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Biology

Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62316
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3,4
1Invasive Species and Pollinator Health Research Unit, USDA-ARS, 2Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Department of Entomology, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Questo protocollo è stato sviluppato per migliorare la comprensione di come le sostanze agrochimiche influenzano la riproduzione delle apimellifere ( Apis mellifera) stabilendo metodi per esporre le regine delle api da miele e i loro custodi operai ai prodotti agrochimici in un ambiente controllato e di laboratorio e monitorando attentamente le loro risposte pertinenti.

Abstract

Le attuali strategie di valutazione del rischio per le api mellifere si basano fortemente su test di laboratorio eseguiti su api operaie adulte o immature, ma questi metodi potrebbero non catturare con precisione gli effetti dell'esposizione agrochimica sulle regine delle api da miele. Come unico produttore di uova fecondate all'interno di una colonia di api, la regina è probabilmente il membro singolo più importante di un'unità di colonia funzionante. Pertanto, comprendere come i prodotti agrochimici influenzano la salute e la produttività della regina dovrebbe essere considerato un aspetto critico della valutazione del rischio dei pesticidi. Qui, viene presentato un metodo adattato per esporre le regine delle api da miele e le assistenti delle regine operaie a fattori di stress agrochimici somministrati attraverso una dieta dei lavoratori, seguita dal monitoraggio della produzione di uova in laboratorio e dalla valutazione della prima chiusura instar utilizzando una gabbia specializzata, denominata Queen Monitoring Cage. Per illustrare l'uso previsto del metodo, vengono descritti i risultati di un esperimento in cui gli assistenti della regina operaia sono stati nutriti con una dieta contenente dosi subletali di imidacloprid e sono stati monitorati gli effetti sulle regine.

Introduction

A causa dell'aumento della domanda globale di prodotti agricoli, le moderne pratiche agricole spesso richiedono l'uso di prodotti agrochimici per controllare numerosi parassiti noti per ridurre o danneggiare i raccolti1. Allo stesso tempo, i coltivatori di molte colture di frutta, verdura e noci si affidano ai servizi di impollinazione forniti dalle colonie commerciali di api da miele per garantire abbondanti raccolti2. Queste pratiche possono comportare che gli impollinatori, comprese le apimellifere ( Apis mellifera), siano esposti a livelli nocivi di residui di pesticidi3. Allo stesso tempo, la diffusa presenza di infestazioni parassitarie di acari Varroa destructor nelle colonie di api da miele richiede spesso agli apicoltori di trattare i loro alveari con miticidi, che possono anche esercitare effetti negativi sulla salute e sulla longevità della colonia4,5,6. Per ridurre e mitigare gli effetti nocivi dei prodotti agrochimici, è necessario valutare appieno la loro sicurezza per le api mellifere prima della loro attuazione in modo che possano essere formulate raccomandazioni per il loro uso per proteggere gli insetti benefici.

Attualmente, l'Environmental Protection Agency (EPA) si basa su una strategia di valutazione del rischio a più livelli per l'esposizione ai pesticidi delle api da miele, che prevede test di laboratorio sulle api adulte e talvolta sulle larve delle api da miele7. Se i test di laboratorio di livello inferiore non riescono ad alleviare i timori di tossicità, possono essere raccomandati test di campo e semi-campo di livello superiore. Mentre questi test di laboratorio forniscono preziose informazioni sui potenziali effetti dei prodotti agrochimici sulla longevità dei lavoratori, non sono necessariamente predittivi dei loro effetti sulle regine, che differiscono significativamente dai lavoratori biologicamente8 e comportamentalmente9. Inoltre, ci sono numerosi potenziali effetti dei prodotti agrochimici sugli insetti oltre la mortalità, che possono avere conseguenze considerevoli per gli insetti sociali che si basano su comportamenti coordinati per funzionare come un'unità di colonia10,11.

Sebbene la mortalità sia l'effetto più comunemente considerato dei pesticidi agrochimici12, questi prodotti possono avere una vasta gamma di effetti sugli artropodi bersaglio e non bersaglio, tra cui comportamento alterato13,14, 15,16,repellenza o attrattiva17,18,19,cambiamenti nei modelli di alimentazione20,21,22 , e fecondità aumentata o diminuita20,21,22,23,24,25. Per gli insetti sociali, questi effetti possono interrompere sistematicamente le interazioni e le funzioni delle colonie11. Di queste funzioni, la riproduzione, che dipende fortemente da una singola regina deposta dalle uova sostenuta dal resto dell'unità di colonia9,può essere particolarmente vulnerabile alle perturbazioni dovute all'esposizione ai pesticidi.

Studi condotti su regine immature hanno dimostrato che l'esposizione dello sviluppo ai miticidi può influenzare il comportamento della regina adulta, la fisiologia, la sopravvivenza26,27. Allo stesso modo, studi che utilizzano colonie di dimensioni piene o ridotte hanno dimostrato che i prodotti agrochimici possono influenzare le regine adulte delle api da miele diminuendo il successo dell'accoppiamento28, diminuendo l'ovodeposizione29e diminuendo la vitalità delle uova prodotte25,30,31. Questi fenomeni sono stati precedentemente difficili da osservare senza l'uso di intere colonie, in gran parte a causa della mancanza di metodi di laboratorio disponibili. Tuttavia, un metodo per studiare l'ovodeposizione della regina in condizioni di laboratorio strettamente controllate utilizzando Queen Monitoring Cages (QMC)32 è stato recentemente adattato per esaminare gli effetti dei prodotti agrochimici sulla fecondità regina33. Qui, queste tecniche sono descritte in dettaglio insieme a metodi aggiuntivi per misurare e tenere traccia del consumo di dieta dei lavoratori nei CQM.

Questi metodi sono più vantaggiosi degli esperimenti che richiedono colonie a grandezza naturale perché consentono la somministrazione di dosi precise di prodotti agrochimici a un numero notevolmente ridotto di lavoratori rispetto alle decine di migliaia tipicamente presenti all'interno di una colonia34, che poi forniscono la regina. Questa tecnica di esposizione rispecchia l'esposizione di seconda mano che le regine sperimenterebbero in scenari del mondo reale perché, all'interno di una colonia, le regine non si nutrono e si affidano ai lavoratori per fornire loro la dieta9. Allo stesso modo, le regine generalmente non lasciano l'alveare tranne durante la riproduzione della colonia (sciame) per i voli di accoppiamento35. Le regine delle api da miele accoppiate possono essere acquistate da allevatori di regine commerciali e spedite durante la notte. In genere, gli allevatori di regine vendono regine direttamente dopo aver confermato che hanno iniziato a deporre le uova, il che è preso come un'indicazione di un accoppiamento riuscito. Se sono necessarie informazioni più precise sull'età della regina o sulla parentela, i ricercatori possono consultare l'allevatore della regina prima di effettuare un ordine.

I QMC consentono l'osservazione e la quantificazione precise dell'ovodeposizione delle api mellifere e dei tassi di schiusa delle uova32,33,fornendo dati preziosi relativi agli effetti dell'esposizione agrochimica sulla fecondità regina. I risultati rappresentativi qui presentati descrivono un esperimento che quantifica l'ovodeposizione, il consumo di dieta e la vitalità degli embrioni nei QMC sotto esposizione cronica a concentrazioni rilevanti sul campo del pesticida neonicotinoide neurotossico sistemico imidacloprid36. Una volta applicato, l'imidacloprid trasloca ai tessuti vegetali37e sono stati rilevati residui il polline e il nettare di numerose piante impollinate dalle api38,39,40. L'esposizione all'imidacloprid può avere una vasta gamma di effetti dannosi sulle api mellifere, tra cui prestazioni di foraggiamento compromesse16,compromissione della funzione immunitaria41e diminuzione dei tassi di espansione e sopravvivenza della colonia42,43. Qui, l'imidacloprid è stata selezionata per l'uso come sostanza in esame perché esperimenti sul campo hanno dimostrato che può influenzare l'ovodeposizione della regina delle api da miele29

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Protocol

1. Assemblaggio QMC

  1. Assemblare QMC da parti (Figura 1A) con una singola piastra di deposizione delle uova (ELP) inserita come mostrato nella Figura 1B. Non aggiungere tubi di alimentazione fino a quando i lavoratori non sono stati aggiunti alla gabbia. Coprire temporaneamente i 4 fori di alimentazione con nastro adesivo di laboratorio.
  2. Inserire l'escluso della regina e la porta della camera di alimentazione sopra la camera di alimentazione per impedire alla regina di entrare nella camera di alimentazione e contattare la dieta trattata. Vedi Fine et al.32 per ulteriori dettagli sull'assemblaggio.
  3. Raccogliere i telai a pettine di cera contenenti la covata operaia tappata dalle colonie di api da miele 24 ore prima dell'eclosione adulta e metterli in un'incubatrice (34,5 ° C) all'interno di una scatola di covata. 24 ore dopo, spazzolare le api chiuse fuori dai telai e in un contenitore aperto che è stato rivestito con una vernice barriera per insetti (ad esempio, Fluon) per evitare che le api strisciano fuori.
  4. Aggiungere almeno 50 api in peso (5 g ≈ 50 api44,45)alla camera di deposizione delle uova di ogni QMC. Per garantire che un pool genetico diversificato di lavoratori sia rappresentato nell'esperimento, ottenere un numero approssimativamente uguale di api operaie da almeno tre colonie e mescolarle prima di aggiungerle ai CQM.
    NOTA: le api operaie appena chiuse di età inferiore a 1 giorno non possono volare o pungere a causa dei loro muscoli di volo sottosviluppati e della cuticola non indurita. Se vengono aggiunti a questa età, non è necessario anestetizzarli prima della manipolazione. Possono essere pesati raccogliendo delicatamente le api dal contenitore usando un piccolo misurino da 1/4 di tazza di volume e mettendole in un secondo contenitore (rivestito con vernice barriera per insetti, ad esempio Fluon) che è stato tarato su una bilancia. L'area dei telai coperti dalla covata tappata dovrebbe essere approssimativamente uguale per garantire che le colonie di origine siano equamente rappresentate nelle popolazioni di lavoratori QMC. L'omogeneizzazione delle api operaie può essere ottenuta spazzolando le api appena chiuse da telai prelevati da tutte le colonie nello stesso contenitore e consentendo loro di mescolarsi per 5 minuti prima di aggiungerle ai CMC.
  5. Aggiungere gli alimentatori contenenti soluzione di saccarosio, acqua e supplemento di polline (vedere paragrafo 2).
  6. Esporre le singole regine accoppiate al gas CO2 per stimolare la deposizione delle uova46 e facilitare il trasferimento in QMC.
    1. Usa le regine acquistate da un allevatore commerciale entro 48 ore dal ricevimento. Mentre la regina è ancora all'interno della gabbia di spedizione, mettila in un sacchetto di plastica trasparente. Posizionare un'estremità di un tubo di plastica collegato a un contenitore di gas CO2 all'interno del sacchetto e aprire delicatamente la valvola del contenitore per consentire al gas CO2 di fluire.
    2. Quando il sacchetto è stato gonfiato con gas, chiudere contemporaneamente la valvola del contenitore e tenere il sacchetto chiuso per intrappolare il gas all'interno. Tenere la borsa chiusa per 30 s o fino a quando la regina non ha smesso di muoversi. Rimuovi la regina e apri la gabbia di spedizione una volta che viene osservata essere incosciente.
  7. Aprire parzialmente la porta della camera di deposizione delle uova, posizionare delicatamente la regina incosciente all'interno e chiudere il coperchio, facendo attenzione a non schiacciare la regina o le operaie all'interno. Aggiungere la seconda piastra di deposizione delle uova a ciascun QMC come mostrato nella Figura 1C. Posizionare un pezzo di nastro da laboratorio sulla parte superiore dei due ELP per evitare che si separino dal telaio QMC e impedire ai lavoratori di uscire dalla gabbia.
  8. Posizionare le gabbie in un'incubatrice buia con condizioni ambientali stabili di 34 ± 0,5 °C e 60% ± 10% di umidità relativa, come le condizioni all'interno di una colonia normale.

Figure 1
Figura 1. A: QMC smontato. B: QMC parzialmente assemblato con 1 ELP inserito. D: QMC completamente assemblato con 2 ELP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione e somministrazione di diete allacciate con prodotti agrochimici

  1. Per preparare 1000 g di soluzione di saccarosio al 50% (g/g), posizionare una barra di agitazione sul fondo di un flacone di reagente di vetro da 1 L pulito. Aggiungere 500 g di saccarosio e 500 ml di acqua deionizzata. Svitare il coperchio del flacone e utilizzare una piastra riscaldata a fuoco basso per mescolare la soluzione fino a quando tutto il saccarosio non si sarà sciolto. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente prima di aggiungere le soluzioni di riserva agrochimiche.
  2. Preparare le soluzioni stock di prodotti agrochimici in un solvente appropriato, come l'acetone, a una concentrazione che può essere aggiunta alla dieta per ottenere la concentrazione finale desiderata dell'agrochimico di interesse.
    NOTA: Quando si utilizza l'acetone come solvente per veicoli, le linee guida dell'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) stabiliscono che la concentrazione finale di acetone nella dieta deve essere ≤ 5% per i test di tossicità orale cronica sulle api adulte47. Tuttavia, alcuni solventi come n-metil-2-pirrolidone5, 31 e dimetilsolfossido25 possono esercitare effetti tossici al di sotto di questa concentrazione, quindi si raccomanda di mantenere le concentrazioni di solvente il più basse possibile nella dieta di trattamento. A seconda del volume e del tipo di solvente utilizzato, può essere necessario includere sia un gruppo di controllo del solvente che un gruppo di controllo negativo per garantire che vengano rilevati potenziali effetti dovuti alla tossicità del solvente. Quando si utilizzano prodotti formulati, la quantità del prodotto utilizzato deve essere regolata in base alla concentrazione presente nella formulazione. A seconda della stabilità dell'agrochimico di interesse nel solvente, le soluzioni stock possono essere conservate fino a 2 settimane a -20 °C.
  3. Selezionare le dosi subletali in base ai risultati del test OCSE n. 245: Apemellifera ( Apis mellifera L.), Test di tossicità orale cronica (alimentazione a 10 giorni)47e identificare la letteratura pertinente interrogando la knowledge base Ecotox48.
  4. Somministrare i trattamenti agrochimici in una soluzione di saccarosio, un integratore di polline commerciale (se disponibile in polvere) o entrambi. Preparare la dieta sperimentale per l'uso lo stesso giorno aggiungendo una quantità appropriata di soluzione madre alla soluzione di saccarosio al 50% refrigerata/temperatura ambiente (p/p). Mescolare accuratamente a vortice o con una barra di agitazione impostata a velocità media. Per gli integratori di polline, aggiungere la soluzione agrochimica di saccarosio allacciato al supplemento in polvere anziché allo sciroppo secondo i protocolli del produttore, assicurandosi di regolare il volume della soluzione madre utilizzata in base al peso finale della dieta del polline. Vedere la Tabella 1 per i calcoli di esempio.
  5. Preparare i tubi di alimentazione da 2 mL di tubi di microcentrifuga.
    1. Per gli alimentatori dietetici liquidi, riscaldare la punta di un ago calibro 20 su una piastra calda / piano cottura e forare due volte il fondo del tubo. Chiudere il coperchio del tubo e la pipetta di circa 1,5 mL di soluzione di saccarosio o acqua attraverso uno dei fori di foratura. Impostare il tubo verso il basso con il lato forato verso l'alto fino a quando non viene aggiunto al QMC.
    2. Per gli alimentatori di integratori di polline, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il fondo del tubo. Chiudere il coperchio e spingere una palla di 1-2 g di integratore di polline nel tubo fino a quando non tocca il coperchio.
  6. Registrare i pesi dell'alimentatore prima di inserirli nei QMC. Non mantenere la dieta inutilizzata a 4 °C per oltre 48 ore.
Concentrazione desiderata Concentrazione desiderata del veicolo solvente Volume/massa finale desiderata della soluzione di saccarosio Voume di soluzione madre Imidacloprid in soluzione madre Ricetta di soluzione madre suggerita
Soluzione di saccarosio 10 ppb (con le camere) 0,05% (v/v) 81,45 ml/100 g* 40,7 μL 0,001 mg/40,7 μL 0,02 mg/814 μL
Supplemento di polline 10 ppb (con le camere) 10 g** 4,07 μL 0,0001 mg/4,07 μL 0,02 mg/814 μL
Soluzione di saccarosio 50 ppb (p/p) 0,05% (v/v) 78,5 ml/100 g* 40,7 μL 0,005 mg/40,7 μL 0,1 mg/814 μL
Supplemento di polline 50 ppb (p/p) 10 g** 4,07 μL 0,0005 mg/4,07 μL 0,1 mg/814 μL

Tabella 1: Ricette di esempio per soluzione di saccarosio trattato, integratore di polline e soluzione madre. *Volume basato sulla densità della soluzione di saccarosio al 50% (p/p) (1,228 g/ml). **La densità dell'integratore di polline varierà a seconda del prodotto utilizzato, ma se viene utilizzato questo volume di solvente, la concentrazione finale di solvente nel supplemento di polline sarà compresa nell'intervallo desiderato di ≤ 5% in volume.

3. Monitoraggio - Tasso di produzione di uova

  1. Quantificare la deposizione dell'uovo da 1 a 2 volte al giorno al mattino e/o alla sera. Inizia rimuovendo i QMC dall'incubatrice per verificare la presenza di uova.
    NOTA: In un esperimento di successo, la produzione di uova inizierà nella maggior parte dei CQMC di controllo entro 3 giorni dall'assemblaggio iniziale della gabbia. Estrai dall'incubatore solo il maggior numero di CMC contemporaneamente che può essere controllato e alimentato entro 10 minuti. Periodi più lunghi al di fuori dell'incubatrice possono interrompere la produzione di uova.
  2. Esaminare il dorso degli ELP trasparenti per le uova. Se sono presenti uova, rimuovere il pannello della porta davanti alla piastra di interesse. Rimuovere il nastro da tutti gli ELP e far scorrere con attenzione il pannello della porta tra l'ELP e le api all'interno del QMC, facendo attenzione a non schiacciare le api che potrebbero pulire le cellule negli ELP.
  3. Con il pannello della porta in posizione, rimuovere l'ELP e contare e registrare il numero di uova all'interno delle celle ELP. Rimuovere le uova picchiettando il bordo dell'ELP, aperto lato cella verso il basso, su una superficie dura (come il labbro di un recipiente di rifiuti). Una volta che le uova cadono, sostituire l'ELP vuoto nel QMC. Rimuovere e sostituire delicatamente il pannello della porta dietro l'ELP all'esterno del QMC. Ripetere se necessario con il secondo ELP e sostituire il nastro attraverso il QMC al termine.
    NOTA: La produzione di uova generalmente diminuisce e la mortalità aumenta nei CQM dopo 2 settimane32,33,pertanto si raccomanda di concludere gli esperimenti dopo 14 giorni.

4. Monitoraggio - Consumo alimentare

  1. Sostituire tutto il cibo rimanente negli alimentatori QMC con una dieta preparata al momento ogni due giorni. Preparare nuovi tubi di alimentazione (compresa l'acqua) e pesarli prima di rimuovere i CMC dall'incubatore per il monitoraggio. Scambia tutti i vecchi tubi con quelli nuovi e pesa i vecchi tubi prima di smaltire la dieta non consumata. Confrontare il peso finale del tubo di alimentazione e della dieta non consumata con il peso dello stesso tubo di alimentazione prima di inserirlo nel QMC per stimare il consumo di dieta.
  2. Tra i giorni in cui gli alimentatori sono programmati per essere sostituiti, controllare il consumo di dieta una volta al giorno (allo stesso tempo in cui i QMC sono monitorati per la produzione di uova) per garantire che gli alimentatori non siano mai vuoti. Se un tubo di alimentazione è vuoto o quasi vuoto, rimuoverlo, riempirlo, registrare il peso del tubo prima e dopo e aggiungere la differenza al consumo di dieta totale di 2 giorni per il QMC.

5. Monitoraggio - Vitalità embrionale

  1. In un punto selezionato durante un esperimento QMC, rimuovere gli ELP contenenti uova appena deposte dal QMC secondo la fase 3, ma non rimuovere le uova dall'ELP.
  2. Coprire l'ELP con un coperchio universale in micropiastra e posizionarlo all'interno di un essiccatore con unasoluzioneSatura K 2 SO4 (150 g K2SO4 in 1 L di acqua, conservata in un piatto poco profondo).
    NOTA: un po 'di sale dovrebbe essere visibile sul fondo del piatto dopo che la miscela è arrivata a temperatura nell'incubatrice.
  3. Tenere l'essiccatore in un incubatore impostato a 34,5 °C, con conseguente umidità relativa del 95% all'interno dell'essiccatore, simile alle condizioni utilizzate da Collins49.
    NOTA: Quasi tutte le uova si schiudono entro 72 ± 6 ore da quando sono state deposte49,quindi i tassi di schiusa possono essere valutati già 78 ore dopo che gli ELP sono stati rimossi dal QMC. Una larva a forma di "C" nella parte inferiore della cellula è indicativa di un evento di schiusa di successo. Qualche variazione in questa tempistica è possibile se, ad esempio, le uova sono droni e non lavoratori50.

6. Campionamento dei lavoratori

  1. Se i QMC sono stati popolati con lavoratori in eccesso, campionare le api operaie in un punto temporale selezionato durante l'esperimento per valutare i cambiamenti indotti dal trattamento nella loro fisiologia. Eseguire le raccolte in combinazione con le attività quotidiane di alimentazione e conteggio delle uova per ridurre al minimo il tempo per il quale i QMC sono al di fuori dell'incubatrice.
  2. Prima di campionare, posizionare un pannello della porta tra un ELP e l'interno del QMC e rimuovere l'ELP. Sollevare con attenzione il pannello della porta a circa 0,5 cm dalla base della gabbia e rimuovere un'ape operaia dall'interno del QMC utilizzando pinzette di peso piuma. Per evitare che le api scappino, coprire parti dell'apertura di 0,5 cm con un dito guantato o un pezzo di cotone, se necessario.
  3. Conservare l'ape raccolta per l'analisi di follow-up e ripetere questo processo fino a quando non è stato raccolto il numero desiderato di campioni. Per l'analisi dell'espressione genica, si raccomanda vivamente di congelare le api in azoto liquido e lo stoccaggio immediato a -80 °C51.

7. Mortalità dei lavoratori

  1. Valutare la mortalità dei lavoratori durante l'esperimento contando il numero di api morte sul fondo della camera di alimentazione e della camera di deposizione delle uova. Eseguire questa valutazione in combinazione con la quantificazione giornaliera della deposizione delle uova.
  2. Usando la pinza, rimuovere con cura le api morte attraverso i fori dell'alimentatore, coprendo il foro con un dito guantato o un pezzo di cotone mentre la pinza non viene inserita.
  3. Rimuovere le api morte dalla camera di deposizione delle uova sollevando con cura il pannello della porta a circa 0,5 cm dalla base della gabbia e inserendo una pinza. Per evitare che le api scappino, coprire parti dell'apertura di 0,5 cm con un dito guantato o un pezzo di cotone, se necessario.
  4. Valutare la mortalità dei lavoratori alla conclusione dell'esperimento rimuovendo e contando tutte le api morte dai CQM utilizzando i metodi precedentemente descritti prima dell'eutanasia delle api rimanenti.
    NOTA: In assenza di api operaie, le regine non produrranno uova e moriranno di fame entro 24 ore. Pertanto, se si osserva che tutti i lavoratori in un QMC sono morti, il QMC deve essere rimosso dall'esperimento. Allo stesso modo, se una regina muore durante l'esperimento, il QMC dovrebbe essere rimosso e i dati dovrebbero essere adeguatamente censurati.

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Representative Results

La produzione di uova è stata monitorata in CMC assemblati e mantenuti come descritto sopra con osservazioni una volta al giorno della produzione di uova e 15 gabbie per gruppo di trattamento. Le regine appena accoppiate di stock principalmente carniola sono state acquistate e spedite durante la notte da un allevatore di regine, e i lavoratori delle api da miele sono stati ottenuti da 3 colonie mantenute secondo metodi commerciali standard presso la Bee Research Facility presso l'Università dell'Illinois Urbana-Champaign. Qui sono stati utilizzati 4 gruppi di trattamento dietetico: 1) 50 ppb (g / g) imidacloprid in soluzione di saccarosio e integratore di polline (50 ppb - p + s), 2) 10 ppb imidacloprid in soluzione di saccarosio e integratore di polline (10 ppb - p + s), 3) 10 ppb imidacloprid nel solo integratore di polline (10 ppb - p) e 4) un gruppo di controllo dato dieta contenente un volume equivalente di acetone come i gruppi di trattamento (CTRL).

I cambiamenti correlati al trattamento nella conta giornaliera degli ovuli sono stati valutati come descritto in Fine et al.32 con modifiche minori. In breve, è stato implementato un GEE log-lineare di Poisson con una struttura a matrice di correlazione auto-regressiva (AR-1) per valutare i cambiamenti correlati al trattamento nella produzione di uova nel tempo. Qui, il tempo (giorno) è stato trattato come una variabile continua e il trattamento è stato categorico. I test post hoc di Wald chi-square sono stati utilizzati per determinare il significato. Poiché non è stata osservata alcuna deposizione delle uova il giorno 1 dell'esperimento, questo giorno è stato escluso dall'analisi per conformarsi alle ipotesi del GEE. I risultati di questa analisi sono mostrati nella Tabella S1. La produzione giornaliera di uova era significativamente inferiore nei QMC nel gruppo di trattamento con p+s a 50 ppb(χ 2=43,99, p<0,001; Figura 2A).

Le differenze nel numero totale di uova prodotte nei CQM per trattamento sono state analizzate utilizzando un test post hoc ANOVA e Tukey HSD unidirezionale (Figura 3). Per questa analisi, è stato escluso qualsiasi QMC rimosso dall'esperimento prima della fine del periodo di monitoraggio di 14 giorni a causa della morte della regina o del lavoratore, risultando in N = 13 ciascuno per i gruppi CTRL e 50 ppb - p + s, N = 14 per 10 ppb - p e N = 15 per 10 ppb - p + s. Un effetto dose-dipendente è stato osservato per i trattamenti somministrati sia in saccarosio che in polline, con la maggiore riduzione della produzione di uova rispetto al controllo osservata in 50 ppb - p + s seguiti da 10 ppb - p + s. Non è stata osservata alcuna differenza nel totale delle uova prodotte tra CTRL e 10 ppb - p (F3,52= 17,95, p<0,001, Tukey HSD).

Il consumo di supplemento di polline e acqua è stato registrato ogni 48 ore per 10 giorni e il consumo di soluzione di saccarosio è stato registrato ogni 48 ore per 12 giorni. I cambiamenti nei tassi di consumo della dieta sono stati valutati utilizzando GEE distribuiti gaussiani con gli stessi parametri sopra descritti (Figura 2B-D). I risultati sono riassunti nella Tabella S1. In breve, i tassi giornalieri di consumo di saccarosio sono aumentati significativamente con il progredire dell'esperimento(χ 2= 6,03, p = 0,014), ma i tassi di consumo di integratori di polline sono diminuiti(χ 2= 174,98, p<0,001). Tassi significativamente più elevati di consumo di polline sono stati osservati quando l'imidacloprid è stato somministrato a 10 ppb nel solo integratore di polline(χ2 = 21,44, p<0,001) e significativamente diminuito quando è stato somministrato a 10 o 50 ppb nel supplemento di polline e nella soluzione di saccarosio insieme (10 ppb - p + s: χ2= 6,59, p = 0,010; 50 ppb - p + s: χ2=14,47, p=0,0001).

Le uova sono state raccolte dai CMC il giorno 7 dell'esperimento e i cambiamenti nel numero di uova che si schiudono con successo dopo l'esposizione materna ai trattamenti agrochimici sono stati valutati utilizzando un modello misto lineare generalizzato (GMLR) con una distribuzione binomiale e un'identità QMC trattati come un effetto casuale. L'esposizione materna all'imidacloprid somministrato a 10 ppb nel polline da solo o nella soluzione di polline e saccarosio non ha influenzato i tassi di schiusa delle uova (10 ppb - p+s: Z=-0,139, p=0,290; 10 ppb - p: Z=0,182, p=0,856). I tassi di schiusa non hanno potuto essere valutati per le uova deposte dalle regine in CMC fornite con una dieta allacciata con imidacloprid da 50 ppb a causa dei bassi tassi di produzione di uova in questo gruppo di trattamento.

Per questo lavoro, tutte le analisi statistiche sono state eseguite in R Studio 1.2.5003 (Boston, MA, USA). Le cifre sono state preparate utilizzando JMP Pro 15 e Photoshop CC 2019 (Adobe Inc., San Jose, CA). I dati sono disponibili nel file supplementare S1.

Figure 2
Figura 2. A: Media ± uova SE al giorno in CQMC. B: Supplemento medio di polline ± SE, C: soluzione di saccarosio, D: e acqua (g) consumata durante periodi di 48 ore in CQMC. Significato dei trattamenti (indicati da "*") determinati dal test post hoc GEE e Wald chi-square. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Somma media ± SE delle uova deposte mediante trattamento durante l'esperimento. Significatività (indicata da lettere) determinata dal test post hoc HSD ANOVA e Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella S1: Risultati dei GEE che analizzano i cambiamenti nei tassi di deposizione delle uova e il consumo di dieta nei QMC nel tempo. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

File supplementare S1: Fare clic qui per scaricare questo file supplementare.

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Discussion

La fecondità degli insetti solitari femminili e delle regine nelle colonie di insetti eusociali può essere influenzata da fattori di stress abiotici come i prodotti agrochimici25,28,29,30,33. Nelle api mellifere, gli effetti dei prodotti agrochimici sulle regine possono essere indiretti, in quanto possono verificarsi attraverso cambiamenti nella loro cura e alimentazione da parte delle api operaie. I nostri risultati rappresentativi, che sono simili a quelli riportati in uno studio sul campo29, dimostrano che gli effetti dei prodotti agrochimici sulle prestazioni della regina possono essere misurati in modo efficiente in un ambiente di laboratorio utilizzando CMC, generando risultati comparabili agli approcci basati sul campo. Inoltre, questi risultati fanno luce sull'influenza dell'imidacloprid sul consumo di dieta dei lavoratori e sulla vitalità delle uova.

L'imidacloprid ha avuto chiari effetti negativi sulla produzione di uova quando è stato somministrato in soluzione di saccarosio e integratore di polline insieme. Ciò è simile ai risultati riportati utilizzando alveari di osservazione forniti con sciroppo allacciato di imidacloprid e autorizzati a foraggiare liberamente29. Tuttavia, qui, è stata osservata una risposta dose-dipendente, con l'effetto più pronunciato osservato nei CMC forniti con 50 ppb di imidacloprid rispetto alla concentrazione inferiore. A differenza di quanto riportato per le colonie di campo, questo gruppo ha sperimentato una quasi cessazione della produzione di uova. Va notato che tutte le concentrazioni, inclusi i 50 ppb utilizzati in questo lavoro, sono superiori ai residui di polline e nettare tipicamente osservati quando l'imidacloprid viene applicato come trattamento delle sementi e sono più rappresentativi dei residui trovati a seguito di applicazioni alsuolo 40. Esempi di piante rilevanti includono cucurbitacee e ornamentali trovati nei paesaggi urbani29e, pertanto, questi risultati dovrebbero essere interpretati in questo contesto. Inoltre, le differenze osservate tra questi risultati e quelli generati utilizzando colonie di campo, dove i risultati non erano così pronunciati, anche nei gruppi di trattamento più alti, suggeriscono che, come altri saggi basati su laboratorio, i CMC possono essere più sensibili rispetto all'utilizzo di colonie a grandezza naturale52, che dovrebbero essere considerate quando si interpretano i dati.

Il lavoro precedentemente riportato che esamina l'ovodeposizione con l'esposizione ai regolatori di crescita degli insetti (IGR) nei QMC non ha rilevato che gli IGR causano riduzioni dei tassi di deposizione delle uova regine33, dimostrando che l'interruzione della produzione di uova non è una risposta uniforme allo stress. Sebbene le valutazioni a livello di campo che utilizzano colonie a grandezza naturale possano fornire una visione più olistica degli effetti dei prodotti agrochimici sulla salute delle colonie, questi risultati suggeriscono che i QMC hanno il potenziale per essere utilizzati come strumento per identificare sostanze chimiche come l'imidacloprid che possono influenzare l'ovodeposizione delle api da miele. Se utilizzati nel contesto di un'ampia strategia di valutazione del rischio che tiene conto dei modelli di utilizzo, dei modelli di esposizione e degli effetti su altre metriche della salute delle api da miele, i dati sulla produzione di uova generati dai QMC possono fornire una comprensione più completa dei potenziali effetti di un prodotto agrochimico sulle colonie di api mellifere.

Oltre a generare dati quantitativi di ovodeposizione, i QMC possono essere utilizzati per valutare i modelli nel consumo della dieta dei lavoratori e i cambiamenti nella fisiologia. Qui, è stato dimostrato che 10 ppb imidacloprid nella dieta del polline da solo stimola il consumo di integratori di polline nei lavoratori in presenza di una regina accoppiata. Questo effetto non è stato osservato in altri trattamenti dietetici quando i CMC sono stati forniti con imidacloprid sia nel supplemento di polline che nella soluzione di saccarosio, anche alla stessa concentrazione. Va notato che stime più precise del tasso di consumo possono essere ottenute monitorando la mortalità e regolando le misure del consumo di dieta in base al numero esatto di api rimanenti nei CQMC, ma se la mortalità è costantemente bassa tra i trattamenti, è possibile effettuare alcuni confronti. La discrepanza tra i trattamenti nel consumo di dieta pollinica contenente la stessa concentrazione di imidacloprid può essere correlata alla differenza nella dose totale più elevata somministrata alle api quando l'imidacloprid è presente sia nel saccarosio che nell'integratore di polline rispetto a quando è presente nel solo integratore di polline.

A bassi livelli, ci sono prove che le api da miele preferiscono fonti alimentari contenenti pesticidi neonicotinoidi18e sono state segnalate per mostrare una preferenza simile per le risorse floreali contenenti nicotina53. È stato suggerito che queste preferenze possano essere dovute alle proprietà neuro-stimolanti della nicotina e dei neonicotinoidi, che attivano i recettori nicotinici dell'acetilcolinesterasi54 espressi in parti del cervello delle api da miele coinvolte nell'apprendimento e nella memoria55. Negli acari di ragno, l'imidacloprid stimola il consumo di dieta, con conseguente aumento dell'ovodeposizione e della fecondità22. Qui, gli aumenti correlati all'imidacloprid nel consumo di integratori di polline non erano correlati ad aumenti di ovodeposizione e gli effetti dell'imidacloprid sulla fisiologia del lavoratore in questo lavoro rimangono da esplorare. Tuttavia, capire quanta parte di una dieta agrochimica le api allacciate all'interno di una colonia sono suscettibili di consumare, in particolare i lavoratori che richiedono più polline nella loro dieta per fornire attivamente una regina deponente56, può aiutare a informare il rischio di un agrochimico a vari aspetti delle prestazioni della colonia.

L'imidacloprid non ha causato alcun cambiamento misurabile nella vitalità dell'embrione, come misurato dai tassi di schiusa negli ovuli raccolti da CMC forniti con 10 ppb di imidacloprid nel solo integratore di polline o sia nel supplemento di polline che nella soluzione di saccarosio. Ciò differisce dalle diminuzioni dei tassi di schiusa delle uova riportate a seguito dell'esposizione IGR nei QMC33, dimostrando ancora una volta che i QMC possono essere utilizzati per esaminare aspetti specifici e diversi della fecondità regina. L'imidacloprid è altamente solubile in acqua ed è probabilmente metabolizzato ed escreto dalle api in modo diverso rispetto a più prodotti agrochiosolubili liposolubili come IGR57, che possono essere eliminati transovarialmente58,59,60,61 in una certa misura, con conseguenti effetti sullo sviluppo embrionale. In alternativa, l'imidacloprid, che è una neurotossina36, non può influenzare gli embrioni in via di sviluppo allo stesso modo delle IGR, che mirano ai percorsi associati allo sviluppo degli insetti62.

Una domanda comunemente posta dai ricercatori che cercano di comprendere gli effetti dei prodotti agrochimici sulla riproduzione delle api da miele è se le regine adulte, che si affidano ai lavoratori per fornirle secrezioni ghiandolari come cibo9,63,sono direttamente esposte ai residui agrochimici. Questo non è stato esplorato e non è rappresentato nei risultati riportati qui. Tuttavia, i residui agrochimici nelle secrezioni ghiandolari dei lavoratori sono in genere notevolmente ridotti rispetto a ciò che i lavoratori sono forniti negli scenari di alimentazione controllata delle colonie64. Allo stesso modo, quando le colonie a grandezza naturale sono state esposte a concentrazioni di imidacloprid che hanno comportato una diminuzione dell'ovodeposizione, non sono stati rilevati residui nelle regine29, suggerendo che i cambiamenti nei tassi di ovodeposizione osservati nel lavoro di riferimento erano dovuti all'esposizione diretta a tracce che erano prontamente escrete, o che gli effetti osservati sulle regine erano dovuti agli effetti dell'imidacloprid sui lavoratori responsabili della cura e dell'approvvigionamento della regina. Il metodo qui presentato consente il campionamento delle api operaie note per aver ingerito la dieta trattata dall'eclosione adulta al momento del campionamento. Il lavoro di follow-up che esamina gli effetti dell'imidacloprid sulla fisiologia delle api operaie campionate dall'esperimento descritto aiuterà a chiarire questa domanda.

In sintesi, i metodi qui presentati consentiranno ai ricercatori di valutare meglio il rischio di prodotti agrochimici per le api mellifere valutando gli endpoint relativi alla fecondità, alla sopravvivenza e allo sviluppo delle api mellifere. La tecnica descritta ha il potenziale per migliorare notevolmente la valutazione del rischio agrochimico generando dati quantitativi relativi alla fecondità regina che possono essere difficili e ad alta intensità di risorse da acquisire utilizzando esperimenti sul campo e semi-campo. Inoltre, la presenza di una regina deposta aggiunge realismo agli esperimenti eseguiti su giovani lavoratori, che sono in genere i membri della colonia responsabili della cura e dell'alimentazione della regina9. Utilizzando questa tecnica, i rischi dei prodotti agrochimici sulla salute, la longevità e le prestazioni delle colonie di api da miele possono essere meglio previsti e mitigati.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Grazie alla dottoressa Amy Cash-Ahmed, a Nathanael J. Beach e ad Alison L. Sankey per la loro assistenza nello svolgimento di questo lavoro. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha il solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni o approvazioni da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro. Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione della Defense Advanced Research Projects Agency # HR0011-16-2-0019 a Gene E. Robinson e Huimin Zhao, dal progetto USDA 2030-21000-001-00-D e dall'esperienza di ricerca sulla plasticità fenotipica per studenti universitari della comunità presso l'Università dell'Illinois a Urbana Champaign.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluon BioQuip, Rancho Dominguez, CA 2871A
Honey bee queens Olivarez Honey Bees, Orland, CA
Imidacloprid Sigma-Aldritch, St. Louis, MO 37894
MegaBee Powder MegaBee, San Dieago, CA
Microcentrifuge tubes 2 mL ThermoFisher Scientific, Waltham, MA 02-682-004
Needles 20 gauge W. W. Grainger, Lake Forest, IL 5FVK4
Potassium Sulfate Sigma-Aldritch, St. Louis, MO P0772
Queen Monitoring Cages University of Illinois Urbana-Champaign Patent application number: 20190350175
Sucrose Sigma-Aldritch, St. Louis, MO S8501
Universal Microplate Lids ThermoFisher Scientific, Waltham, MA 5500

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Biologia Numero 169
Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate
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Fine, J. D., Torres, K. M., Martin,… More

Fine, J. D., Torres, K. M., Martin, J., Robinson, G. E. Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens. J. Vis. Exp. (169), e62316, doi:10.3791/62316 (2021).

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