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Biology

Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62316
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3,4
1Invasive Species and Pollinator Health Research Unit, USDA-ARS, 2Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Department of Entomology, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Verständnis dafür zu verbessern, wie Agrochemikalien die Reproduktion von Honigbienen (Apis mellifera) beeinflussen, indem Methoden etabliert werden, um Honigbienenköniginnen und ihre Arbeiterpfleger in einer kontrollierten Laborumgebung Agrochemikalien auszusetzen und ihre relevanten Reaktionen sorgfältig zu überwachen.

Abstract

Aktuelle Risikobewertungsstrategien für Honigbienen stützen sich stark auf Labortests, die an erwachsenen oder unreifen Arbeitsbienen durchgeführt wurden, aber diese Methoden erfassen möglicherweise nicht genau die Auswirkungen der agrochemischen Exposition auf Honigbienenköniginnen. Als einzige Produzentin von befruchteten Eiern in einer Honigbienenkolonie ist die Königin wohl das wichtigste Einzelmitglied einer funktionierenden Kolonieeinheit. Daher sollte das Verständnis, wie sich Agrochemikalien auf die Gesundheit und Produktivität von Königinnen auswirken, als kritischer Aspekt der Risikobewertung von Pestiziden angesehen werden. Hier wird eine angepasste Methode vorgestellt, um Honigbienenköniginnen und Arbeiterköniginnen Begleitern agrochemischen Stressoren auszusetzen, die durch eine Arbeiterdiät verabreicht werden, gefolgt von der Verfolgung der Eierproduktion im Labor und der Beurteilung der ersten Instar-Eklosion mit einem speziellen Käfig, der als Queen Monitoring Cage bezeichnet wird. Um den Verwendungszweck der Methode zu veranschaulichen, werden die Ergebnisse eines Experiments beschrieben, in dem Arbeiterinnenbegleiterinnen mit subletalen Dosen von Imidacloprid gefüttert und die Auswirkungen auf Königinnen überwacht wurden.

Introduction

Aufgrund der weltweit gestiegenen Nachfrage nach landwirtschaftlichen Erzeugnissen erfordern moderne landwirtschaftliche Praktiken häufig den Einsatz von Agrochemikalien zur Bekämpfung zahlreicher Schädlinge, von denen bekannt ist, dass sie die Ernteerträge verringern oder schädigen1. Gleichzeitig verlassen sich die Erzeuger vieler Obst-, Gemüse- und Nusskulturen auf die Bestäubungsdienste kommerzieller Honigbienenvölker, um reichlich Ernteerträge zu erzielen2. Diese Praktiken können dazu führen, dass Bestäuber, einschließlich Honigbienen (Apis mellifera), schädlichen Pestizidrückständen ausgesetzt sind3. Gleichzeitig erfordert das weit verbreitete Vorhandensein von parasitärem Varroa destructor Milbenbefall in Honigbienenvölkern häufig, dass Imker ihre Bienenstöcke mit Mitiziden behandeln, was sich auch negativ auf die Gesundheit und Langlebigkeit der Kolonie auswirken kann4,5,6. Um die schädlichen Auswirkungen agrochemischer Produkte zu reduzieren und zu mildern, ist es notwendig, ihre Sicherheit für Honigbienen vor ihrer Umsetzung vollständig zu bewerten, damit Empfehlungen für ihre Verwendung zum Schutz nützlicher Insekten abgegeben werden können.

Derzeit stützt sich die Environmental Protection Agency (EPA) auf eine abgestufte Risikobewertungsstrategie für die Pestizidexposition gegenüber Honigbienen, die Labortests an erwachsenen Bienen und manchmal Honigbienenlarven umfasst7. Wenn Labortests der unteren Ebene die Bedenken hinsichtlich der Toxizität nicht ausräumen, können Feld- und Halbfeldtests auf höherer Ebene empfohlen werden. Während diese Labortests wertvolle Einblicke in die möglichen Auswirkungen von Agrochemikalien auf die Langlebigkeit der Arbeiter liefern, sind sie nicht unbedingt prädiktiv für ihre Auswirkungen auf Königinnen, die sich biologisch signifikant von Arbeiterinnen unterscheiden8 und verhaltensmäßig9. Darüber hinaus gibt es zahlreiche potenzielle Auswirkungen von Agrochemikalien auf Insekten über die Mortalität hinaus, die erhebliche Folgen für soziale Insekten haben können, die auf koordinierte Verhaltensweisen angewiesen sind, um als Kolonieeinheit zu fungieren10,11.

Obwohl die Mortalität die am häufigsten in Betracht gezogene Wirkung von agrochemischen Pestiziden ist12, können diese Produkte eine breite Palette von Auswirkungen sowohl auf Ziel- als auch auf Nichtzielarthropodenhaben,einschließlich verändertem Verhalten13,14 , 15,16, Abstoßung oder Attraktivität17,18,19, Veränderungen der Fütterungsmuster20,21,22 , und erhöhte oder verminderte Fruchtbarkeit20,21,22,23,24,25. Für soziale Insekten können diese Effekte die Interaktionen und Funktionen der Kolonien systemisch stören11. Von diesen Funktionen kann die Fortpflanzung, die stark von einer einzigen eierlegenden Königin abhängig ist, die vom Rest der Kolonieeinheit9unterstützt wird, besonders anfällig für Störungen aufgrund von Pestizidexposition sein.

Studien, die an unreifen Königinnen durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass die Entwicklungsexposition gegenüber Mitiziden das Verhalten, die Physiologie und das Überleben der erwachsenen Königin beeinflussen kann26,27. In ähnlicher Weise haben Studien mit vollen oder reduzierten Kolonien gezeigt, dass Agrochemikalien erwachsene Honigbienenköniginnen beeinflussen können, indem sie den Paarungserfolg28verringern, die Eiablage29verringern und die Lebensfähigkeit der produzierten Eier verringern25,30,31. Diese Phänomene waren bisher ohne den Einsatz ganzer Kolonien schwer zu beobachten, was vor allem auf einen Mangel an verfügbaren Labormethoden zurückzuführen war. Eine Methode zur Untersuchung der Eiablage von Königinnen unter streng kontrollierten Laborbedingungen unter Verwendung von Queen Monitoring Cages (QMC)32 wurde jedoch kürzlich angepasst, um die Auswirkungen von Agrochemikalien auf die Fruchtbarkeit der Königin zu untersuchen33. Hier werden diese Techniken zusammen mit zusätzlichen Methoden zur Messung und Verfolgung des Nahrungsverbrauchs der Arbeitnehmer in QMCs ausführlich beschrieben.

Diese Methoden sind vorteilhafter als Experimente, die Kolonien in voller Größe erfordern, da sie die Verabreichung präziser Dosen von Agrochemikalien an eine stark reduzierte Anzahl von Arbeitern im Vergleich zu den Zehntausenden ermöglichen, die typischerweise in einer Kolonie34vorhanden sind, die dann die Königin versorgen. Diese Expositionstechnik spiegelt die Exposition aus zweiter Hand wider, die Königinnen in realen Szenarien erleben würden, da sich Königinnen innerhalb einer Kolonie nicht selbst ernähren und sich auf Arbeiter verlassen, um sie mit Diät zu versorgen9. Ebenso verlassen Königinnen den Bienenstock im Allgemeinen nicht, außer während der Koloniereproduktion (Schwärmen) für Paarungsflüge35. Gepaarte Honigbienenköniginnen können von kommerziellen Königinnenzüchtern gekauft und über Nacht verschickt werden. Typischerweise verkaufen Königinnenzüchter Königinnen direkt, nachdem sie bestätigt haben, dass sie mit der Eiablage begonnen haben, was als Hinweis auf eine erfolgreiche Paarung angesehen wird. Wenn genauere Informationen über das Alter oder die Verwandtschaft der Königin benötigt werden, können sich die Forscher vor der Bestellung mit dem Königinzüchter beraten.

QMCs ermöglichen eine genaue Beobachtung und Quantifizierung der Eiablage von Honigbienenköniginnen und der Brutraten von Eiern32,33, was wertvolle Daten über die Auswirkungen der agrochemischen Exposition auf die Fruchtbarkeit der Königin liefert. Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse beschreiben ein Experiment zur Quantifizierung von Eiablage, Diätkonsum und Embryonenlebensfähigkeit in QMCs unter chronischer Exposition gegenüber feldrelevanten Konzentrationen des systemischen Neurotoxikanten Neonicotinoid-Pestizids Imidacloprid36. Einmal aufgetragen, transloziert Imidacloprid in Pflanzengewebe37, und Rückstände wurden die Pollen und der Nektar zahlreicher bienenbestäubter Pflanzen38,39,40nachgewiesen . Die Exposition gegenüber Imidacloprid kann eine breite Palette von schädlichen Auswirkungen auf Honigbienen haben, einschließlich einer beeinträchtigten Futtersuche16,einer beeinträchtigten Immunfunktion41und einer verringerten Rate der Kolonieausdehnung und des Überlebens42,43. Hier wurde Imidacloprid für die Verwendung als Testsubstanz ausgewählt, da Feldexperimente gezeigt haben, dass es die Eiablage der Honigbienenkönigin beeinflussen kann29

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Protocol

1. QMC-Montage

  1. Montieren Sie QMCs aus Teilen (Abbildung 1A) mit einer einzigen Eiablageplatte (ELP), die wie in Abbildung 1Bgezeigt eingefügt wird. Fügen Sie feeder Tubes erst hinzu, nachdem die Arbeiter in den Käfig gegeben wurden. Bedecken Sie die 4 Einzugslöcher vorübergehend mit Klebeband in Laborqualität.
  2. Führen Sie den Königinnenausschluss und die Tür der Futterkammer über die Futterkammer ein, um zu verhindern, dass die Königin die Fütterungskammer betritt und die behandelte Diät kontaktiert. Siehe Fine et al.32 für weitere Montagedetails.
  3. Sammeln Sie die Wachswabenrahmen, die die gekappte Arbeiterbrut aus Honigbienenvölkern enthalten, 24 h vor der Erwachsenenexlosion und legen Sie sie in einen Inkubator (34,5 ° C) in einer Brutbox. 24 Stunden später bürsten Sie die verdorbenen Bienen von den Rahmen in einen offenen Behälter, der mit einer Insektenbarrierefarbe (z. B. Fluon) ausgekleidet wurde, um zu verhindern, dass die Bienen herauskriechen.
  4. Mindestens 50 Bienen nach Gewicht (5 g ≈ 50 Bienen44,45) in die Eiablagekammer jedes QMC geben. Um sicherzustellen, dass ein vielfältiger genetischer Pool von Arbeitern im Experiment vertreten ist, erhalten Sie eine ungefähr gleiche Anzahl von Arbeitsbienen aus mindestens drei Kolonien und mischen Sie sie, bevor Sie sie zu den QMCs hinzufügen.
    HINWEIS: Neu entlassene Arbeitsbienen, die weniger als 1 Tag alt sind, können aufgrund ihrer unterentwickelten Flugmuskulatur und der ungehärteten Kutikula nicht fliegen oder stechen. Wenn sie in diesem Alter hinzugefügt werden, besteht keine Notwendigkeit, sie vor der Handhabung zu betäuben. Sie können gewogen werden, indem Bienen mit einem kleinen 1/4 Tassen Volumenmessbecher vorsichtig aus dem Behälter geschöpft und in einen zweiten Behälter (ausgekleidet mit Insektenschutzfarbe, z. B. Fluon) gelegt werden, der auf einer Waage geteert wurde. Die Fläche der Rahmen, die von einer gekappten Brut bedeckt sind, sollte ungefähr gleich sein, um sicherzustellen, dass die Quellkolonien in den QMC-Arbeiterpopulationen gleichermaßen vertreten sind. Die Homogenisierung von Arbeitsbienen kann erreicht werden, indem neu emittierte Bienen aus Rahmen, die aus allen Kolonien entnommen wurden, in denselben Behälter gebürstet werden und sie 5 Minuten lang mischen können, bevor sie zu QMCs hinzugefügt werden.
  5. Fügen Sie die Feeder hinzu, die Saccharoselösung, Wasser und Pollenzusatz enthalten (siehe Abschnitt 2).
  6. Setzen Sie die einzelnen gepaarten Königinnen CO2-Gas aus, um die Eiablage46 zu stimulieren und die Übertragung in QMC zu erleichtern.
    1. Verwenden Sie Königinnen, die von einem kommerziellen Züchter gekauft wurden, innerhalb von 48 Stunden nach Erhalt. Während sich die Königin noch im Versandkäfig befindet, legen Sie sie in eine durchsichtige Plastiktüte. Legen Sie ein Ende eines Kunststoffrohrs, das miteinem CO 2-Gasbehälter verbunden ist, in den Beutel und öffnen Sie vorsichtig das Kanisterventil, damit das CO2-Gas fließen kann.
    2. Wenn der Beutel mit Gas aufgeblasen wurde, schließen Sie gleichzeitig das Kanisterventil und halten Sie den Beutel geschlossen, um das Gas im Inneren einzufangen. Halten Sie den Beutel 30 Sekunden lang geschlossen oder bis sich die Königin nicht mehr bewegt. Entfernen Sie die Königin und öffnen Sie den Versandkäfig, sobald beobachtet wird, dass sie bewusstlos ist.
  7. Öffnen Sie teilweise die Tür zur Eierlegekammer, legen Sie die bewusstlose Königin vorsichtig hinein und schließen Sie den Deckel, wobei Sie darauf achten, die Königin oder die Arbeiterinnen nicht darin zu zerquetschen. Fügen Sie die zweite Eierlegeplatte zu jedem QMC hinzu, wie in Abbildung 1C gezeigt. Legen Sie ein Stück Laborband über die Oberseite der beiden ELPs, um zu verhindern, dass sie sich vom QMC-Rahmen trennen und verhindern, dass die Arbeiter den Käfig verlassen.
  8. Stellen Sie die Käfige in einen dunklen Inkubator mit stabilen Umgebungsbedingungen von 34 ± 0,5 ° C und 60% ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit, wie die Bedingungen in einer normalen Kolonie.

Figure 1
Abbildung 1. A: Zerlegte QMC. B: Teilweise montiertes QMC mit 1 ELP eingesetzt. C: Komplett montiertes QMC mit 2 ELPs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Zubereitung und Verabreichung von Diäten, die mit Agrochemikalien versetzt sind

  1. Um 1000 g 50% (g/g) Saccharoselösung herzustellen, legen Sie einen Rührstab in den Boden einer sauberen 1 L Glasreagenzflasche. Fügen Sie 500 g Saccharose und 500 ml entionisiertes Wasser hinzu. Schrauben Sie den Deckel der Flasche ab und verwenden Sie eine beheizte Rührplatte, die auf niedrige Hitze eingestellt ist, um die Lösung zu mischen, bis sich die gesamte Saccharose aufgelöst hat. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die agrochemischen Stammlösungen hinzufügen.
  2. Bereiten Sie die Stammlösungen von Agrochemikalien in einem geeigneten Lösungsmittel wie Aceton in einer Konzentration vor, die der Nahrung zugesetzt werden kann, um die gewünschte Endkonzentration der interessierenden Agrochemikalie zu erreichen.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von Aceton als Vehikellösungsmittel schreiben die Richtlinien der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) vor, dass die Endkonzentration von Aceton in der Ernährung bei Tests zur chronischen oralen Toxizität an erwachsenen Honigbienen47≤ 5% betragen muss. Einige Lösungsmittel wie n-Methyl-2-pyrrolidon5,31 und Dimethylsulfoxid25 können jedoch toxische Wirkungen unterhalb dieser Konzentration ausüben, daher wird empfohlen, die Lösungsmittelkonzentrationen in der Behandlungsdiät so niedrig wie möglich zu halten. Je nach Volumen und Art des verwendeten Lösungsmittels kann es erforderlich sein, sowohl eine Lösungsmittelkontrollgruppe als auch eine Negativkontrollgruppe einzubeziehen, um sicherzustellen, dass potenzielle Wirkungen aufgrund von Lösungsmitteltoxizität nachgewiesen werden. Bei der Verwendung von formulierten Produkten muss die Menge des verwendeten Produkts auf der Grundlage der in der Formulierung vorhandenen Konzentration angepasst werden. Abhängig von der Stabilität der im Lösungsmittel interessierenden Agrochemikalie können Stammlösungen bis zu 2 Wochen bei -20 °C aufbewahrt werden.
  3. Wählen Sie subletale Dosen basierend auf den Ergebnissen des OECD-Tests Nr. 245: Honigbiene (Apis mellifera L.),Chronischer oraler Toxizitätstest (10-Tage-Fütterung)47und identifizieren Sie die relevante Literatur durch Abfrage der Ecotox-Wissensdatenbank48.
  4. Verabreichen Sie die agrochemischen Behandlungen in einer Saccharoselösung, einem kommerziellen Pollenpräparat (falls als Pulver erhältlich) oder beidem. Bereiten Sie die experimentelle Diät für die Verwendung am selben Tag vor, indem Sie eine geeignete Menge Stammlösung zu gekühlter / raumtemperaturiger 50% iger Saccharoselösung (w / w) hinzufügen. Gründlich durch Wirbeln oder mit einem Rührstab auf mittlere Geschwindigkeit mischen. Für Pollenpräparate fügen Sie die agrochemisch geschnürte Saccharoselösung dem pulverförmigen Präparat anstelle des Sirups gemäß den Protokollen des Herstellers hinzu und stellen Sie sicher, dass das Volumen der verwendeten Stammlösung entsprechend dem Endgewicht der Pollendiät angepasst wird. Beispiele für Berechnungen finden Sie in Tabelle 1.
  5. Bereiten Sie die Dosierröhrchen aus 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor.
    1. Für flüssige Diät-Feeder erhitzen Sie die Spitze einer 20-Gauge-Nadel auf einer Kochplatte / Herdplatte und durchstechen Sie den Boden des Röhrchens zweimal. Schließen Sie den Röhrchendeckel und pipettieren Sie ca. 1,5 ml Saccharoselösung oder Wasser durch eines der Einstichlöcher. Stellen Sie das Rohr mit der punktierten Seite nach oben, bis es zum QMC hinzugefügt wird.
    2. Verwenden Sie für Pollenergänzungsfütterer eine Rasierklinge, um den Boden der Röhre abzuschneiden. Schließen Sie den Deckel und drücken Sie eine 1-2 g Kugel Pollenergänzung in die Tube, bis sie den Deckel berührt.
  6. Notieren Sie die Feedergewichte, bevor Sie sie in die QMCs legen. Halten Sie die ungenutzte Diät nicht länger als 48 Stunden bei 4 ° C.
Gewünschte Konzentration Gewünschte Lösungsmittel-Vehikel-Konzentration Gewünschtes Endvolumen/Masse der Saccharoselösung Voume der Stammlösung Imidacloprid auf Lager Lösung Vorgeschlagenes Stammlösungsrezept
Saccharose-Lösung 10 ppb (w/w) 0,05% (v/v) 81,45 ml/100 g* 40,7 μL 0,001 mg/40,7 μL 0,02 mg/814 μL
Pollen Ergänzung 10 ppb (w/w) 10 g** 4,07 μL 0,0001 mg/4,07 μL 0,02 mg/814 μL
Saccharose-Lösung 50 ppb (w/w) 0,05% (v/v) 78,5 ml/100 g* 40,7 μL 0,005 mg/40,7 μL 0,1 mg/814 μL
Pollen Ergänzung 50 ppb (w/w) 10 g** 4,07 μL 0,0005 mg/4,07 μL 0,1 mg/814 μL

Tabelle 1: Beispielrezepte für behandelte Saccharoselösung, Pollenergänzung und Brühenlösung. *Volumen basierend auf der Dichte von 50% (w/w) Saccharoselösung (1,228 g/ml). ** Die Dichte des Pollenpräparats variiert je nachdem, welches Produkt verwendet wird, aber wenn dieses Lösungsmittelvolumen verwendet wird, liegt die endgültige Lösungsmittelkonzentration im Pollenpräparat im gewünschten Bereich von ≤ 5% vol.

3. Überwachung - Eierproduktionsrate

  1. Quantifizieren Sie die Eiablage 1 bis 2 Mal pro Tag morgens und / oder abends. Beginnen Sie mit dem Entfernen von QMCs aus dem Inkubator, um nach Eiern zu suchen.
    HINWEIS: In einem erfolgreichen Experiment beginnt die Eierproduktion in den meisten Kontroll-QMCs innerhalb von 3 Tagen nach der ersten Käfigmontage. Nehmen Sie nur so viele QMCs gleichzeitig aus dem Inkubator, die innerhalb von 10 Minuten überprüft und gefüttert werden können. Längere Zeiträume außerhalb des Inkubators können die Eierproduktion stören.
  2. Untersuchen Sie die Rückseite der klaren ELPs auf Eier. Wenn Eier vorhanden sind, entfernen Sie die Türverkleidung vor dem Gewünschten Teller. Entfernen Sie das Klebeband von der anderen Seite der ELPs und schieben Sie die Türverkleidung vorsichtig zwischen dem ELP und den Bienen im QMC, wobei Sie darauf achten, dass keine Bienen zerquetscht werden, die die Zellen in den ELPs reinigen könnten.
  3. Entfernen Sie bei eingeschalteter Türverkleidung das ELP und zählen und notieren Sie die Anzahl der Eier in den ELP-Zellen. Entfernen Sie die Eier, indem Sie den Rand des ELP mit der offenen Zellseite nach unten auf eine harte Oberfläche (z. B. die Lippe eines Abfallbehälters) klopfen. Sobald die Eier herausfallen, ersetzen Sie das leere ELP im QMC. Entfernen und ersetzen Sie vorsichtig die Türverkleidung hinter dem ELP an der Außenseite des QMC. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit dem zweiten ELP und setzen Sie das Band nach Abschluss des QMC wieder ein.
    HINWEIS: Die Eierproduktion nimmt im Allgemeinen ab und die Mortalität steigt in qmCs nach 2 Wochen32,33, daher wird empfohlen, die Experimente nach 14 Tagen abzuschließen.

4. Überwachung - Lebensmittelverzehr

  1. Ersetzen Sie alle in qmc-Feedern verbleibenden Lebensmittel alle zwei Tage durch frisch zubereitete Diät. Bereiten Sie neue Futterröhrchen (einschließlich Wasser) vor und wiegen Sie sie, bevor Sie QMCs zur Überwachung aus dem Inkubator entfernen. Tauschen Sie alle alten Tuben durch neue aus und wiegen Sie alte Tuben, bevor Sie nicht verbrauchte Diät entsorgen. Vergleichen Sie das Endgewicht des Feeder-Röhrchens und des nicht verbrauchten Futters mit dem Gewicht desselben Feeder-Röhrchens, bevor Sie es in den QMC legen, um den Futterverbrauch zu schätzen.
  2. Überprüfen Sie zwischen den Tagen, an denen feeder ausgetauscht werden sollen, den Futterverbrauch einmal täglich (zur gleichen Zeit, wenn QMCs für die Eierproduktion überwacht werden), um sicherzustellen, dass die Feeder niemals leer sind. Wenn eine Feeder-Tube leer oder fast leer ist, entfernen Sie sie, füllen Sie sie auf, notieren Sie das Gewicht der Tube vorher und nachher und addieren Sie die Differenz zum 2-Tage-Diätverbrauch für den QMC.

5. Überwachung - Lebensfähigkeit des Embryos

  1. Entfernen Sie an einem ausgewählten Punkt während eines QMC-Experiments ELPs, die frisch gelegte Eier enthalten, gemäß Schritt 3aus dem QMC , entfernen Sie jedoch keine Eier aus dem ELP.
  2. Decken Sie das ELP mit einem universellen Mikrotiterdeckel ab und legen Sie es in einen Exsikkator mit einer gesättigten K2SO4-Lösung (150 gK2SO4 in 1 L Wasser, in einer flachen Schale aufbewahrt).
    HINWEIS: Etwas Salz sollte auf dem Boden der Schale sichtbar sein, nachdem die Mischung im Inkubator auf Temperatur gekommen ist.
  3. Bewahren Sie den Exsikkator in einem Inkubator auf 34,5 ° C auf, was zu einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95% im Inneren des Exsikkators führt, ähnlich den von Collins49verwendeten Bedingungen .
    HINWEIS: Fast alle Eier schlüpfen innerhalb von 72 ± 6 Stunden nach derLege 49,so dass die Schlüpfraten bereits 78 Stunden nach der Entfernung der ELPs aus dem QMC beurteilt werden können. Eine "C" -förmige Larve im Boden der Zelle weist auf ein erfolgreiches Schlüpfereignis hin. Eine gewisse Variation in diesem Timing ist möglich, wenn es sich beispielsweise um Drohnen und nicht um Arbeiter50 handelt.

6. Stichproben von Arbeitnehmern

  1. Wenn die QMCs mit überschüssigen Arbeitskräften gefüllt wurden, nehmen Sie die Arbeiterbienen zu einem ausgewählten Zeitpunkt während des Experiments zur Beurteilung behandlungsinduzierter Veränderungen in ihrer Physiologie ab. Führen Sie die Sammlungen in Verbindung mit täglichen Fütterungs- und Eierzählaktivitäten durch, um die Zeit zu minimieren, für die sich die QMCs außerhalb des Inkubators befinden.
  2. Platzieren Sie vor der Probenahme eine Türverkleidung zwischen einem ELP und dem Inneren des QMC und entfernen Sie das ELP. Heben Sie die Türverkleidung vorsichtig ca. 0,5 cm von der Basis des Käfigs an und entfernen Sie eine Arbeiterbiene mit einer federleichten Pinzette aus dem Inneren des QMC. Um zu verhindern, dass Bienen entweichen, bedecken Sie Teile der 0,5 cm großen Öffnung bei Bedarf mit einem behandschuhten Finger oder einem Stück Baumwolle.
  3. Bewahren Sie die gesammelte Biene für die Folgeanalyse auf und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Proben entnommen wurde. Für die Genexpressionsanalyse wird dringend empfohlen, Bienen in flüssigem Stickstoff einzufrieren und sofort bei -80 °C zu lagern51.

7. Sterblichkeit der Arbeitnehmer

  1. Beurteilen Sie die Sterblichkeit der Arbeiter während des Experiments, indem Sie die Anzahl der toten Bienen am Boden der Futterkammer und der Eiablagekammer zählen. Führen Sie diese Beurteilung in Verbindung mit der täglichen Quantifizierung der Eiablage durch.
  2. Entfernen Sie die toten Bienen vorsichtig mit einer Pinzette durch die Feederlöcher und bedecken Sie das Loch mit einem behandschuhten Finger oder einem Stück Baumwolle, während die Pinzette nicht eingeführt wird.
  3. Entfernen Sie die toten Bienen aus der Eiablagekammer, indem Sie die Türverkleidung vorsichtig etwa 0,5 cm von der Basis des Käfigs anheben und eine Pinzette einsetzen. Um zu verhindern, dass Bienen entweichen, bedecken Sie Teile der 0,5 cm großen Öffnung bei Bedarf mit einem behandschuhten Finger oder einem Stück Baumwolle.
  4. Beurteilen Sie die Arbeitersterblichkeit am Ende des Experiments, indem Sie alle toten Bienen aus den QMCs entfernen und zählen, indem Sie die zuvor beschriebenen Methoden anwenden, bevor sie die verbleibenden Bienen einschläfern.
    HINWEIS: In Abwesenheit von Arbeiterbienen produzieren Königinnen keine Eier und verhungern innerhalb von 24 Stunden. Wenn also festgestellt wird, dass alle Arbeiter in einem QMC tot sind, sollte der QMC aus dem Experiment entfernt werden. Ebenso, wenn eine Königin während des Experiments stirbt, sollte die QMC entfernt werden, und die Daten sollten angemessen zensiert werden.

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Representative Results

Die Produktion von Eiern wurde in QMCs überwacht, die wie oben beschrieben zusammengestellt und aufrechterhalten wurden, mit einmal täglichen Beobachtungen der Eierproduktion und 15 Käfigen pro Behandlungsgruppe. Neu gepaarte Königinnen von hauptsächlich krainer Beständen wurden gekauft und über Nacht von einem Königinnenzüchter verschifft, und Honigbienenarbeiter wurden aus 3 Kolonien gewonnen, die nach kommerziellen Standardmethoden in der Bienenforschungseinrichtung der Universität von Illinois Urbana-Champaign gehalten wurden. Hier wurden 4 diätetische Behandlungsgruppen verwendet: 1) 50 ppb (g/g) Imidacloprid in Saccharoselösung und Pollenergänzung (50 ppb - p+s), 2) 10 ppb Imidacloprid in Saccharoselösung und Pollenergänzung (10 ppb - p+s), 3) 10 ppb Imidacloprid in Pollenpräparat allein (10 ppb - p) und 4) eine Kontrollgruppe, die eine Diät erhielt, die ein äquivalentes Volumen an Aceton wie die Behandlungsgruppen (CTRL) enthielt.

Behandlungsbedingte Veränderungen der täglichen Eizellenzahl wurden wie in Fine et al.32 beschrieben mit geringfügigen Modifikationen bewertet. Kurz gesagt, ein Poisson log-lineares GEE mit einer autoregressiven (AR-1) Korrelationsmatrixstruktur wurde implementiert, um behandlungsbedingte Veränderungen in der Eierproduktion im Laufe der Zeit zu bewerten. Hier wurde Zeit (Tag) als kontinuierliche Variable behandelt und die Behandlung war kategorisch. Wald-Chi-Quadrat-Post-hoc-Tests wurden verwendet, um die Signifikanz zu bestimmen. Da an Tag 1 des Experiments keine Eiablage beobachtet wurde, wurde dieser Tag von der Analyse ausgeschlossen, um den Annahmen der GEE zu entsprechen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle S1 dargestellt. Die tägliche Eiproduktion war in den QMCs in der Behandlungsgruppe mit 50 ppb p+s signifikant niedriger(χ 2=43,99, p<0,001; Abbildung 2A).

Unterschiede in der Gesamtzahl der in QMCs durch Behandlung produzierten Eier wurden mit einem Einweg-ANOVA- und Tukey-HSD-Post-hoc-Test analysiert (Abbildung 3). Für diese Analyse wurde jeder QMC, der vor dem Ende des 14-tägigen Überwachungszeitraums aufgrund des Todes einer Königin oder eines Arbeiters aus dem Experiment entfernt wurde, ausgeschlossen, was zu N = 13 für die STRG- und die 50 ppb - p + s-Gruppen, N = 14 für 10 ppb - p und N = 15 für 10 ppb - p + s führte. Ein dosisabhängiger Effekt wurde bei Behandlungen beobachtet, die sowohl in Saccharose als auch in Pollen verabreicht wurden, wobei die größte Verringerung der Eierproduktion im Vergleich zur Kontrolle bei 50 ppb - p + s gefolgt von 10 ppb - p + s beobachtet wurde. Es wurde kein Unterschied in der Gesamtzahl der produzierten Eier zwischen CTRL und 10 ppb - p beobachtet (F3,52= 17,95, S<0,001, Tukey HSD).

Der Verbrauch von Pollenpräparat und Wasser wurde alle 48 Stunden für 10 Tage aufgezeichnet, und der Verbrauch von Saccharoselösung wurde alle 48 Stunden für 12 Tage aufgezeichnet. Veränderungen der Diätverbrauchsraten wurden unter Verwendung von Gaußschen verteilten GEEs mit den gleichen Parametern wie oben beschrieben bewertet (Abbildung 2B-D). Die Ergebnisse sind in Tabelle S1zusammengefasst. Kurz gesagt, die täglichen Raten des Saccharosekonsums stiegen im Laufe des Experiments signifikant an(χ 2= 6,03, p = 0,014), aber die Raten des Pollenergänzungsverbrauchs nahmen ab(χ 2= 174,98, P<0,001). Signifikant höhere Pollenkonsumraten wurden beobachtet, wenn Imidacloprid bei 10 ppb in Pollenergänzung allein verabreicht wurde(χ 2= 21,44, p<0,001) und signifikant abnahm, wenn es entweder bei 10 oder 50 ppb in Pollenpräparat und Saccharoselösung zusammen verabreicht wurde (10 ppb - p+s:χ 2= 6,59, p =0,010; 50 ppb - p+s): χ2=14,47, p=0,0001).

Die Eier wurden am Tag 7 des Experiments aus QMCs entnommen, und Veränderungen in der Anzahl der Eier, die nach der exposition der Mutter gegenüber agrochemischen Behandlungen erfolgreich schlüpften, wurden unter Verwendung eines verallgemeinerten linearen Mischmodells (GMLR) mit einer Binomialverteilung und qmC-Identität, die als zufälliger Effekt behandelt wurde, bewertet. Die mütterliche Exposition gegenüber Imidacloprid, verabreicht bei 10 ppb in Pollen allein oder in Pollen- und Saccharoselösung, hatte keinen Einfluss auf die Eizellschlüpfraten (10 ppb - p+s: Z=-0,139, p=0,290; 10 ppb - p: Z=0,182, p=0,856). Die Schlüpfraten konnten für Eier, die von Königinnen in QMCs gelegt wurden, die mit 50 ppb Imidacloprid-geschnürter Diät versorgt wurden, aufgrund der niedrigen Eierproduktionsraten in dieser Behandlungsgruppe nicht bewertet werden.

Für diese Arbeit wurden alle statistischen Analysen in R Studio 1.2.5003 (Boston, MA, USA) durchgeführt. Die Zahlen wurden mit JMP Pro 15 und Photoshop CC 2019 (Adobe Inc., San Jose, CA) erstellt. Die Daten sind in der Ergänzungsdatei S1verfügbar.

Figure 2
Abbildung 2. A: Durchschnittliche ± SE-Eier pro Tag in QMCs. B: Durchschnittliche ± SE-Pollenzusatz, C: Saccharoselösung, D: und Wasser (g), das während eines Zeitraums von 48 Stunden in QMCs verbraucht wird. Signifikanz der Behandlungen (angegeben durch "*") bestimmt durch GEE und Wald Chi-Quadrat Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Durchschnittliche ± SE Summe der durch Behandlung während des Versuchs gelegten Eier. Signifikanz (durch Buchstaben angegeben), bestimmt durch ANOVA und Tukey HSD Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle S1:Ergebnisse von GEEs, die Veränderungen der Eiablageraten und des Futterverbrauchs in QMCs im Zeitverlauf analysieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei S1: Bitte klicken Sie hier, um diese Ergänzende Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Fruchtbarkeit weiblicher Solitärinsekten sowie Von Königinnen in eusozialen Insektenkolonien kann durch abiotische Stressoren wie Agrochemikalien25,28,29,30,33beeinflusst werden . Bei Honigbienen können die Auswirkungen von Agrochemikalien auf Königinnen indirekt sein, da sie durch Veränderungen in ihrer Pflege und Fütterung durch Arbeiterbienen auftreten können. Unsere repräsentativen Ergebnisse, die denen in einer feldbasierten Studie29ähneln, zeigen, dass die Auswirkungen von Agrochemikalien auf die Königinnenleistung in einer Laborumgebung mit QMCs effizient gemessen werden können, was zu vergleichbaren Ergebnissen wie feldbasierte Ansätze führt. Darüber hinaus geben diese Ergebnisse Aufschluss über den Einfluss von Imidacloprid auf den Verzehr von Arbeitern und auf die Lebensfähigkeit von Eiern.

Imidacloprid hatte eindeutig negative Auswirkungen auf die Eierproduktion, wenn es in Saccharoselösung und Pollenergänzung zusammen verabreicht wurde. Dies ähnelt den Ergebnissen, die unter Verwendung von Beobachtungsnesselsuchten berichtet wurden, die mit Imidacloprid-Sirup versetzt wurden und frei nach Futter suchendürfen 29. Hier wurde jedoch eine dosisabhängige Reaktion beobachtet, wobei der ausgeprägteste Effekt in QMCs beobachtet wurde, die mit 50 ppb Imidacloprid im Verhältnis zur niedrigeren Konzentration bereitgestellt wurden. Im Gegensatz zu dem, was für Feldkolonien berichtet wurde, erlebte diese Gruppe eine fast einstellung der Eierproduktion. Es sollte beachtet werden, dass alle Konzentrationen, einschließlich 50 ppb, die in dieser Arbeit verwendet werden, höher sind als Pollen- und Nektarrückstände, die typischerweise beobachtet werden, wenn Imidacloprid als Saatgutbehandlung angewendet wird, und repräsentativer für Rückstände sind, die nach Bodenanwendungen gefunden werden40. Beispiele für relevante Pflanzen sind Kürbisgewächse und Zierpflanzen, die in Stadtlandschaften vorkommen29, und daher sollten diese Ergebnisse in diesem Zusammenhang interpretiert werden. Darüber hinaus deuten die beobachteten Unterschiede zwischen diesen Ergebnissen und denen, die mit Feldkolonien erzeugt wurden, wo die Ergebnisse selbst in den höchsten Behandlungsgruppen nicht so ausgeprägt waren, darauf hin, dass QMCs wie andere laborbasierte Assays empfindlicher sein können als die Verwendung von Kolonien in voller Größe52, was bei der Interpretation der Daten berücksichtigt werden sollte.

Zuvor berichtete Arbeiten, die die Eiablage mit exposition gegenüber Insektenwachstumsregulatoren (IGR) in QMCs untersuchten, fanden nicht heraus, dass IGRs eine Verringerung der Königinnen-Eiablageraten verursachen33, was zeigt, dass eine Störung der Eierproduktion keine einheitliche Stressreaktion ist. Obwohl Bewertungen auf Feldebene unter Verwendung von Kolonien in voller Größe eine ganzheitlichere Sicht auf die Auswirkungen von Agrochemikalien auf die Gesundheit der Kolonien bieten können, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass QMCs das Potenzial haben, als Instrument zur Identifizierung von Chemikalien wie Imidacloprid verwendet zu werden, die die Eiablage der Honigbienenkönigin beeinflussen können. Wenn sie im Rahmen einer breit angelegten Risikobewertungsstrategie verwendet werden, die Nutzungsmuster, Expositionsmuster und Auswirkungen auf andere Metriken der Honigbienengesundheit berücksichtigt, können die von QMCs generierten Daten zur Eierproduktion ein umfassenderes Verständnis der potenziellen Auswirkungen einer Agrochemikalie auf Honigbienenvölker liefern.

Zusätzlich zur Generierung quantitativer Eiablagedaten können QMCs verwendet werden, um Muster im Nahrungskonsum von Arbeitnehmern und Veränderungen in der Physiologie zu bewerten. Hier wurde gezeigt, dass 10 ppb Imidacloprid in der Pollendiät allein den Pollenergänzungskonsum bei Arbeiterinnen in Gegenwart einer gepaarten Königin stimuliert. Dieser Effekt wurde bei anderen diätetischen Behandlungen nicht beobachtet, wenn QMCs mit Imidacloprid sowohl in Pollenpräparat als auch in Saccharoselösung verabreicht wurden, selbst in der gleichen Konzentration. Es sollte beachtet werden, dass genauere Schätzungen der Verbrauchsrate erhalten werden können, indem die Mortalität verfolgt und die Messungen des Nahrungsverbrauchs auf der Grundlage der genauen Anzahl der in den QMCs verbleibenden Bienen angepasst werden, aber wenn die Sterblichkeit in allen Behandlungen konstant niedrig ist, können einige Vergleiche angestellt werden. Die Diskrepanz zwischen Behandlungen beim Verzehr von Pollen, die die gleiche Konzentration von Imidacloprid enthalten, kann mit dem Unterschied in der höheren Gesamtdosis zusammenhängen, die Bienen verabreicht wird, wenn Imidacloprid sowohl in Saccharose als auch in Pollenpräparat vorhanden ist, verglichen mit dem, wenn es nur in Pollenpräparaten vorhanden ist.

In niedrigen Konzentrationen gibt es Hinweise darauf, dass Honigbienen Nahrungsquellen bevorzugen, die Neonicotinoid-Pestizideenthalten 18, und es wurde berichtet, dass sie eine ähnliche Präferenz für blütenreiche Ressourcen mit Nikotin aufweisen53. Es wurde vermutet, dass diese Präferenzen auf die neurostimulativen Eigenschaften von Nikotin und Neonicotinoiden zurückzuführen sein könnten, die nikotinische Acetylcholinesterase-Rezeptorenaktivieren 54, die in Teilen des Honigbienengehirns exprimiert werden, die am Lernen und Gedächtnis beteiligt sind55. Bei Spinnmilben stimuliert Imidacloprid den Nahrungskonsum, was zu einer erhöhten Eiablage und Fruchtbarkeit führt22. Hier waren imidaclopridbedingte Erhöhungen des Pollenergänzungskonsums nicht mit einer Zunahme der Eiablage verbunden, und die Auswirkungen von Imidacloprid auf die Physiologie der Arbeiter in dieser Arbeit müssen noch untersucht werden. Zu verstehen, wie viel von einer agrochemisch geschnürten Diät Bienen in einer Kolonie wahrscheinlich verbrauchen werden, insbesondere Arbeiter, die mehr Pollen in ihrer Ernährung benötigen, um aktiv eine Legeköniginbereitzustellen 56, kann jedoch dazu beitragen, das Risiko einer Agrochemikalie auf verschiedene Aspekte der Kolonieleistung zu übertragen.

Imidacloprid verursachte keine messbaren Veränderungen der Lebensfähigkeit des Embryos, gemessen an den Schlüpfraten in Eiern, die aus QMCs entnommen wurden, die mit 10 ppb Imidacloprid in Pollenergänzung allein oder sowohl in Pollenergänzung als auch in Saccharoselösung bereitgestellt wurden. Dies unterscheidet sich von den Abnahmen der Eierschlüpfraten, die nach der IGR-Exposition in QMCs33berichtet wurden, was erneut zeigt, dass QMCs verwendet werden können, um spezifische und vielfältige Aspekte der Königinnenfruchtbarkeit zu untersuchen. Imidacloprid ist sehr wasserlöslich und wird wahrscheinlich von Bienen anders metabolisiert und ausgeschieden als fettlöslichere Agrochemikalien wie IGRs57, die bis zu einem gewissen Grad transovariell eliminiert werden können58,59,60,61, was zu Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung führt. Alternativ kann Imidacloprid, ein Neurotoxin36, die Entwicklung von Embryonen nicht auf die gleiche Weise beeinflussen wie IGRs, die auf Wege abzielen, die mit der Insektenentwicklung assoziiert sind62.

Eine Frage, die häufig von Forschern gestellt wird, die die Auswirkungen von Agrochemikalien auf die Reproduktion von Honigbienen verstehen wollen, ist, ob erwachsene Königinnen, die auf Arbeiter angewiesen sind, um sie mit Drüsensekreten als Nahrung zu versorgen9,63, direkt agrochemischen Rückständen ausgesetzt sind. Dies wurde nicht untersucht und ist in den hier berichteten Ergebnissen nicht dargestellt. Agrochemische Rückstände in Arbeiterdrüsensekreten sind jedoch typischerweise stark reduziert im Vergleich zu dem, was Arbeiter in kontrollierten Koloniefütterungsszenarien bereitgestellt werden64. In ähnlicher Weise wurden, wenn Kolonien in voller Größe Konzentrationen von Imidacloprid ausgesetzt waren, die zu einer verminderten Eiablage führten, bei Königinnen keine Rückstände festgestellt29, was darauf hindeutet, dass die in der referenzierten Arbeit beobachteten Veränderungen der Eiablageraten auf eine direkte Exposition gegenüber Spurenmengen zurückzuführen waren, die leicht ausgeschieden wurden, oder dass die beobachteten Wirkungen auf Königinnen auf Auswirkungen von Imidacloprid auf die Arbeiterinnen zurückzuführen waren, die für die Pflege und Versorgung der Königin verantwortlich waren. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Probenahme von Arbeiterbienen, von denen bekannt ist, dass sie die behandelte Diät von der Eklosion des Erwachsenen bis zum Zeitpunkt der Probenahme aufgenommen haben. Follow-up-Arbeiten, die die Auswirkungen von Imidacloprid auf die Physiologie von Arbeitsbienen untersuchen, die aus dem beschriebenen Experiment entnommen wurden, werden helfen, diese Frage zu klären.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellten Methoden es den Forschern ermöglichen werden, das Risiko von Agrochemikalien für Honigbienen besser zu bewerten, indem endpunkte im Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit, dem Überleben und der Entwicklung von Honigbienen bewertet werden. Die beschriebene Technik hat das Potenzial, die agrochemische Risikobewertung erheblich zu verbessern, indem sie quantitative Daten zur Königinnenfruchtbarkeit generiert, die mit Feld- und Halbfeldexperimenten schwer und ressourcenintensiv zu erfassen sind. Darüber hinaus verleiht die Anwesenheit einer Legekönigin den Experimenten, die an jungen Arbeiterinnen durchgeführt werden, die typischerweise die Mitglieder der Kolonie sind, die für die Pflege und Fütterung der Königin verantwortlich sind, Realismus9. Mit dieser Technik können die Risiken von Agrochemikalien für die Gesundheit, Langlebigkeit und Leistung von Honigbienenvölkern besser vorhergesagt und gemindert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Vielen Dank an Dr. Amy Cash-Ahmed, Nathanael J. Beach und Alison L. Sankey für ihre Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium. USDA ist ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Defense Advanced Research Projects Agency # HR0011-16-2-0019 an Gene E. Robinson und Huimin Zhao, das USDA-Projekt 2030-21000-001-00-D und die Phänotypic Plasticity Research Experience für Community College-Studenten an der University of Illinois in Urbana Champaign unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluon BioQuip, Rancho Dominguez, CA 2871A
Honey bee queens Olivarez Honey Bees, Orland, CA
Imidacloprid Sigma-Aldritch, St. Louis, MO 37894
MegaBee Powder MegaBee, San Dieago, CA
Microcentrifuge tubes 2 mL ThermoFisher Scientific, Waltham, MA 02-682-004
Needles 20 gauge W. W. Grainger, Lake Forest, IL 5FVK4
Potassium Sulfate Sigma-Aldritch, St. Louis, MO P0772
Queen Monitoring Cages University of Illinois Urbana-Champaign Patent application number: 20190350175
Sucrose Sigma-Aldritch, St. Louis, MO S8501
Universal Microplate Lids ThermoFisher Scientific, Waltham, MA 5500

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Biologie Heft 169
Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen
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Fine, J. D., Torres, K. M., Martin,… More

Fine, J. D., Torres, K. M., Martin, J., Robinson, G. E. Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens. J. Vis. Exp. (169), e62316, doi:10.3791/62316 (2021).

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