Summary
该协议的制定是为了加强对农用化学品如何影响蜜蜂（Apis mellifera）繁殖的理解，方法是建立方法，在受控的实验室环境中将蜜蜂及其工人看护人暴露于农用化学品中，并仔细监测它们的相关反应。
Abstract
目前对蜜蜂的风险评估策略在很大程度上依赖于对成年或未成熟的工蜂进行的实验室测试，但这些方法可能无法准确捕获农用化学品暴露对蜂王的影响。作为蜜蜂群落内受精卵的唯一生产者，蜂王可以说是一个正常运作的蜂群中最重要的单一成员。因此，了解农用化学品如何影响蜂王健康和生产力应被视为农药风险评估的一个关键方面。在这里，提出了一种适应性的方法，使蜜蜂蜂王和工蜂王服务员暴露于通过工人饮食施用的农用化学品应激源，然后在实验室中跟踪产卵量，并使用专门的笼子（称为蜂王监测笼）评估第一龄的关闭情况。为了说明该方法的预期用途，描述了一项实验的结果，其中工人女王服务员被喂食含有亚致死剂量的吡虫啉的饮食，并监测了对女王的影响。
Introduction
由于全球对农产品的需求增加，现代农业实践通常需要使用农用化学品来控制已知会降低或损害作物产量的众多害虫1。同时，许多水果，蔬菜和坚果作物的种植者依靠商业蜜蜂群落提供的授粉服务来确保丰收2。这些做法可能导致传粉媒介，包括蜜蜂（Apis mellifera），暴露于有害水平的农药残留3。同时，蜜蜂群落中广泛存在的寄生Varroa破坏螨虫侵扰经常需要养蜂人用杀螨剂处理其蜂巢，这也可能对蜂群的健康和寿命产生负面影响4，5，6。为了减少和减轻农用化学品的有害影响，有必要在实施之前全面评估其对蜜蜂的安全性，以便提出使用建议以保护有益昆虫。
目前，环境保护署（EPA）依靠对蜜蜂农药暴露的分层风险评估策略，其中包括对成年蜜蜂和有时对蜜蜂幼虫7进行实验室测试。如果较低级别的实验室检查无法减轻对毒性的担忧，则可能建议进行高级别的现场和半现场测试。虽然这些实验室测试为农用化学品对工人寿命的潜在影响提供了有价值的见解，但它们并不一定预测它们对女王的影响，这与工人生物学8和行为9显着不同。此外，农用化学品对昆虫有许多潜在的影响，除了死亡之外，这可能对依靠协调行为作为殖民地单位10，11的社会昆虫产生相当大的影响。
虽然死亡率是农用化学品最普遍考虑的影响12，但这些产品可以对目标和非目标节肢动物产生广泛的影响，包括改变行为13，14，15，16，排斥性或吸引性17，18，19，进食模式的变化20，21，22和增加或减少的生育能力20，21，22，23，24，25。对于群居昆虫来说，这些影响会系统性地破坏群体的相互作用和功能11。在这些功能中，严重依赖由殖民地单元9的其余部分支持的单个产卵女王的繁殖可能特别容易受到农药暴露的干扰。
对未成熟的蚁后进行的研究表明，发育暴露于杀螨剂会影响成年蚁后的行为，生理学，存活率26，27。类似地，使用全尺寸或缩小尺寸的菌落的研究表明，农用化学品可以通过减少交配成功率28，减少产卵29和降低产生的卵的生存能力来影响成年蜂王25，30，31。以前，如果不使用整个菌落，这些现象很难观察到，这主要是由于缺乏可用的实验室方法。然而，最近已经采用了一种使用女王监测笼（QMC）32在严格控制的实验室条件下研究女王产卵的方法，以检查农用化学品对女王生育能力的影响33。在这里，详细介绍了这些技术以及测量和跟踪QMC中工人饮食消耗的其他方法。
这些方法比需要全尺寸菌落的实验更有利，因为它们允许向大大减少的工人数量施用精确剂量的农用化学品，相对于通常存在于蚁群内的数万人，然后蚁后提供蚁后。这种曝光技术反映了女王在现实世界中会经历的二手曝光，因为在蚁群中，蚁后不会自己进食，而是依靠工人为它们提供饮食9。同样，蚁后通常不会离开蜂巢，除非在蜂群繁殖（蜂群）期间交配飞行35。交配的蜂王可以从商业蜂王种购买并在一夜之间发货。通常，女王育种者在确认它们已经开始产卵后直接出售女王，这被视为成功交配的标志。如果需要有关女王年龄或亲缘关系的更精确信息，研究人员可以在下订单之前咨询女王育种者。
QMC可以精确观察和量化蜂王的产卵和卵孵化率32，33，产生与农用化学品暴露对蜂王繁殖力的影响相关的宝贵数据。这里提出的代表性结果描述了在长期暴露于全身性神经毒性剂新烟碱类杀虫剂吡虫啉36的现场相关浓度下量化QMC的产卵，饮食消耗和胚胎活力的实验。一旦施用，吡虫啉会转移到植物组织37，并且已经检测到许多蜜蜂授粉植物的花粉和花蜜38，39，40的残留物。暴露于吡虫啉会对蜜蜂产生广泛的不利影响，包括觅食性能受损16，免疫功能受损41，以及群体扩张和存活率下降42，43。在这里，选择吡虫啉作为测试物质，因为田间实验表明它可以影响蜂王产卵29
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Protocol
1. QMC组装
- 从部件（图1A）组装QMC，插入一个产卵板（ELP），如图 1B所示。在将工人添加到笼子之前，不要添加喂料管。用实验室级胶带暂时覆盖 4 个进纸器孔。
- 将蜂王排除器和喂食室门插入喂养室上方，以防止蜂王进入喂养室并接触经过处理的饮食。有关更多组装详细信息，请参见 Fine 等人32。
- 在成年休养前24小时从蜜蜂群落中收集含有封盖工人育雏的蜡梳架，并将其置于育雏箱内的孵化器（34.5°C）中。24小时后，将封闭的蜜蜂从框架上刷下来，放入一个开放的容器中，该容器衬有防虫涂料（例如Fluon），以防止蜜蜂爬出。
- 将至少50只按重量计的蜜蜂（5克≈50只蜜蜂44，45只）加入每个QMC的产卵室。为了确保在实验中代表多样化的工人遗传库，从至少三个菌落中获得大约相同数量的工蜂，并在将它们添加到QMC之前将它们混合。
注意：新近关闭的工蜂不到1天大，由于飞行肌肉发育不全和角质层未硬化，不能飞行或蜇伤。如果在此年龄添加它们，则无需在处理前麻醉它们。可以使用一个小的1/4杯体积量杯轻轻地从容器中舀出蜜蜂，然后将它们放入第二个容器（衬有防虫涂料，例如Fluon）中，该容器已在秤上涂上焦油。有盖亲鱼覆盖的框架面积应大致相等，以确保源菌落在QMC工人种群中具有平等的代表权。工蜂的均质化可以通过将新关闭的蜜蜂从所有菌落中取出的框架刷入同一容器中并让它们在将其添加到QMC之前混合5分钟来实现。 - 加入含有蔗糖溶液，水和花粉补充剂的饲养器（见 第2节）。
- 将单个交配的蜂王暴露于CO2 气体中，以刺激产卵46 并易于转移到QMC中。
- 使用在收到后48小时内从商业育种者处购买的女王。当女王仍在运输笼内时，将其放入透明塑料袋中。将连接到 CO2 气体罐的塑料管的一端放在袋内，轻轻打开罐阀，让 CO2 气体流动。
- 当袋子被气体充气时，同时关闭罐头阀并保持袋子关闭以将气体捕获在内部。保持袋子关闭30秒或直到女王停止移动。取下女王，一旦观察到她失去知觉，就打开装运笼子。
- 部分打开产卵室的门，轻轻地将失去知觉的蚁后放在里面并合上盖子，注意不要压碎蚁后或里面的工人。将第二个产卵板添加到每个QMC中，如图 1C所示。在两个电子学习产品的顶部放置一块实验室胶带，以防止它们与QMC框架分离，并防止工人离开笼子。
- 将笼子置于具有34±0.5°C和60%±10%相对湿度的稳定环境条件下的黑暗培养箱中，就像正常菌落内的条件一样。
图 1.答： 已拆卸的QMC。 乙： 部分组装的 QMC，插入 1 个 ELP。 C： 完全组装的QMC与2个ELP。 请点击此处查看此图的放大版本。
2. 准备和管理掺有农用化学品的饮食
- 要制备1000g50%（g / g）蔗糖溶液，请在干净的1L玻璃试剂瓶底部放置搅拌棒。加入500克蔗糖和500毫升去离子水。拧开瓶盖，使用加热的搅拌板设置为低火混合溶液，直到所有蔗糖溶解。在加入农用化学品储备溶液之前，让溶液冷却至室温。
- 在适当的溶剂（如丙酮）中制备农用化学品的储备溶液，其浓度可以添加到饮食中，以达到感兴趣的农用化学品的所需最终浓度。
注意：当使用丙酮作为载体溶剂时，经济合作与发展组织（OECD）指南规定，饮食中丙酮的最终浓度必须≤5%，以便对成年蜜蜂进行慢性口服毒性试验47。然而，一些溶剂，如n-甲基-2-吡咯烷酮5，31和二甲基亚砜25可以在该浓度以下发挥毒性作用，因此建议在处理饮食中保持溶剂浓度尽可能低。根据所用溶剂的体积和类型，可能需要同时包括溶剂对照组和阴性对照组，以确保检测到由于溶剂毒性引起的潜在影响。使用配方产品时，必须根据配方中存在的浓度调整所用产品的量。根据溶剂中感兴趣的农用化学品的稳定性，储备溶液可以在-20°C下保存长达2周。 - 根据经合组织第245号试验的结果选择亚致死剂量：蜜蜂（蜜蜂Apis mellifera L.），慢性口服毒性试验（10天喂养）47，并通过查询Ecotox知识库48来确定相关文献。
- 在蔗糖溶液，商业花粉补充剂（如果以粉末形式提供）或两者中施用农用化学品处理。通过将适量的储备溶液加入冷藏/室温50%蔗糖溶液（w / w）中，准备实验饮食以供当天使用。通过涡旋或将搅拌棒设置为中速彻底混合。对于花粉补充剂，根据制造商协议将农用化学品中的蔗糖溶液添加到粉末状补充剂中而不是糖浆中，确保根据花粉饮食的最终重量调整所用储备溶液的体积。有关示例计算，请参见表 1。
- 从2 mL微量离心管中准备喂料管。
- 对于流质饮食喂食器，在热板/炉灶上加热20号针的尖端，并将管底部刺穿两次。合上管盖，通过其中一个穿刺孔移取约1.5 mL蔗糖溶液或水。将管子向下，刺穿的一面朝上，直到将其添加到QMC中。
- 对于花粉补充剂喂食器，使用剃须刀片切掉管的底部。合上盖子，将1-2克花粉补充剂球推入管中，直到它接触到盖子。
- 在将喂料器放入 QMC 之前，请先记录喂料器重量。不要将未使用的饮食保持在4°C超过48小时。
| 所需浓度 | 所需溶剂载体浓度 | 所需的蔗糖溶液的最终体积/质量 | 库存解决方案之声 | 吡虫啉在储备溶液中 | 建议的库存解决方案配方 | |
| 蔗糖溶液 | 10 ppb （瓦/瓦） | 0.05% （v/v） | 81.45 毫升/100 克* | 40.7 μL | 0.001毫克/40.7微升 | 0.02 毫克/814 微升 |
| 花粉补充剂 | 10 ppb （瓦/瓦） | 10克** | 4.07 μL | 0.0001毫克/4.07微升 | 0.02 毫克/814 微升 | |
| 蔗糖溶液 | 50 ppb （瓦/瓦） | 0.05% （v/v） | 78.5 毫升/100 克* | 40.7 μL | 0.005 毫克/40.7 微升 | 0.1 毫克/814 微升 |
| 花粉补充剂 | 50 ppb （瓦/瓦） | 10克** | 4.07 μL | 0.0005毫克/4.07微升 | 0.1 毫克/814 微升 |
表1：处理过的蔗糖溶液，花粉补充剂和储备溶液的示例配方。 *体积基于50%（w / w）蔗糖溶液（1.228克/毫升）的密度。**花粉补充剂的密度将根据所使用的产品而有所不同，但如果使用这种溶剂体积，花粉补充剂中的最终溶剂浓度将在≤5%体积的期望范围内。
3. 监测 - 产蛋率
- 在早上和/或晚上量化每天产卵1至2次。首先从孵化器中取出QMC以检查卵子。
注意：在成功的实验中，大多数对照QMC的产蛋将在初始笼子组装后3天内开始生产。一次只能从培养箱中取出尽可能多的QMC，这些QMC可以在10分钟内检查和喂养。在孵化器外停留较长时间可能会破坏产蛋。 - 检查透明电子学习产品的背面是否有鸡蛋。如果存在鸡蛋，请取下感兴趣盘子前面的门板。从电子学习产品上取下胶带，小心地将电子学习产品与QMC内的蜜蜂之间的门板滑动，注意不要压碎任何可能清洁电子学习产品中细胞的蜜蜂。
- 将门板安装到位后，取出ELP，并计数并记录ELP细胞内的卵子数量。通过敲击ELP的边缘，打开细胞侧向下，在坚硬的表面（例如废物容器的唇部）上去除卵子。一旦卵落出，在QMC中更换空的ELP。轻轻地卸下并更换QMC外部ELP后面的门板。根据需要对第二个 ELP 重复上述步骤，完成后在 QMC 上更换磁带。
注意：QMC的产蛋量在2周后普遍下降，死亡率增加32，33，因此建议在14天后完成实验。
4. 监测 - 食物消费
- 每两天用新鲜烹制的饮食替换QMC喂食器中剩余的所有食物。准备新的喂料管（包括水）并称重，然后再从培养箱中取出QMC进行监测。将所有旧管换成新管，并在处理未消耗的饮食之前称量旧管。在将喂料管和未消耗的饮食放在QMC之前，将其的最终重量与同一喂食管的重量进行比较，以估计饮食消耗。
- 在计划更换喂食器的日期之间，每天检查一次饮食消耗量（同时监测QMC的产蛋量），以确保喂食器永远不会是空的。如果喂食管是空的或接近空的，请将其取出，重新填充，记录管前后的重量，并将差值添加到QMC的2天饮食消耗总量中。
5. 监测 - 胚胎活力
- 在QMC实验的选定时间点，按照 步骤3从QMC中取出含有新鲜产卵的电子学习产品，但不要将鸡蛋从电子学习产品中移出。
- 用通用微孔板盖住ELP，并将其放入具有饱和K 2 SO4溶液（150 g K2SO4在1L水中，保存在浅盘中的）的干燥器内。
注意：混合物在培养箱中达到温度后，在培养皿底部应可以看到一些盐。 - 将干燥器保持在设置为34.5°C的培养箱中，导致干燥器内的相对湿度为95%，类似于Collins49使用的条件。
注：几乎所有的蛋都会在产卵49后的72±6小时内孵化，因此最早可在电子学习产品从QMC移除后78小时内评估孵化率。细胞底部的"C"形幼虫表明孵化事件成功。例如，如果鸡蛋是无人机而不是工人，则此时间可能会有一些变化50。
6. 工人抽样
- 如果QMC中充满了多余的工人，请在实验期间在选定的时间点对工蜂进行采样，以评估治疗引起的生理变化。结合每日喂养和卵子计数活动进行收集，以最大限度地减少QMC在孵化器之外的时间。
- 在取样之前，在电子学习产品与QMC内部之间放置一块门板，然后取下电子学习用品。小心地将门板从笼子的底部抬起约0.5厘米，并使用羽量级镊子从QMC内部取出一只工蜂。为防止蜜蜂逃逸，必要时用戴手套的手指或棉片覆盖0.5厘米开口的部分区域。
- 保存收集的蜜蜂进行后续分析，并重复此过程，直到收集了所需数量的样本。对于基因表达分析，强烈建议将蜜蜂在液氮中快速冷冻并立即储存在-80°C下51。
7. 工人死亡率
- 在实验过程中，通过计算喂养室和产卵室底部的死蜜蜂数量来评估工人死亡率。结合每日产卵定量进行此评估。
- 使用镊子，小心地通过喂食器孔取出死蜂，在未插入镊子时用戴手套的手指或棉花覆盖孔。
- 通过小心地将门板从笼子底部抬起约0.5厘米并插入镊子，将死蜜蜂从产卵室中取出。为防止蜜蜂逃逸，必要时用戴手套的手指或棉片覆盖0.5厘米开口的部分区域。
- 在实验结束时，通过使用前面描述的方法从QMC中移除和计数所有死蜂，在对剩余的蜜蜂实施安乐死之前，评估工人的死亡率。
注意：在没有工蜂的情况下，蜂王不会产卵，会在24小时内挨饿。因此，如果观察到QMC中的所有工人都已死亡，则应将QMC从实验中删除。同样，如果女王在实验过程中死亡，QMC应该被删除，数据应该被适当地审查。
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Representative Results
在如上所述组装和维护的QMC中监测鸡蛋的产量，每天观察一次鸡蛋产量和每个处理组15个网箱。新交配的主要是卡尼奥兰种的蜂王从女王饲养员那里购买并连夜运输，并且蜜蜂工人是从伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校的蜜蜂研究设施中按照标准商业方法维护的3个蜂群中获得的。这里，使用4个饮食治疗组：1）蔗糖溶液和花粉补充剂中的50 ppb（g / g）吡虫啉（50 ppb - p + s），2）蔗糖溶液和花粉补充剂中的10 ppb吡虫啉（10 ppb - p + s），3）单独花粉补充剂中的10 ppb吡虫啉（10 ppb - p），以及4）给予含有等量丙酮作为治疗组的饮食的对照组（CTRL）。
评估了每日卵子计数中与治疗相关的变化，如Fine等人32所述，并进行了微小的修改。简而言之，实施了具有自回归（AR-1）相关基质结构的泊松对数线性GEE，以评估与处理相关的产蛋量随时间的变化。在这里，时间（天）被视为连续变量，处理是绝对的。使用Wald卡方事后测试来确定显著性。由于在实验的第1天没有观察到产卵，因此这一天被排除在分析之外，以符合GEE的假设。该分析的结果示于表S1中。50 ppb p+s处理组QMC的日产卵量显著降低（χ 2 =43.99， p<0.001;图 2A）。
使用单因子方差分析和Tukey HSD事后测试分析QMC中通过处理产生的卵子总数的差异（图3）。对于该分析，排除了由于女王或工人死亡而在14天监测期结束之前从实验中删除的任何QMC，导致CTRL和50 ppb - p + s组各N = 13，N = 14用于10 ppb - p，N = 15用于10 ppb - p + s。在蔗糖和花粉中施用的处理观察到剂量依赖性效应，相对于对照，鸡蛋产量的最大减少为50 ppb - p + s，其次是10 ppb - p + s。CTRL和10 ppb - p之间没有观察到总产卵的差异（F3，52= 17.95，p<0.001，Tukey HSD）。
每48小时记录一次花粉补充剂和水的消费，持续10天，每48小时记录一次蔗糖溶液的消费，持续12天。使用具有与上述相同参数的高斯分布式GEE评估饮食消耗率的变化（图2B-D）。结果总结在表S1中。简而言之，随着实验的进行，蔗糖的每日消费率显着增加（χ2= 6.03，p = 0.014），但花粉补充消费率下降（χ2= 174.98，p<0.001）。当吡虫啉单独在花粉补充剂中以10 ppb施用时，观察到花粉消耗率显着较高（χ 2 = 21.44，p<0.001），并且在花粉补充剂和蔗糖溶液中以10或50 ppb施用时显着降低（10 ppb - p + s：χ2= 6.59，p = 0.010; 50 ppb - p + s： χ2=14.47， p=0.0001）。
在实验的第7天从QMC收集卵，并使用广义线性混合模型（GMLR）评估母体暴露于农用化学品处理后成功孵化的种蛋数量的变化，该模型具有二项分布和QMC身份作为随机效应处理。母体单独或花粉和蔗糖溶液中以10 ppb暴露于吡虫啉不影响卵孵化率（10 ppb - p + s：Z=-0.139，p=0.290;10 ppb - p：Z=0.182，p=0.856）。由于该处理组的产蛋率低，无法评估提供50 ppb吡虫啉饮食的QMC中蚁后产的卵的孵化率。
对于这项工作，所有统计分析都在R Studio 1.2.5003（美国马萨诸塞州波士顿）中执行。数据是使用JMP Pro 15和Photoshop CC 2019（Adobe Inc.，圣何塞，CA）准备的。数据可在 补充文件S1中找到。
图 2.答：QMC 中平均每天±SE卵。 B： 平均±SE花粉补充剂 ，C： 蔗糖溶液 ，D： 和QMC中48小时内消耗的水（g）。由GEE和Wald chi-square事后测试确定的处理（由"*"表示）的重要性。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：实验期间通过处理产下的卵的平均±SE总和。由方差分析和Tukey HSD事后测试确定的显著性（用字母表示）。请点击此处查看此图的放大版本。
表S1：GEEs分析QMC产蛋率和日粮消费量随时间变化的结果。请点击此处下载此表格。
补充文件S1：请点击这里下载此补充文件。
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Discussion
雌性独居昆虫以及真社会昆虫群落中的蚁后的繁殖力可能受到非生物应激源的影响，例如农用化学品25，28，29，30，33。在蜜蜂中，农用化学品对蜂王的影响可能是间接的，因为它们可以通过工蜂的护理和喂养的变化而发生。我们的代表性结果与基于现场的研究29中报告的结果相似，表明农用化学品对蜂王性能的影响可以在实验室环境中使用QMC进行有效测量，从而产生与现场方法相当的结果。此外，这些结果揭示了吡虫啉对工人饮食消费和鸡蛋生存能力的影响。
吡虫啉在蔗糖溶液和花粉补充剂中同时施用时对产卵有明显的负面影响。这类似于使用观察蜂巢报告的结果，该荨麻疹提供吡虫啉花边糖浆并允许自由觅食29。然而，在这里，观察到剂量依赖性反应，在QMC中看到最显着的效果，相对于较低浓度提供50 ppb吡虫啉。与田间殖民地的报道不同，这群人经历了几乎停止产卵的情况。应该注意的是，本工作中使用的所有浓度（包括50 ppb）都高于吡虫啉作为种子处理时通常观察到的花粉和花蜜残留物，并且更能代表土壤施用后发现的残留物40。相关植物的例子包括在城市景观中发现的葫芦和观赏植物29，因此，这些结果应该在此背景下进行解释。此外，这些结果与使用田间菌落产生的结果之间的差异表明，与其他基于实验室的测定一样，QMC可能比使用全尺寸菌落52更敏感，在解释数据时应考虑这一点。
先前报道的在QMC中暴露于昆虫生长调节剂（IGR）的产卵工作没有发现IGR导致女王产卵率降低33，这表明卵生产的中断不是一致的应激反应。虽然使用全尺寸菌落的田间水平评估可以提供更全面地了解农用化学品对蜂群健康的影响，但这些发现表明，QMC有可能被用作识别可能影响蜂王产卵的吡虫啉等化学物质的工具。当用于考虑使用模式，暴露模式和对蜜蜂健康其他指标的影响的广泛风险评估策略的背景下时，QMC生成的产蛋数据可以更全面地了解农用化学品对蜜蜂群落的潜在影响。
除了生成定量产卵数据外，QMC还可用于评估工人饮食消费模式和生理变化。在这里，表明仅在花粉饮食中10 ppb吡虫啉就刺激了在交配女王在场的情况下工人的花粉补充剂消费。在其他饮食治疗中，当QMC在花粉补充剂和蔗糖溶液中提供吡虫啉时，即使在相同浓度下也没有观察到这种效果。应该指出的是，通过跟踪死亡率并根据QMC中剩余的蜜蜂的确切数量调整饮食消费量，可以获得更精确的消费率估计值，但如果各治疗的死亡率始终较低，则可以进行一些比较。含有相同浓度吡虫啉的花粉饮食消费的处理之间的差异可能与当蔗糖和花粉补充剂中都存在吡虫啉时给予蜜蜂的较高总剂量的差异有关，而当吡虫啉单独存在于花粉补充剂中时。
在低水平下，有证据表明蜜蜂更喜欢含有新烟碱类杀虫剂18的食物来源，并且据报道它们对含有尼古丁53的花资源表现出类似的偏好。有人提出，这些偏好可能是由于尼古丁和新烟碱类物质的神经刺激特性，其激活烟碱乙酰胆碱酯酶受体54 在蜜蜂大脑中表达的部分参与学习和记忆55。在蜘蛛螨中，吡虫啉刺激饮食消耗，导致产卵和繁殖力增加22。在这里，与吡虫啉相关的花粉补充剂消费量增加与产卵量增加无关，并且吡虫啉对这项工作中工人生理学的影响仍有待探索。然而，了解蜂群内含有农用化学品的食粮蜜蜂可能消耗多少，特别是那些在饮食中需要更多的花粉来积极提供产卵蜂王56的工人，可以帮助告知农用化学品的风险到群落表现的各个方面。
吡虫啉不会引起胚胎活力的任何可测量的变化，这是通过从QMC收集的卵的孵化率来测量的，这些QMC在花粉补充剂中单独或在花粉补充剂和蔗糖溶液中提供10 ppb吡虫啉。这与QMC33中IGR暴露后报告的蛋孵化率下降不同，再次证明QMC可用于检查蜂王繁殖力的特定和多样化方面。吡虫啉是高度水溶性的，可能与更多的脂溶性农用化学品（如IGRs57）不同，蜜蜂代谢和排泄可能在一定程度上被跨变异消除58，59，60，61，从而对胚胎发育产生影响。或者，吡虫啉（一种神经毒素36）可能不会以与IGR相同的方式影响发育中的胚胎，其靶向与昆虫发育相关的途径62。
研究人员试图了解农用化学品对蜜蜂繁殖的影响，他们经常问的一个问题是，依靠工人为她提供腺体分泌物作为食物9，63的成年蜂王是否直接暴露于农用化学品残留物中。这里报告的结果中没有对此进行探讨，也没有表示这一点。然而，相对于在受控菌落喂养场景中为工人提供的农用化学品残留物，工人腺体分泌物中的农用化学品残留物通常大大减少64。同样，当全尺寸菌落暴露于导致产卵减少的吡虫啉浓度时，在29号蚁后中没有检测到残留物，这表明在参考工作中观察到的产卵率的变化是由于直接暴露于容易排泄的微量，或者观察到的对蚁后的影响是由于吡虫啉对负责照顾和供应蚁后的工人的影响。这里介绍的方法允许对已知从成年食盐到取样时摄入处理过的饮食的工蜂进行采样。检查吡虫啉对从所述实验中抽样的工蜂生理学影响的后续工作将有助于阐明这个问题。
总之，这里介绍的方法将使研究人员能够通过评估与蜜蜂的繁殖力，存活和发育相关的终点来更好地评估农用化学品对蜜蜂的风险。所描述的技术有可能通过生成与蜂王繁殖力有关的定量数据来大大增强农用化学品风险评估，这些数据可能难以使用田间和半田间实验获得资源密集。此外，产卵蚁后的存在为对年轻工人进行的实验增加了真实感，这些工人通常是负责照顾和喂养蚁后的殖民地成员9。使用这种技术，可以更好地预测和减轻农用化学品对蜜蜂蜂群健康，寿命和性能的风险。
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Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
感谢Amy Cash-Ahmed博士，Nathanael J. Beach和Alison L. Sankey在开展这项工作时提供的帮助。本出版物中提及商品名称或商业产品仅用于提供特定信息，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部是一个机会均等的提供者和雇主。这项研究得到了国防高级研究计划局#HR0011-16-2-0019对Gene E. Robinson和Huimin Zhao，USDA项目2030-21000-001-00-D以及伊利诺伊大学厄巴纳香槟分校社区学院学生表型可塑性研究经验的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluon | BioQuip, Rancho Dominguez, CA | 2871A | |
| Honey bee queens | Olivarez Honey Bees, Orland, CA | ||
| Imidacloprid | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | 37894 | |
| MegaBee Powder | MegaBee, San Dieago, CA | ||
| Microcentrifuge tubes 2 mL | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | 02-682-004 | |
| Needles 20 gauge | W. W. Grainger, Lake Forest, IL | 5FVK4 | |
| Potassium Sulfate | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | P0772 | |
| Queen Monitoring Cages | University of Illinois Urbana-Champaign | Patent application number: 20190350175 | |
| Sucrose | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | S8501 | |
| Universal Microplate Lids | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | 5500 |
References
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