Summary
このプロトコルは、ミツバチの女王とその労働者の世話人を制御された実験室で農薬に暴露し、関連する応答を注意深く監視する方法を確立することによって、農薬がミツバチ(Apis mellifera)の再生にどのような影響を与えるかの理解を深めるために開発されました。
Abstract
ミツバチの現在のリスク評価戦略は、成人または未熟な労働者ミツバチに対して行われた実験室試験に大きく依存していますが、これらの方法はミツバチの女王に対する農薬暴露の影響を正確に捉えていない可能性があります。ミツバチのコロニー内の受精卵の唯一の生産者として、女王は間違いなく機能するコロニーユニットの最も重要な単一のメンバーです。したがって、農薬が女王の健康と生産性にどのような影響を与えるかを理解することは、農薬リスク評価の重要な側面と考えるべきである。ここでは、ミツバチの女王と労働者の女王アテンダントを労働者の食事を通じて投与される農薬ストレッサーに暴露し、続いて実験室での卵の生産を追跡し、クイーンモニタリングケージと呼ばれる特殊なケージを使用して最初のインスターエクロセオンを評価するための適応方法が提示されます。この方法の意図した使用を説明するために、労働者女王アテンダントがイミダクロプリドの致死量を含む食事を与えられ、女王への影響を監視した実験の結果が説明される。
Introduction
農業製品に対する世界的な需要の増加のために、現代の農業慣行は、多くの場合、作物の収量を減らすか、害を与えることが知られている多数の害虫を制御するために農薬の使用を必要とします1.同時に、多くの果物、野菜、ナッツ作物の生産者は、豊富な作物収量を確保するために、商業ミツバチのコロニーによって提供される受粉サービスに依存しています2.これらの慣行は、ミツバチ(Apis mellifera)を含む受粉者が有害なレベルの残留農薬3にさらされる可能性があります。同時に、ミツバチのコロニーにおける寄生バロアデストラクタダニの侵入の広範な存在は、しばしば養蜂家がミチサイドでじんましんを治療することを必要とし、コロニー4、5、6の健康と長寿にも悪影響を及ぼす可能性がある。農薬製品の有害な影響を軽減し、軽減するためには、その実施前にミツバチの安全性を十分に評価して、有益な昆虫を保護するための推奨を行う必要があります。
現在、環境保護庁(EPA)は、ミツバチの農薬暴露に対する段階的なリスク評価戦略に依存しており、これは成虫ミツバチと時にはミツバチの幼虫7に対する実験室試験を伴う。低層のラボテストで毒性の問題を緩和できない場合は、より高い層フィールドとセミフィールドテストが推奨される場合があります。これらの実験室試験は、農薬が労働者の長寿に及ぼす潜在的な影響に関する貴重な洞察を提供するが、彼らは必ずしも生物学的に8と行動的に9の労働者とは大きく異なる女王への影響を予測する必要はない。さらに、農薬が死亡率を超えた昆虫に及ぼす影響は数多くあり、コロニーユニット10,11として機能する協調行動に依存する社会的昆虫にかなりの影響を及ぼす可能性がある。
死亡率は農薬農薬12の最も一般的な効果と考えられているが、これらの製品は、変化した行動13、14、15、16、忌避性または誘致性17、18、19、摂食パターンの変化を含む標的と非標的節足動物の両方に幅広い影響を及ぼす可能性がある20、21、22 、および増加または減少したfecundity20、21、22、23、24、25。社会的昆虫の場合、これらの効果は、コロニー相互作用および機能11を全身的に破壊する可能性がある。これらの機能のうち、コロニーユニット9の残りの部分で支えられている単一の産卵クイーンに大きく依存している再生は、農薬暴露による摂動に対して特に脆弱である可能性がある。
未熟な女王に対して行われた研究は、殺虫剤への発達暴露が成人の女王の行動、生理学、生存26、27に影響を与えることを実証した。同様に、完全または縮小された大きさのコロニーを使用した研究は、農薬が交配の成功を減少させることによって成体ミツバチの女王に影響を与えることができることを実証しました28,卵位を減少させます29, そして、25,30,31を生産した卵の生存率を減少させます.これらの現象は、主に利用可能な実験室の方法の欠如のために、コロニー全体を使用せずに観察することは以前は困難でした。しかしながら、クイーンモニタリングケージ(QMC)32を用いて厳しく管理された実験室条件下での女王の卵位位置を研究する方法は、最近、アグロケミカルが女王の胎児性33に及ぼす影響を調べるために適応されている。ここでは、これらの技術について、QMCにおける労働者の食事消費量を測定および追跡するための追加の方法と共に詳細に説明する。
これらの方法は、通常コロニー34の中に存在する数万人に対して、農薬の正確な用量を大幅に減少させるため、フルサイズのコロニーを必要とする実験よりも有利であり、その後、女王を提供する。この暴露技術は、コロニー内で女王が自分自身を養い、労働者にダイエット9を提供することに頼るので、クイーンズが現実世界のシナリオで経験する中古暴露を反映しています。同様に、女王は一般的に交配便35のためのコロニー再生(群れ)の間を除いてハイブを離れないでください。交尾ミツバチの女王は、商業女王ブリーダーから購入し、一晩出荷することができます。通常、女王ブリーダーは、彼らが成功した交配の兆候として取られる卵を産み始めたことを確認した直後に女王を販売しています。クイーンの年齢や関連性に関するより正確な情報が必要な場合は、研究者は注文を出す前に女王ブリーダーに相談することができます。
QMCはミツバチの女王のオビポジションと卵の孵化率32、33の正確な観察と定量化を可能にし、農薬暴露が女王の胎児性に及ぼす影響に関連する貴重なデータを生み出す。ここで提示される代表的な結果は、全身性神経毒性剤ネオニコチノイド農薬イミダクロプリド36の分野関連濃度への慢性曝露下におけるQMCにおける排卵、食事消費、および胚生存率を定量する実験について説明する。一度適用されると、イミダクロプリドは植物組織37に移設し、かつ残基が多数の生花粉植物38、39、40の花粉および蜜を検出された。イミダクロプリドへの暴露は、採餌性能16の障害、免疫機能41の障害、およびコロニー拡張および生存率の低下率42、43を含むミツバチに対する有害な影響の広い範囲を有することができる。ここでは、イミダクロプリドは、フィールド実験がミツバチの女王のオビ位置に影響を与えることができることを示しているので、試験物質として使用するために選択されました29
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Protocol
1. QMCアセンブリ
- 図1Bに示すように、単一の産卵板(ELP)を挿入して部品(図1A)からQMCを組み立てます。作業者がケージに追加されるまでフィーダーチューブを追加しないでください。ラボグレードのテープで4つのフィーダー穴を一時的にカバーします。
- 女王の除外器と給餌室のドアを給餌室の上に挿入して、女王が給餌室に入り、治療された食事に接触するのを防ぐ。詳細は、Fine et al.32 を参照してください。
- 成人のエローションの24時間前にミツバチのコロニーからキャップされた作業員のブロードを含むワックスコームフレームを収集し、ブロードボックス内のインキュベーター(34.5°C)に入れます。24時間後、閉じたミツバチをフレームから磨き、昆虫バリア塗料(Fluonなど)が並んでいる開いた容器に入れ、ミツバチが這い出るのを防ぎます。
- 各QMCの産卵室に少なくとも50個のミツバチ(5g≈50個のミツバチ44、45)を加えます。実験で多様な遺伝的プールが表現されるようにするには、少なくとも3つのコロニーからほぼ同数の労働者ミツバチを取得し、それらをQMCに追加する前にそれらを混合する。
注:1日未満の新しく閉鎖された労働者のミツバチは、未発達の飛行筋肉と硬化していないキューティクルのために飛んだり刺したりすることはできません。この年齢で追加された場合、取り扱い前に麻酔をする必要はありません。小さな1/4カップの体積測定カップを使用して容器からミツバチを優しくすくい取り、スケールでタールされた第2の容器(例えば、昆虫バリア塗料が並ぶ)に入れることで計量することができます。キャップ付きブロードで覆われたフレームの面積は、ソースコロニーがQMC労働者集団で均等に表現されるように、ほぼ等しくする必要があります。作業者ミツバチの均質化は、すべてのコロニーから採取したフレームから新たに閉じたミツバチを同じ容器にブラッシングし、それらをQMCsに追加する前に5分間混合できるようにすることで達成できる。 - スクロース溶液、水、花粉サプリメントを含むフィーダーを追加します( セクション2を参照)。
- 産卵46を刺激し、QMCへの移動を容易にするためにCO2ガスに個々の交尾された女王を公開します。
- 領収書から48時間以内に商業ブリーダーから購入した女王を使用してください。女王がまだ出荷ケージの中にいる間、透明なビニール袋に入れます。袋の中にCO2 ガスカニスターに接続されたプラスチックチューブの一端を置き、CO2 ガスが流れるようにカニスターバルブを静かに開きます。
- 袋がガスで膨らんだら、同時にカニスターバルブを閉じ、袋を閉じてガスを内部にトラップします。バッグは30sまたは女王が動かなくなったまで閉じておきます。女王を取り除き、彼女が意識不明であることが観察されたら、出荷ケージを開きます。
- 部分的に産卵室へのドアを開け、無意識の女王を中にそっと置き、蓋を閉め、中の女王や労働者を押しつぶさないように注意します。 図1Cに示すように、2つ目の産卵プレートを各QMCに追加します。2 つの EMP の上部にラボ用テープを置いて、QMC フレームから分離しないようにし、作業員がケージから出ないようにします。
- ケージを、通常のコロニー内の条件のように、34±0.5°C、60%の相対湿度±の安定した環境条件で暗いインキュベーターに入れます。
図 1.A: 逆アセンブルされた QMC。 B: 1 ELPを挿入したQMCを部分的に組み立てました。 C: 2つのElpsを使用してQMCを完全に組み立てました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. 農薬で覆われた食事療法の準備と管理
- 50%(g/g)のスクロース溶液の1000 gを調製するには、クリーンな1Lガラス試薬ボトルの底部に攪拌棒を置きます。500gのスクロースと500mLの脱イオン水を加えます。ボトルの蓋を緩め、すべてのスクロースが溶解するまで溶液を混合するために弱火に設定された加熱攪拌プレートを使用します。農薬ストック溶液を添加する前に、溶液を室温まで冷却してください。
- アセトンなどの適切な溶媒に農薬のストック溶液を、目的の農薬の所望の最終濃度を達成するために食事に加えることができる濃度で調製します。
注:アセトンを車両溶剤として使用する場合、経済協力開発機構(OECD)ガイドラインは、成人ミツバチ47の慢性経口毒性試験では、食事中のアセトンの最終濃度を≤5%にしなければならないと規定しています。しかし、n-メチル-2-ピロリドン5、31、ジメチルスルホキシド25などの一部の溶媒は、この濃度以下の毒性作用を発揮することができるので、治療食において溶媒濃度をできるだけ低く抑えることを推奨します。使用する溶媒の量や種類によっては、溶媒毒性による潜在的な影響が検出されることを確実にするために、溶媒制御群と負の対照群の両方を含める必要がある場合があります。製剤化された製品を使用する場合、使用される製品の量は、製剤中に存在する濃度に基づいて調整されなければならない。溶媒に関心のある農薬の安定性に応じて、ストック溶液は-20°Cで最大2週間保持することができます。 - OECD試験245の結果に基づいて致死性の低い用量を選択する:ハニービー(Apis mellifera L.)、慢性経口毒性試験(10日間給餌)47、およびEcotoxナレッジベース48を問い合わせて関連文献を同定する。
- スクロース溶液、市販花粉サプリメント(粉末として利用可能な場合)、またはその両方で農薬処理を投与する。冷却/室温50%スクロース溶液(w/w)に適切な量のストック溶液を添加して、同じ日に使用するための実験食を準備します。渦を巻くか、中速にセットした攪拌バーで十分に混ぜます。花粉のサプリメントの, 農薬レーススクロース溶液をメーカーのプロトコルに従ってシロップの代わりに粉末サプリメントに追加, 花粉ダイエットの最終的な重量に応じて使用されるストック液の量を調整することを確認します.計算例については 、表 1 を参照してください。
- 2 mLマイクロ遠心チューブからフィーダーチューブを準備します。
- 流動ダイエットフィーダーの場合は、ホットプレート/コンロで20ゲージの針の先端を加熱し、チューブの底部を2回穿刺します。チューブ蓋とピペットを約1.5mLのスクロース溶液または水を穿刺穴の1つを通して閉じます。QMCに追加されるまで、穿刺された側でチューブを下に置きます。
- 花粉サプリメントフィーダーの場合は、カミソリの刃を使用してチューブの底部をスライスします。蓋を閉じ、蓋に触れるまで花粉サプリメント1-2gボールをチューブに押し込みます。
- QMC に配置する前にフィーダーの重みを記録します。48時間以上、未使用の食事を4°Cに保ちないでください。
| 所望の集中 | 望ましい溶媒の車の集中 | スクロース溶液の最終容積/質量 | ストックソリューションのVoume | イミダクロプリド(ストック溶液) | 推奨されるストックソリューションのレシピ | |
| スクロース溶液 | 10 ppb (w/w) | 0.05% (v/v) | 81.45 mL/100 g* | 40.7 μL | 0.001 mg/40.7 μL | 0.02 mg/814 μL |
| 花粉サプリメント | 10 ppb (w/w) | 10 g** | 4.07 μL | 0.0001 mg/4.07 μL | 0.02 mg/814 μL | |
| スクロース溶液 | 50 ppb (w/w) | 0.05% (v/v) | 78.5 mL/100 g* | 40.7 μL | 0.005 mg/40.7 μL | 0.1 mg/814 μL |
| 花粉サプリメント | 50 ppb (w/w) | 10 g** | 4.07 μL | 0.0005 mg/4.07 μL | 0.1 mg/814 μL |
表1:処理されたスクロース溶液、花粉サプリメント、およびストック溶液のレシピ例。 *50%(w/w)スクロース溶液(1.228 g/mL)の密度に基づく体積。**花粉サプリメントの密度は、使用される製品によって異なりますが、この溶媒量を使用する場合、花粉サプリメントの最終溶媒濃度は、≤5体積の範囲内になります。
3. モニタリング - 卵生産率
- 月産の月を朝と夕方に1日1~2回量ります。まず、卵子を確認するために、インキュベーターからQMCを取り外すことから始めます。
注:成功した実験では、卵の生産は最初のケージアセンブリの3日以内にコントロールQMCのほとんどで開始されます。10分以内にチェックして供給できるQMCsを一度にインキュベーターから取り出すだけです。インキュベーターの外でより長い期間は、卵の生産を中断する可能性があります。 - 卵のクリアなElpsの背面を調べます。卵が存在する場合は、目的のプレートの前にあるドアパネルを取り外します。ELPsの向こう側からテープを取り出し、ELPとQMC内のミツバチとの間でドアパネルを慎重にスライドさせ、ELP内の細胞を洗浄している可能性のあるミツバチを粉砕しないように注意してください。
- ドアパネルを設置して、ELPを取り外し、ELP細胞内の卵の数をカウントして記録します。ELPの端をタップして卵を取り除き、開いたセル側を下に、硬い表面(廃棄物容器の唇など)に置きます。卵が脱落したら、QMCの空のELPを交換してください。QMCの外側にあるELPの後ろのドアパネルをそっと取り外して取り付けます。必要に応じて 2 番目の ELP を繰り返し、終了したら QMC 全体でテープを交換します。
注:卵の生産は一般的に減少し、2週間32、33後にQMCで死亡率が増加し、14日後に実験を終えることを推奨します。
4. モニタリング - 食品消費
- QMCフィーダーに残っているすべての食品を、2日ごとに作りたての食事に置き換えます。新しいフィーダーチューブ(水を含む)を準備し、それらを計量してから、モニタリングのためにインキュベーターからQMCを取り外します。新しいものとすべての古いチューブを交換し、未使用の食事を処分する前に古いチューブを計量します。ダイエット消費量を見積もるためにQMCに入れる前に、フィーダーチューブと未消費の食事の最終的な重量を同じフィーダーチューブの重量と比較してください。
- フィーダーの交換が予定されている日の間に、1日1回(QMCが卵の生産を監視する場合と同時に)ダイエットの消費量をチェックして、フィーダーが空にならないようにします。フィーダーチューブが空または空の近くにある場合は、それを取り外し、補充し、チューブの重量を前後に記録し、QMCの2日間の食事消費量合計に差を加えます。
5. モニタリング - 胚の生存率
- QMC実験中に選択したポイントで、 ステップ3に従ってQMCから産たばかりの卵を含むELPを取り除きますが、ELPから卵を取り除かないでください。
- ユニバーサルマイクロプレートの蓋でELPを覆い、飽和K2SO 4溶液(150 g K2SO4水の1Lで、浅い皿に入れておきます)でデシケーターの中に置きます。
注:いくつかの塩は、混合物がインキュベーターで温度に来た後、皿の底に見える必要があります。 - デシケーターをインキュベーターに34.5°Cに設定し、コリンズ49で使用される条件と同様に、デシケータ内部の相対湿度95%を生じる。
注:ほぼすべての卵は、49を産んだ後72±6時間以内に孵化するため、ElpsがQMCから取り除かれた78時間後に孵化率を早くも評価することができます。細胞の底部にある「C」形の幼虫は、ハッチングイベントが成功したことを示しています。たとえば、卵がドローンであり、労働者50ではなく、このタイミングのいくつかの変動が可能です。
6. ワーカー サンプリング
- QMCに過剰な作業者が装着されている場合は、治療の評価のために、選択した時点で、選択した時点で作業者のミツバチをサンプリングし、その生理学の変化を誘発します。毎日の摂食および卵の計数活動と組み合わせて収集を行い、QMCがインキュベーターの外にある時間を最小限に抑えます。
- サンプリングする前に、ELP と QMC の内部の間にドア パネルを配置し、ELP を取り外します。慎重にケージのベースから約0.5cmのドアパネルを持ち上げ、フェザー級ピンセットを使用してQMCの内部から作業用のビーを取り外します。ミツバチが逃げるのを防ぐために、0.5cmの開口部の部分を手袋をした指または綿で必要に応じて覆います。
- 収集したビーをフォローアップ分析のために保存し、所望の数のサンプルが収集されるまでこのプロセスを繰り返します。遺伝子発現解析では、液体窒素中の凍結ミツバチをスナップし、−80°Cで即時保存することが強く推奨される51.
7. 労働者死亡率
- 授乳室と産卵室の底にある死んだミツバチの数を数えることによって、実験中の労働者の死亡率を評価する。毎日の産卵定量と組み合わせてこの評価を行います。
- 鉗子を使用して、慎重に鉗子が挿入されていない間手袋の指または綿の部分で穴をカバーし、フィーダー穴を通して死んだミツバチを取り除きます。
- ケージの基部から約0.5cmのドアパネルを慎重に持ち上げ、鉗子を挿入して、産卵室から死んだミツバチを取り除きます。ミツバチが逃げるのを防ぐために、0.5cmの開口部の部分を手袋をした指または綿で必要に応じて覆います。
- 残りのミツバチを安楽死させる前に、前述の方法を使用して、QMCからすべての死んだミツバチを取り除いて数えることによって、実験の終わりに労働者の死亡率を評価する。
注:労働者のミツバチがいない場合、女王は卵を生産せず、24時間以内に飢えます。したがって、QMC 内のすべての作業者が死亡することが観察された場合、QMC を実験から削除する必要があります。同様に、実験中に女王が死亡した場合、QMCを削除し、データを適切に検閲する必要があります。
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Representative Results
卵の生産は、卵の生産と治療群あたり15ケージの1日1回の観測で、上記のように組み立てられ、維持されたQMCで監視されました。主にカルニオラン株の新婚女王は、女王ブリーダーから一晩購入し、出荷され、ミツバチの労働者は、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の蜂研究施設で標準的な商業方法に従って維持された3つのコロニーから得られました。ここでは、 4つの食事療法群が使用された:1)50 ppb(g/g)スクロース溶液および花粉サプリメント中のイミダクロプリド(50 ppb - p+s)、2)10 ppbイミダクロプリドスとショ糖溶液および 花粉サプリメント(10 ppb -p+s)、3)10 ppbイミダクロプリド単独で花粉サプリメント(10 ppb -p)、および4)治療群として同等量のアセトンを含む食事を与えられた対照群(CTRL)。
毎日の卵数の治療関連の変化は、微小な改変を伴うFine et32 に記載されているように評価された。簡単に言えば、自己回帰(AR-1)相関行列構造を有するポアソン対数線形GEEが、時間の経過とともに卵の生産における治療関連の変化を評価するために実施された。ここで、時間(日)は連続変数として扱われ、治療はカテゴリー的であった。ウォルドカイ二乗後ホックテストは、有意性を決定するために使用されました。実験の1日目には産卵が認められなかったため、この日は、GEEの仮定に従って分析から除外された。この分析の結果を 表 S1に示します。毎日の卵の生産は、50 ppb p+s治療群のQMCで有意に低かった(χ2=43.99、p<0.001; 図 2A)。
治療によるQMCで生産される卵の総数の差を、一方向のANOVAとTukey HSD後の一時テストを用いて分析した(図3)。この分析では、クイーンまたは労働者の死亡による14日間のモニタリング期間の終了前に実験から削除されたQMCは除外され、その結果、CTRLおよび50 ppb - p+sグループのN=13、10 ppb - pの場合はN=14、10 ppb - p+sの場合はN=15になります。スクロースと花粉の両方で投与された治療に対して用量依存効果が観察され、50 ppb - p+sで観察された対照に対する卵産生の最大の減少と10 ppb - p+sが続いた。CTRLと10 ppb - p(F3、52=17.95、p<0.001、トゥキーHSD)の間で産生された総卵の差は認められなかった。
花粉サプリメント及び水の消費量は、10日間48時間毎に記録され、スクロース溶液の消費量は12日間48時間毎に記録した。ダイエット消費率の変化は、上述と同じパラメータを持つガウス分布GEを用いて評価した(図2B-D)。結果は、表 S1に要約されています。簡単に言えば、実験が進むにつれてスクロースの消費の毎日の割合が大幅に増加しました (χ2=6.03, p=0.014), 花粉サプリメントの消費率は減少しました (χ2=174.98, p<0.001).イミダクロプリドを花粉サプリメント単独で10 ppbで投与した場合に有意に高い花粉消費率が観察され(χ2=21.44、p<0.001)、花粉サプリメントとスクロース溶液で10または50 ppbで一緒に投与された場合(10 ppb - p+s:χ 2-59、p=000; χ2=14.47、p=0.0001)。
実験の7日目にQMCから卵を採取し、母親が農薬治療にさらされた後に正常に孵化する卵の数の変化を、二項分布とQMC同一性をランダム効果として扱った一般化された線形混合モデル(GMLR)を用いて評価した。花粉単独または花粉およびスクロース溶液で10 ppbで投与されたイミダクロプリドへの母親の暴露は、卵の孵化率に影響を与えなかった(10 ppb - p+s:Z=-0.139、p=0.290;10 ppb - p:Z=0.182、p=0.856)。この治療群の卵生産率が低いため、50 ppbイミダクロプリドレースドダイエットでプロビジョニングされたQMCの女王によって産まれた卵の孵化率を評価できませんでした。
この作業では、すべての統計分析を R Studio 1.2.5003 (米国マサチューセッツ州ボストン) で行いました。フィギュアは、JMP Pro 15とフォトショップCC 2019(アドビ社、サンノゼ、カリフォルニア州)を使用して作成されました。データは 、補足ファイル S1で使用できます。
図 2.A: QMCの1日あたりの平均±SE卵 B: 平均±SE花粉サプリメント, C: ショ糖溶液, D: 水 (g) QMC の 48 時間の期間に消費. 治療の意義 ("*" によって示される) GEE とウォルド カイ二乗ポストホックによって決定されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 実験中の治療によって産卵された卵の平均±SE合計ANOVA と Tukey HSD ポスト ホック テストによって決定される有意性 (文字で示されます)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表S1:QMCにおける産卵率と食事消費量の経時変化を分析したGEの結果このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイルS1:この補足ファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
女性の孤独な昆虫の女性だけでなく、ユー社会的な昆虫のコロニーの女王は、そのような農薬25、28、29、30、33などの非生物的ストレッサーの影響を受けることができます。ミツバチでは、農薬が女王に及ぼす影響は、介護の変化や労働者ミツバチによる授乳によって起こり得るため、間接的である可能性があります。我々の代表的な結果は、フィールドベースの研究29で報告されたものと同様であり、QMCを用いた実験室環境において農薬がクイーン性能に及ぼす影響を効率的に測定し、フィールドベースのアプローチと同等の結果を生み出すことを実証している。さらに、これらの結果は、イミダクロプリドが労働者の食事消費に及ぼす影響と卵の生存率に光を当てた。
イミダクロプリドは、一緒にスクロース溶液と花粉サプリメントで投与されたとき、卵の生産に明確な負の影響を持っていました.これは、イミダクロプリドレースシロップでプロビジョニングされ、自由に飼育することが許可された観察用のじんましんを使用して報告された結果に似ています29.しかし、ここで、用量依存性応答が観察され、QMCで最も顕著な効果が低濃度に対して50ppbイミダクロプリドで規定された。フィールドコロニーについて報告されたものとは異なり、このグループは卵生産のほぼ停止を経験しました。なお、この研究で使用される50ppbを含むすべての濃度は、イミダクロプリドが種子処理として適用される場合に通常観察される花粉および蜜残基よりも高く、土壌用途40に続いて見られる残基をより代表している。関連する植物の例には、都市景観29に見られるキュビピットと観賞用が含まれるため、これらの結果はこの文脈で解釈されるべきである。さらに、これらの結果と、最も高い治療群であっても顕著ではなかったフィールドコロニーを用いて生成されたものとの間に観察された違いは、他の実験室ベースのアッセイと同様に、QMCがデータを解釈する際に考慮すべきフルサイズのコロニー52を使用するよりも敏感である可能性があることを示唆している。
QMCにおける昆虫成長調節因子(IGR)への曝露による卵位を調べる以前の報告では、IGRがクイーン産卵率33の低下を引き起こすことは見つからなかったが、卵生産の中断は均一なストレス応答ではないことを示した。フルサイズのコロニーを用いたフィールドレベル評価は、コロニーの健康に対する農薬の影響をより全体的に把握できるかもしれないが、これらの知見は、QMCがミツバチの女王の卵位に影響を与える可能性のあるイミダクロプリドのような化学物質を同定するためのツールとして使用される可能性があることを示唆している。使用パターン、暴露パターン、ミツバチの健康の他の指標への影響を考慮した広範なリスク評価戦略の文脈で使用すると、QMCによって生成された卵生産データは、ミツバチのコロニーに対する農薬の潜在的な影響をより包括的に理解する可能性があります。
QMCは、定量的な排卵データを生成することに加えて、労働者の食事消費のパターンと生理学の変化を評価するために使用することができます。ここでは、花粉ダイエットだけで10 ppbイミダクロプリドが交配された女王の存在下で労働者の花粉サプリメント消費を刺激することが示された。この効果は、QMCが同じ濃度であっても、花粉サプリメントとスクロース溶液の両方でイミダクロプリドで提供されたとき、他の食事療法では観察されなかった。なお、QMCに残っているミツバチの正確な数に基づいて、死亡率を追跡し、食事消費の尺度を調整することで、消費率のより正確な推定値を得ることができるが、治療全体で死亡率が一貫して低い場合は、いくつかの比較が可能である。イミダクロプリドの同じ濃度を含む花粉食の消費における治療間の不一致は、それが花粉サプリメント単独で存在する場合と比較して、スクロースと花粉サプリメントの両方にイミダクロプリドが存在する場合にミツバチに投与される高い総用量の差に関連している可能性があります。
低レベルでは、ミツバチがネオニコチノイド農薬18を含む食料源を好むという証拠があり、ニコチン53を含む花資源に対して同様の好みを示すことが報告されている。これらの好みはニコチンおよびネオニコチノイドの神経刺激性に起因し得ることを示唆されているが、これは、学習および記憶55に関与するミツバチの脳の一部に発現するニコチン性アセチルコリンエステラーゼ受容体54を活性化する。クモのミテでは、イミダクロプリドは食事消費を刺激し、その結果、排卵量および胎児性22が増加する。ここで, 花粉サプリメントのイミダクロプリド関連の増加は、卵位の増加に関連していなかった, この作業における労働者生理学に対するイミダクロプリドの効果は、検討される予定.しかし、コロニー内の農薬レースのミツバチの消費量、特に敷設クイーン56を積極的に提供するために食事に花粉を増やす必要がある労働者を理解することは、コロニー性能の様々な側面に農薬のリスクを知らせるのに役立ちます。
イミダクロプリドは、花粉サプリメント単独または花粉サプリメントとスクロース溶液の両方で10 ppbイミダクロプリドでプロビジョニングされたQMCから採取された卵の孵化率によって測定されるように、胚生存率の測定可能な変化を引き起こさなかった。これは、QMC33のIGR暴露後に報告された卵孵化率の低下とは異なり、QMCが女王の胎児性の特定および多様な側面を調べるために使用できることを再び実証する。イミダクロプリドは水溶性が高く、IIG57のようなより脂溶性農薬とは異なる方法で代謝され、排泄される可能性が高く、これは58、59、60、61をある程度除去し、胚の発達に影響を及ぼす可能性がある。あるいは、神経毒36であるイミダクロプリドは、IDRと同様に胚の発達に影響を及ぼさない可能性があり、これは昆虫の発達62に関連する経路を標的とする。
ミツバチの生殖に対する農薬の影響を理解しようとする研究者が一般的に尋ねた1つの質問は、食物9、63として腺分泌物で彼女を提供するために労働者に頼っている成人の女王が農薬残留物に直接さらされているかどうかである。これは調査されておらず、ここで報告された結果には表示されません。しかし、作業者の腺分泌物中の農薬残渣は、通常、制御されたコロニー給餌シナリオ64において作業者がプロビジョニングされるものに比べて大幅に減少する。同様に、フルサイズのコロニーがイミダクロプリドの濃度にさらされ、オビジショクの減少をもたらした場合、クイーンズ29では残留物は検出されず、参照された作業で観察された卵位率の変化は、容易に排泄された微量への直接暴露によるものであったか、または女王に観察された影響がイミダクロプリドの影響によるものであったことが示唆された。ここで提示される方法は、成人の分化からサンプリングの時間まで治療された食事を摂取した既知の労働者ミツバチのサンプリングを可能にする。イミダクロプリドが説明した実験から採取した作業者ミツバチの生理学に及ぼす影響を調べるフォローアップ作業は、この質問を解明するのに役立ちます。
要約すると、ここで提示される方法は、ミツバチの胎児性、生存、および発達に関連するエンドポイントを評価することによって、ミツバチに対する農薬のリスクをよりよく評価することを可能にする。この技術は、フィールドおよびセミフィールド実験を用いて取得するのが困難で資源集約的な女王の胎児性に関する定量的データを生成することによって、農薬リスク評価を大幅に強化する可能性を有する。さらに、敷設女王の存在は、通常、女王9のケアと給餌を担当する植民地のメンバーである若い労働者に行われた実験にリアリズムを追加します。この技術を使用すると、ミツバチコロニーの健康、寿命、および性能に対する農薬のリスクをより良く予測し、軽減することができます。
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Disclosures
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
エイミー・キャッシュ・アーメド博士,ナサナエル・J・ビーチ,アリソン・L・サンキー博士の支援に感謝します。本書に記載されている商号または商用製品の言及は、特定の情報を提供する目的のみを目的としており、米国農務省の推薦または承認を意味するものではありません。USDAは機会均等プロバイダーと雇用主です。この研究は、国防高等研究プロジェクト庁#HR0011-16-2-0019からジーン・E・ロビンソンとハイミン・ジャオ、USDAプロジェクト2030-21000-001-00-D、イリノイ大学アーバナ・シャンパインのコミュニティ・カレッジ・学生のための平眼性可塑性研究経験によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluon | BioQuip, Rancho Dominguez, CA | 2871A | |
| Honey bee queens | Olivarez Honey Bees, Orland, CA | ||
| Imidacloprid | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | 37894 | |
| MegaBee Powder | MegaBee, San Dieago, CA | ||
| Microcentrifuge tubes 2 mL | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | 02-682-004 | |
| Needles 20 gauge | W. W. Grainger, Lake Forest, IL | 5FVK4 | |
| Potassium Sulfate | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | P0772 | |
| Queen Monitoring Cages | University of Illinois Urbana-Champaign | Patent application number: 20190350175 | |
| Sucrose | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | S8501 | |
| Universal Microplate Lids | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | 5500 |
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