빠르게 갈아 넣습니다.
- 약 1mL의 얼음 차가운 클로로폼인 메탄올을 넣고 1/2mL의 얼음 차가운 클로로폼 추출물로 막대를 튜브안으로 다시 씻으십시오. 필요한 경우 깨끗한 집게 세트를 사용하여 세척 하기 전에 다시 유리병에 입자를 강제로. 튜브를 캡하고 초음파 욕조 (35 - 42 kHz)에서 4 분 동안 혼합물을 초음파 처리합니다.
-
이중 파이펫팅: 원심 분리는 1800 × g에서2 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 전구가 있는 5 3/4" 파이펫이 두 층을 부드럽게 밀어내고 전구를 압박하면서 거품이 나오는 이중 파이펫팅 기술을 사용하여 전체 유기 층(하부 레이어)을 수집합니다.
- 두 번째 레이어의 맨 아래에 도달하면 엄지 손가락을 사용하여 파이펫에 유기 층을 그리지 않고 전구를 제거합니다. 5 3/4" 파이펫 내부에 9" 파이펫을 놓고 5 3/4" 파이펫을 통해 아래쪽 레이어를 제거합니다.
- 추출물을 깨끗한 유리병에 놓습니다. 모든 레이어가 제거될 때까지 아래쪽 레이어를 계속 제거합니다.
-
세척 파이펫: 얼음 차가운 클로로폼 1.5mL을 사용하여 유기 층을 포함하는 유리층으로 9"파이펫을 헹구어 파이펫의 바깥쪽을 씻어 내고 1.5 mL을 씻어 내부를 씻어냅니다. 세탁하는 동안 파이펫을 부드럽게 돌리고 모든 클로로폼이 파이펫을 바이알로 실행되도록 하십시오.
- 같은 방법으로 수성 층을 포함하는 튜브에 5 3/4 "파이펫을 헹굴.
- 매번 새 파이펫을 사용하여 샘플을 초음파 처리하고 원심분리하고 분리할 때 이중 파이펫을 분리합니다. 적어도 세 번 반복하고 모든 유기 층을 풀. 유기 층을 세 번째로 제거 한 후, 유기 층을 포함하는 유리병에 두 파이펫을 세척.
- 부드러운 질소 스트림을 사용하여 부피에 농축한 다음 PTFE 테이프로 밀봉하고 냉동실에 보관하십시오.
4. 해양 지질 클래스의 로드 TLC 분리를위한 시스템 및 단계 개발
-
TLC용 막대 준비
- 자동 FID 스캐너에서 로드를 세 번 스캔합니다.
- 샘플 발견: 원점에서 또는 바로 아래 막대에 주사기와 샘플 및 표준을 적용합니다. 0.5 μL을 분배하고 막대에 드롭을 터치합니다. 같은 자리에 다음 방울을 놓기 전에 건조시키십시오. 막대의 선에 모든 샘플을 발견합니다.
- 아세톤에 초점: 아세톤의 70mL에서 초점 샘플두 번 (샘플이 매우 집중되는 경우 세 번). 현물 바닥이 상단과 합쳐질 때까지 막대를 올라갈 때 용매 전면을 지켜보십시오. 막대를 제거하고 약 5 s로 말린 다음 절차를 반복하여 막대 바닥 근처의 좁은 지질 재료 밴드를 생성합니다.
- 5 분 동안 일정한 습도 챔버에서 막대를 건조하고 조절하십시오. 일정한 습도 챔버는 접시 아래에 염화 칼슘의 포화 용액을 가진 건조기입니다.
-
첫 번째 크로마토그램(케톤까지 탄화수소)으로 이어지는 서열
-
첫 번째 개발 시스템: 첫 번째 개발 시스템은 헥산입니다 : diethyl 에테르 : 포믹 산, 98.95:1:05. 주사기를 사용하여 포믹산을 추가하지만 먼저 주사기 3× 포믹산으로 헹군다. 바로 그 후 클로로폼으로 주사기에서 포름산을 헹구십시오. 혼합물의 30mL를 사용하여 종이를 적시고 탱크를 헹노게하십시오. 헹기 용액을 버리고 나머지 70mL를 탱크에 추가합니다.
- 랙을 가져 와서 부드럽게 탱크로 낮춥춥습니다. 용매 전면이 샘플 반점에 도달할 때까지 지켜본 다음 타이머를 시작합니다. 25분 후, 개발 챔버에서 막대를 제거하고, 일정한 습도 챔버에서 5분 동안 건조하고, 20분 동안 동일한 용액으로 재개발한다.
- 자동 FID 스캐너에서 5분 동안 막대를 건조한 다음 25의 PPS 스캔을 사용하여 케톤 피크 뒤의 가장 낮은 지점으로 스캔합니다.
-
첫 번째 개발 시스템: 첫 번째 개발 시스템은 헥산입니다 : diethyl 에테르 : 포믹 산, 98.95:1:05. 주사기를 사용하여 포믹산을 추가하지만 먼저 주사기 3× 포믹산으로 헹군다. 바로 그 후 클로로폼으로 주사기에서 포름산을 헹구십시오. 혼합물의 30mL를 사용하여 종이를 적시고 탱크를 헹노게하십시오. 헹기 용액을 버리고 나머지 70mL를 탱크에 추가합니다.
-
두 번째 크로마토그램으로 이어지는 서열 (트리아실글리세롤에서 디아실리세롤) :
- 일정한 습도 챔버에서 5 분 동안 막대를 조건.
- 제2개발시스템: 제2개발시스템은 헥산:디틸 에테르:포믹산, 79:20:1이다. 개발 탱크에 ~30mL를 추가하여 종이를 적시고 탱크를 헹노게 합니다. 그런 다음 나머지 70mL에서 40 분 동안 막대를 버리고 개발합니다. 태그(포화)와 TAG(고도불포화) 봉우리 사이의 최상의 분리를 위해 79.9:20:0.1의 혼합물을 사용하지만 ST 및 DAG 피크의 분리는 79:20:1의 혼합물을 사용합니다.
- PPS 스캔(11)을 사용하여 두 번째 부분 스캔에서 디아실리세롤 피크 뒤의 가장 낮은 지점까지 건조하고 스캔합니다.
-
세 번째 크로마토그램으로 이어지는 서열(아세톤-이동식 극지 지질 및 인지질)
- 일정한 습도 챔버에서 5 분 동안 막대를 조건.
- 아세톤의 70mL에서 15분 동안 두 번 막대를 개발합니다. 개발 사이에 공기는 약 30 초 동안 막대를 건조.
- 일정한 습도 챔버에서 5 분 동안 막대를 조건.
- 제3개발시스템: 제3개발시스템은 클로로폼, 메탄올, 클로로폼 추출물의 혼합물로, 50:40:10이다. 혼합물의 70mL에서 10분 동안 두 번 막대를 개발한다. 개발 사이에, 공기는 약 30 초 동안 막대를 건조.
- 전체 길이의 막대를 건조하고 스캔합니다.
5. MeOH에서 H2SO4로 명예 파생
-
힐디치 시약 만들기
- 메탄올 준비: 깨끗한 볼륨 플라스크에 MeOH의 100 mL을 배치 한 다음 플라스크의 바닥이 덮일 때까지 무수성 NaSO4에 부드럽게 뿌립니다. 일단 덮여, 메탄올의 모든 물이 NaSO4에의해 흡수되도록 두 번 반전. 반전과 흔들림 후, 적어도 5 분 동안 앉아 보자.
- 산 추가: 천천히 메탄올을 유리 항아리에 데산 (현재 NaSO4은 플라스크의 바닥에 단단한 덩어리입니다) H2SO4가 추가됩니다. 파이펫을 사용하여 메탄올에 1.5mL 황산을 천천히 넣습니다. 한 번에 몇 방울을 추가하고 모든 산이 추가되면 뚜껑을 뚜껑을 부드럽게 저어 섞습니다. 이제 솔루션은 파생 상품에 사용할 준비가 되었지만 매주 구성되어야 합니다.
-
파생상품 만들기
- 약 200 μg의 지질을 추출 된 양으로 가져온 추출물 유리병에서 깨끗한 15 mL 유리병으로 옮기고 질소 하에서 건조하게 증발합니다. 제거된 양은 TLC/FID로부터 의 시료의 농도에 의해 결정됩니다. 깨끗한 파이펫을 사용하여 샘플을 제거합니다.
- 시료가 건조되면 새로 만든 힐디치 시약의 디클로로메탄 1.5mL및 3mL를 추가하십시오.
- 샘플을 소용돌이시키고 유리 유리병에 부착 한 지질을 제거하기 위해 4 분 동안 초음파 욕조에서 초음파 처리합니다. 유리병을 질소, 캡으로 채우고 PTFE 테이프로 밀봉하고 1시간 동안 100°C에서 가열합니다.
-
반응 중지
- 오븐에서 제거 한 후 10 분 동안 샘플을 실온으로 완전히 식힌 다음 바이알을 조심스럽게 엽니다.
- 약 0.5mL 포화 나트륨 중탄산염 용액(9g/100mL 클로로폼 추출물), 1.5mL 헥산을 천천히 추가합니다. 유리병을 흔들거나 소용돌이쳐 두 층으로 분리되도록 방치하십시오.
-
명예의 수집
- 상부층 제거: 발출이 중단되고 명확한 분리가 있으면, 상부, 유기상을 제거하고 지질 청정 2mL 바이알에 배치한다.
- 2mL 바이알에서 용매를 증발하여 약 0.5mL로 육사네로 재충전합니다.
- 유리병의 머리 공간을 질소로 채우고, 뚜껑을 씌우고, PTFE 테이프로 유리병을 밀봉하고, 지방산을 다시 중단하기 위해 또 다른 4분 동안 초음파 처리한 다음 GC로 갈 준비가 되어 있습니다.
참고: 지방산 농도가 필요한 경우, 수성 층은 헥산으로 세 번 세척해야 하며 모든 유기층은 2mL 바이알로 풀링되어야 합니다. 여기에는 헥산 2mL를 추가하고, 시료를 소용돌이게 하고, 원심분리하고, 유기층을 제거하는 것이 포함되며, 모두 3회 반복된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
가장 빠르게 성장하는 식품 생산 부문으로서 양식업은 변화하는 요구 사항을 충족하기 위해 기술 혁신과 적응 측면에서 진화하고 있습니다. 그 중 하나는 많은 양식 종에 대 한 사료 재료를 제공 하는 야생 공급 생선 밀및 생선 기름에 대 한 의존을 줄이기 위해. 육상식물유는 아쿠아피드에서 생선기름에 대한 지속가능하고 경제적인 대체품으로 조사되고 있으며, 간은지질대사의주요 부위이기 때문에 분석을 위한 표적 조직이다. 그림 2는 우리의 9 성분 표준에서 얻은 원시 TLC-FID 크로마토그램을 보여줍니다, 우리가 생선 기름으로 공식화 다이어트 7% 5%에서 유채 기름, 대서양 연어에서 간 조직 그 다이어트를 공급. 표 1은 다른 물고기의 식이 복제 및 샘플을 분석한 후 얻은 데이터를 보여줍니다. 이러한 데이터는 피크 심플 소프트웨어(버전 4.54)를 사용하여 추출물의 지질 클래스를 정량화하기 위해 스캐너 FID 응답에서 표준 곡선을 생성한 후 얻어졌다. 데이터는 규정식과 간에서 트리아실글리세롤의 보급 및 또한 간에서 막 인지질의 중요성을 보여줍니다.
대륙 마진은 일반적으로 매우 높은 생물학적 생산성을 특징으로하며 탄소 순환에서 특히 중요합니다. 표면 기본 생산성은 얕은 물에 더 해저에 도달하므로 상부 혼합 층에서 벤틱 푸드 웹으로 정착하는 입자의 양과 품질을 측정하는 것이 큰 관심사입니다. 탄소가 풍부하고 에너지 함량이 매우 높기 때문에 지질은 대륙 선반의 생산성의 중요한 구성 요소입니다. 역사적으로 뉴펀들랜드와 래브라도에 인접한 해역은 약 5세기 동안 세계에서 가장 위대한 어업 중 하나를 지원했으며, 우리는 이 시스템13에서지질의 생산과 이전을 연구해 왔습니다. 그림 3는 우리의 표준에서 얻은 TLC-FID 크로마토그램, 뉴 펀들 랜드의 해안에서 220m에서 수집 된 미립자 물질 정착지질, 작은 미시드의 지질, 동일한 깊이 근처에서 수집 된 에리스로프 에리스로프탈마를 보여줍니다. 이번에는 크로마토그램이 플롯 소프트웨어를 통해 처리되었으며 두 부분 검사가 최종 완전한 검사와 결합되었습니다. 표 2는 미립자 물질 및 mysid의 복제 샘플을 분석한 후 얻은 데이터를 보여줍니다. 5필라에서 19대 택시 중, 작은 미시드는 평균적으로 가장 높은 지질 농도(젖은 무게의6%)를 가졌다.
그림 1: 극성 증가의 대략적인 순서로 해양 샘플의 주요 지질 클래스. 각 구조는 도면의 오른쪽을 가리키는 분자의 가장 소수성 부분으로 그려집니다. 지질 클래스의 대표적인 화합물은 다음과 같습니다: 탄화수소: 비다데칸; 왁스 에스테르: 헥사데실 팔미타테; 스테릴 에스테르: 콜스테릴 팔미타테; 메틸 에스테르: 메틸 팔미타테; 케톤: 3-헥스데카네네; 트리아실글리세롤: 트리팔미틴; 자유 지방산: 팔미산; 알코올: 파이톨; 스테롤: 콜레스테롤; 디아실리세롤: 디팔미토틸 글리세롤; 모노아실글리세롤: 모노팔미토닐 글리세롤; 글리콜리피드: 디갈락토실 디아실리세롤; 인지질: 디팔미토일 인스티딜콜린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 양식 배양 수유 실험에서 지질 조성물의 TLC-FID 크로마토그램. 추출물은 실리카 젤 코팅 TLC 막대에서 발견되었으며 3 단계 개발 시스템은 지질 클래스를 분리하는 데 사용되었습니다. 제1 및 제2 개발 시스템은 헥산:diethyl 에테르:포믹산(98.95:1:0.05) 및 (79.9:20:0.1) 및 (79.9:20:0.1) 및 (79.9:20:0.1) 각각 트리아실글리세롤, 프리 지방산 및 스테롤을 포함한 중성 지질을 분리하여 자동 FID 스캐너에서 스캔하는 데 사용하였다. 제3개발시스템은 아세톤-이동극지질과 인지질을 분리하기 위해 클로로폼:메탄올:물(5:4:1)에 100% 아세톤으로 구성되었다. 표준 곡선 (즉, 논나데칸, 콜스테릴 팔미티테, 3 헥스데카논, 트리팔미틴, 팔미티산, 세틸 알코올, 콜레스테롤, 모노팔미토일 글리세롤, 디팔미토일 포스파디딜콜린)을 사용하여 피크(Peak.44)를 사용하여 추출물의 지질 클래스를 정량화하는 데 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TLC-FID 크로마토그램 은 해안 뉴펀들랜드에서 거의 바닥 샘플의 지질 조성의 크로마토그램. a) 9 성분 표준, b) 220m 개념베이, 뉴펀들랜드, c) 지질 클래스에서 미시드, 에리스로프 에리스로프탈마.
| 생선 기름/유채 기름 다이어트 | 대서양 연어 간 | |
| 탄화수소 | 1.3±0.9 | 0.5±0.2 |
| 스테릴 에스테르/왁스 에스테르 | 0.4±0.6 | 0.6±0.3 |
| 에틸 에스테르 | 0 | 0 |
| 메틸 에스테르 | 0 | 0 |
| 에틸 케톤 | 0 | 0.3±0.2 |
| 메틸 케톤 | 0 | 0 |
| 글리세릴 에테르 | 0 | 0 |
| 트리아실글리세롤 | 145.0±26.3 | 16.9±8.1 |
| 무료 지방산 | 21.9±2.2 | 1.2±0.9 |
| 알콜 | 0 | 1.4±0.4 |
| 스테롤스 | 6.8±2.1 | 2.6±0.2 |
| 디아사이클리세롤 | 0 | 0 |
| 아세톤 모바일 폴라 지질 | 14.0±2.5 | 2.2±0.6 |
| 인지질 | 12.5±4.0 | 22.0±2.0 |
| 총 지질 | 201.8±27.4 | 47.7±11.8 |
표 1: 양식 공급 실험에서 지질 조성. 데이터는 12주 동안 이 식단을 공급한 후 6.80%의 생선 기름과 4.80%의 유채기름을 함유한 실험식단(평균±스탠다드 편차)이며, 12주 동안 이 식단을 공급한 후 대서양 연어(mgg-1 젖은 무게)를 공급한다.
| 미립자 물질 정착 | 에리스로프에프탈마 | |
| 스테릴 에스테르/왁스 에스테르 (총 지질%) | 10.2±8.28 | 8.85±1.67 |
| 트리아실글리세롤 (총 지질%) | 19.7±5.35 | 58.5±9.19 |
| 인지질 (총 지질%) | 16.2 ± 3.51 | 21.4±5.35 |
| 중성 지질 (총 지질%) | 12.5±4.0 | 73.4±5.46 |
| Lipolysis 지수 (%) | 18.1±5.20 | 2.77±2.78 |
| 총 지질 | 0.57±0.25 | 5.86±1.44 |
| 중성 지질: 탄화수소, 왁스 및 스테릴 에스테르, 케톤, 트리아실글리세롤, 무료 지방산; (FFA), 알코올 (ALC), 스테롤, 투석기 세롤; LI: 리폴리시스 지수 [(FFA + ALC) (아실 지질 + ALC)-1]; 총 지질 (TLC / FID 결정 지질 클래스의 합) 미립자 물질 - % 건조 중량, Mysid - % 젖은 무게 | ||
표 2: 뉴펀들랜드 연안의 거의 바닥 샘플의 지질 조성. 데이터는 개념 베이 뉴 펀들 랜드에서 220 m 정착 미립자 물질의 (평균±표준 편차) 및 미시드, 에리스롭 에리스로프탈마의.
각주: 중성 지질: 탄화수소, 왁스 및 스테릴 에스테르, 케톤, 트리아실글리세롤, 무료 지방산; (FFA), 알코올 (ALC), 스테롤, 투석기 세롤; LI: 리폴리시스 지수 [(FFA+ ALC) (아실 지질 + ALC)-1]; 총 지질 (FID 결정 지질 클래스의 합) 미립자 물질 - % 건조 중량, Mysid - % 젖은 무게.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TLC-FID 시스템이 작은 샘플에서 시놉틱 지질 클래스 정보를 제공하는 속도는 TLC-FID를 해양 샘플을 선별할 수 있는 도구로 만들어 더 많은 관련 분석 절차를 착수합니다. 이러한 분석은 일반적으로 지질 추출물에서 성분 화합물의 방출을 필요로하고 가스 크로마토그래피의 경우 변동성을 증가. TLC-FID와 GC-FID가 결합된 것은 해산물 추출물 및 기타 식품14의추출물을 위한 강력한 조합으로 밝혀졌습니다. 성공적인 해양 지질 분석을 위해 샘플은 전체적으로 분해 및 오염으로부터 보호되며 샘플을 로드에 적용하여 세심한 주의를 기울여야 합니다. 한 가지 접근법은 마이크로카세필라피펫터(15)를이용하여 전체 해양 샘플을 로드에 적용하는 것이며, 해양 샘플 유형의 혁신은 해수샘플(16)에해면 미세층 및 에어로졸 샘플을 추가하는 것입니다.
자동 스캐너의 FID 시스템은 파생 또는 정리 없이 빠른 마이크로그램 수량을 제공합니다. 그러나 가스 크로마토그래프에서 볼 수 있듯이 민감하거나 정확하거나 선형적이지는 않습니다. 즉, 교정 곡선을 구성해야 하며, 교정 범위 내에서 더 작고 더 큰 지질 클래스 피크를 모두 유지하기 위해 두 개의 서로 다른 하중에서 샘플을 분석해야 할 수도 있습니다.
FID 스캐너의 부분 스캔 기능을 사용하여 여러 종류의 지질을 단일 샘플 응용 프로그램에서 막대로 분리할 수 있습니다. 그러나, 실리산에 대한 크로마토그래피는 왁스 에스테르(WE)와 스테릴 에스테르(SE)를 해결하지 못하며, 몇몇 클래스는 "아세톤-이동극 극지 지질"(AMPL) 피크17에포함될 수 있다. WE-SE는 뼈물고기 난모세포의 주요 지질 클래스였으며 부력 및/또는 에너지 저장18을지원하는 데 사용되는 것으로 제안됩니다.
광합성 유기체의 AMPL에서 글리코글리세로이피드는 아세톤의 모노아실글리세롤 및 안료와 함께 종종 엘ute를 함유합니다. 이는 엽록소 a 및 글리콜리피드 단갈락토실 디아실리세롤(MGDG) 및 디갈락토실 디아실리세롤(DGDG)이 스캐너에서 상이한 FID 반응을 가지므로 수량에 대한 우려를 야기할 수 있다. 그러나, 우리는 AMPL 클래스의 표준으로 1-모노팔미토틸 글리세롤을 사용하고 있으며, 이는 그 중응답 중간체가 17.
일부 FID 스캐너 피크에는 두 개 이상의 지질 클래스가 포함될 수 있지만, 분리된 지질 클래스를 기능적으로 재그룹화하는 것이 유용한 경우도 있습니다. 예를 들어, AMPL 및 PL은 극지 지질으로 그룹화된 다음 스테롤19를추가하여 구조 지질으로 분류되었다. 이러한 그룹화는 무척추 동물19에서발달 하는 동안 지질 사용에 대 한 중요 한 기간을 공부 하는 데 사용 되었다. 자유 지방산 및 알코올을 포함하는 다른 그룹화는 lipolysis 지수(표 2)또는 가수 분해 지수1과같은 분해 지표로 사용될 수 있다. LI는 모든 아실 지질의 리폴리시스 지수이며 HI는 비극성 아실 지질의 가수분해 지수입니다. LI 값은 모든 아실 지질이 포함되어 있기 때문에 모든 샘플에 대해 HI값보다 항상 낮습니다.
때때로 피크 분할은 식별을 어렵게 만들 수 있는 고도 불포화 종의 상부의 존재 때문에 해양 견본의 추출물의 막대 분리에서 생깁니다. 이는 왁스 에스테르(그림3),트리아실글리세롤 및 자유 지방산20,21로관찰되었으며, 다른 크로마토그래피 기법과 의한 본격 표준 및/또는 확인을 통해 공동 스포팅이 필요하다. 유사하게, 극지지질영역(도 2 및 도 3)에서피크 분할이 발생할 수 있으며, 추가 개발은 성분 글리콜리피드 및 안료(17,22 및 인지질 클래스22,23)를분리하기 위해 착수될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)가 C.C. Parrish에 105379 수의 보조금을 지원받았습니다. 메모리얼 대학의 핵심 연구 장비 및 악기 교육 (CREAIT) 네트워크는이 출판물에 자금을 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C.
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C.
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
