Summary
이 프로토콜은 농약이 꿀벌(아피스 멜라이프라)재생에 미치는 이해를 향상시키기 위해 개발되었으며, 꿀벌 여왕과 그 노동자 관리인을 통제 된 실험실 환경에서 농약에 노출시키는 방법을 확립하고 관련 반응을 주의 깊게 모니터링합니다.
Abstract
꿀벌에 대한 현재 위험 평가 전략은 성인 또는 미숙한 작업자 꿀벌에 수행 실험실 테스트에 크게 의존하지만, 이러한 방법은 정확하게 꿀벌 여왕에 농약 노출의 효과를 캡처하지 않을 수 있습니다. 꿀벌 식민지 안에 수정 계란의 유일한 생산자로, 여왕은 틀림없이 기능 식민지 단위의 가장 중요한 단일 멤버입니다. 따라서 농약이 여왕의 건강과 생산성에 미치는 영향을 이해하는 것은 농약 위험 평가의 중요한 측면으로 간주되어야 합니다. 여기에, 적응 방법은 꿀벌 여왕과 노동자 여왕을 작업자 다이어트를 통해 투여 농약 스트레스에 노출, 실험실에서 계란 생산을 추적하고 전문 케이지를 사용하여 첫 번째 인스타 백과를 평가, 여왕 모니터링 케이지로 언급. 이 방법의 의도된 사용을 설명하기 위해, 노동자 여왕 승무원이 imidacloprid의 치사 복용량을 포함하는 규정식을 공급하고 여왕에 대한 효력을 감시한 실험의 결과가 기술되었습니다.
Introduction
농산물에 대한 글로벌 수요 증가로 인해 현대 농업 관행은 종종 농약의 사용을 요구하여 작물 수확량을 줄이거나 해칠 것으로 알려진 수많은 해충을 통제해야합니다1. 동시에, 많은 과일, 야채, 견과류 작물의 재배자는 풍부한 작물 수확량을 보장하기 위해 상업 꿀벌 식민지에서 제공하는 수분 서비스에의존2. 이러한 관행은 꿀벌(아피스 멜라이프라)을포함한 수분 공급원이 발생할 수 있으며, 살충제 잔류물의 유해한 수준에 노출될 수 있습니다3. 동시에, 꿀벌 식민지에서 기생 바르로아 파괴기 mite 감염의 광범위한 존재는 자주 거브키퍼가 미티시드로 자신의 두드러기를 치료하도록 요구, 이는 또한식민지4의건강과 장수에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다4,5,6. 농약 제품의 유해한 영향을 줄이고 완화하기 위해, 그들의 사용에 대한 권장 사항이 유익한 곤충을 보호하기 위해 만들 수 있도록 구현 하기 전에 꿀벌에 그들의 안전을 완전히 평가 할 필요가있다.
현재 환경 보호국 (EPA)은 꿀벌 살충제 노출에 대한 계층적 위험 평가 전략에 의존하며, 이는 성인 꿀벌과 때로는 꿀벌 애벌레7에대한 실험실 테스트를 포함합니다. 낮은 계층 실험실 테스트 독성의 우려를 완화 하지 못하는 경우, 높은 계층 필드 와 반 필드 테스트 권장 될 수 있습니다. 이 실험실 시험은 근로자 수명에 대한 농약의 잠재적 영향에 대한 귀중한 통찰력을 제공하지만, 반드시 여왕에 미치는 영향을 예측하지는 않습니다, 이는 생물학적으로 노동자와 크게 다른8 행동과 행동9. 더욱이, 사망률을 넘어 곤충에 농약의 수많은 잠재적인 효력이 있다, 식민지 단위로 작동 하기 위해 조정 된 행동에 의존 하는 사회 곤충에 대 한 상당한 결과 가질 수 있습니다10,11.
사망률은 농약 살충제(12)의가장 일반적으로 고려되는 효과가지만, 이들 제품은 변경된동작(13,14, 15,16,기피 또는 유치17,18,19,수유 패턴20,21,22)을 포함하여 표적 및 비표적 절지동물 모두에 광범위한 영향을 미칠 수있습니다. ,20,21,22,23,24,25의증가 또는 감소. 사회 곤충의 경우, 이러한 효과는 체계적으로 식민지 상호 작용과 기능11을방해 할 수 있습니다. 이러한 기능 중, 식민지 단위9의나머지 부분에 의해 지원 되는 단일 계란 누워 여왕에 크게 의존 하는 재생, 농약 노출으로 인해 동요에 특히 취약 할 수 있습니다.
미숙한 여왕에 수행 된 연구는 미티치드에 대한 발달 노출이 성인 여왕 행동, 생리학, 생존26,27에영향을 미칠 수 있음을 입증했습니다. 유사하게, 전체 또는 감소된 크기의 콜로니를 이용한 연구는 농약이 짝짓기성공(28)을감소시키고, oviposition29를감소시키고,25,30,31의계란생산계란의 생존가능성을 감소시킴으로써 성인 꿀벌 여왕에 영향을 미칠 수 있음을입증했다. 이러한 현상은 이전에 전체 식민지의 사용 없이 관찰 하기 어려웠다, 사용 가능한 실험실 방법의 부족으로 크게 인해. 그러나 퀸 모니터링 케이지(QMC)(32)를 사용하여 엄격하게 통제된 실험실 조건 하에서 여왕 oviposition을 연구하는 방법은 최근 여왕 fecundity33에농약의 효과를 검사하기 위해 조정되었습니다. 여기서, 이러한 기술은 QMC에서 근로자 의 식단 소비를 측정하고 추적하는 추가 방법과 함께 자세히 설명됩니다.
이러한 방법은 전체 크기의 식민지를 요구하는 실험보다 더 유리하기 때문에 농약의 정확한 투여를 허용하여 일반적으로식민지내부에 존재하는 수만 명에 비해 노동자 수가 크게 감소하여 여왕을 프로비저닝합니다. 이 노출 기술은 여왕이 실제 시나리오에서 경험할 중고 노출을반영합니다. 마찬가지로, 여왕은 일반적으로 짝짓기 항공편35에대한 식민지 재생 (떼링)을 제외하고 는 하이브를 떠나지 않습니다. 메이트 꿀벌 여왕은 상업 여왕 육종가에서 구입하고 하룻밤 배송 할 수 있습니다. 일반적으로, 여왕 육종가들은 성공적인 짝짓기의 표시로 취해지는 계란을 낳기 시작했다는 것을 확인한 후에 여왕을 직접 판매합니다. 여왕 나이 또는 관련성에 대한 보다 정확한 정보가 필요한 경우, 연구원은 주문을하기 전에 여왕 육종가와 상의 할 수 있습니다.
QMC는 꿀벌 여왕 oviposition 및 계란 부화 비율32,33의정확한 관찰 및 정량화를 허용하고, 여왕 fecundity에 농약 노출의 효과와 관련된 귀중한 데이터를 산출. 여기에 제시된 대표적인 결과는 전신 신경독성 제비제 네오니코티노이드 살충제 이미다클로프리드36의현장 관련 농도에 만성적인 노출하에 QMC에서 배아 생존력을 정량화하는 실험을 설명한다. 일단 적용되면, imidacloprid는 식물 조직(37)에배신하고, 잔류물은 수많은 꿀벌 수분 식물38,39,40의꽃가루와 꿀을 검출되었다. imidacloprid에 노출은 꿀벌에 해로운 효과의 넓은 범위를 가질 수 있습니다 장애 된 성능(16,장애인 된 면역 기능41,식민지 확장 및 생존의 감소 속도42,43). 여기서, imidacloprid는 필드 실험이 꿀벌 여왕 oviposition29에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었기 때문에 시험 물질로 사용하기 위해 선택되었습니다.
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Protocol
1. QMC 어셈블리
- 도 1B에도시된 바와 같이 삽입된 단일 계란 누워 판(ELP)을 부품(도1A)에서QMC를 조립한다. 작업자가 케이지에 추가될 때까지 피더 튜브를 추가하지 마십시오. 실험실 급 테이프로 4 개의 피더 구멍을 일시적으로 덮습니다.
- 여왕 제외기와 먹이 챔버 문을 먹이실 위에 삽입하여 여왕이 먹이실에 들어가고 치료된 식단에 연락하지 못하게 합니다. 자세한 어셈블리 세부 정보는 Fine et al.32를 참조하십시오.
- 성인 백과 사전 24시간 전에 꿀벌 식민지에서 덮인 작업자 무리를 포함하는 왁스 빗 프레임을 수집하고 무리 상자 안에 인큐베이터(34.5°C)에 넣습니다. 24시간 후, 밀폐된 꿀벌을 프레임에서 털어내고 곤충 장벽 페인트(예: 플루온)가 늘어선 열린 용기에 붓고 꿀벌이 기어나가는 것을 방지합니다.
- 각 QMC의 알 누워 챔버에 체중50 개 이상의 꿀벌 (5 g ≈ 50 꿀벌44,45)를추가합니다. 실험에서 다양한 유전 적 풀이 표현되도록, 적어도 세 개의 식민지에서 작업자 꿀벌의 거의 동일한 수를 얻고 QMC에 추가하기 전에 혼합.
참고: 1일 미만의 새로 폐쇄된 작업자 꿀벌은 저개발 비행 근육과 굳어지지 않은 표피로 인해 비행하거나 따끔거릴 수 없습니다. 이 나이에 추가되는 경우 취급 하기 전에 마취 할 필요가 없습니다. 그들은 작은 1/4 컵 볼륨 측정 컵을 사용하여 용기에서 꿀벌을 부드럽게 스쿠핑하고 두 번째 용기에 배치하여 무게를 측정 할 수 있습니다 (예를 들어, 플루온 줄 지어) 규모로 타지되었습니다. 캡된 무리로 덮인 프레임의 영역은 출처 식민지가 QMC 작업자 인구에서 동일하게 표현되도록 대략 동일해야 합니다. 작업자 꿀벌의 균질화는 모든 식민지에서 가져온 프레임에서 새로 밀폐 된 꿀벌을 동일한 용기로 칫솔질하고 QMC에 추가하기 전에 5 분 동안 혼합 할 수 있게함으로써 달성 될 수 있습니다. - 자당 용액, 물 및 꽃가루 보충제가 들어있는 피더를 추가하십시오 (섹션 2참조).
- 개별 메이트 여왕을 CO2 가스에 노출하여 달걀 누워46을 자극하고 QMC로의 전송을 용이하게합니다.
- 영수증 48시간 이내에 상업용 육종가에서 구입한 여왕을 사용하십시오. 여왕이 여전히 배송 케이지 안에 있는 동안, 투명 한 비닐 봉지에 놓습니다. CO2 가스 캐니스터에 연결된 플라스틱 튜브의 한쪽 끝을 가방 내부에 놓고 캐니스터 밸브를 부드럽게 열어 CO2 가스가 흐르도록 합니다.
- 가방이 가스로 팽창하면 동시에 캐니스터 밸브를 닫고 가방을 닫아 가스내부를 트랩합니다. 30대 또는 여왕이 움직이지 멈출 때까지 가방을 닫아 두십시오. 여왕을 제거하고 그녀가 의식이 관찰되면 선적 케이지를 엽니 다.
- 알 누워 챔버에 문을 부분적으로 열고, 부드럽게 내부에 의식이없는 여왕을 배치하고 내부 여왕이나 노동자를 분쇄하지 않도록주의, 뚜껑을 닫습니다. 그림 1C에표시된 대로 각 QMC에 두 번째 계란 누워 접시를 추가합니다. 두 개의 ELP 상단에 실험실 테이프를 배치하여 QMC 프레임에서 분리되지 않도록 하고 작업자가 케이지를 빠져나가는 것을 방지합니다.
- 케이지는 34± 0.5°C의 안정적인 환경 조건과 60%± 10%의 상대 습도를 가진 어두운 인큐베이터에 놓습니다.
그림 1. A: 분해된 QMC. B: ELP 1개이 삽입된 QMC를 부분적으로 조립했습니다. C: 2개의 ELP를 가진 완전히 조립된 QMC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 농약으로 묶인 식단을 준비하고 투여합니다.
- 50% (g/g) 자당 용액 1000 g을 준비하려면 깨끗한 1 L 유리 시약 병 바닥에 저어바를 놓습니다. 자당 500g과 500mL의 탈수를 추가합니다. 병의 뚜껑을 풀고 가열 된 교반 판을 사용하여 모든 자당이 용해 될 때까지 용액을 혼합합니다. 농약 적 재고 솔루션을 추가하기 전에 용액을 실온으로 냉각 시키십시오.
- 아세톤과 같은 적절한 용매로 농약의 스톡 솔루션을 준비하여 섭취에 첨가하여 관심 있는 농약의 최종 농도를 달성할 수 있다.
참고: 아세톤을 차량 용매로 사용하는 경우, 경제협력개발기구(OECD) 가이드라인은 성인꿀벌(47)에대한 만성 경구 독성 검사의 경우 식이요법의 아세톤의 최종 농도가 5%≤ 되어야 한다고 규정하고 있다. 그러나,n-메틸-2-pyrrolidone5,31 및 디메틸 설플옥사이드(25)와 같은 일부 용매는 이 농도 이하의 독성 효과를 발휘할 수 있으므로 치료 식단에서 용매 농도를 가능한 한 낮게 유지하는 것이 좋습니다. 사용되는 용매의 부피 및 종류에 따라 용매 독성으로 인한 잠재적 인 효과가 검출되도록 용매 제어 그룹과 음의 대조군을 모두 포함해야 할 수도 있습니다. 제조된 제품을 사용하는 경우, 사용되는 제품의 양은 제형에 존재하는 농도에 따라 조정되어야 한다. 용매에 대한 관심의 농약의 안정성에 따라, 재고 용액은 -20 °C에서 최대 2 주 동안 보관 할 수 있습니다. - OECD 시험 제245호:꿀벌(아피멜라이프라 L.),만성 구강독성검사(10일수)47호의결과에 따라 아쓰치명적인 투여량을 선택하고, 에코톡스 지식기반(48)을 질의하여 관련 문헌을 규명한다.
- 자당 용액, 상업용 꽃가루 보충제 (분말로 사용할 수있는 경우) 또는 둘 다에서 농약 적 치료를 투여하십시오. 냉장/실온 50% 자당 용액(w/w)에 적량의 스톡 솔루션을 추가하여 같은 날 실험식단을 준비한다. 소용돌이를 일으키거나 중간 속도로 설정된 스터디 바와 철저히 섞으세요. 꽃가루 보충제의 경우, 제조 업체 프로토콜에 따라 시럽 대신 분말 보충에 농약 레이스 자당 용액을 추가, 꽃가루 다이어트의 최종 무게에 따라 사용되는 재고 용액의 볼륨을 조정해야합니다. 예를 들어 계산은 표 1을 참조하십시오.
- 2mL 마이크로센심분리기 튜브에서 피더 튜브를 준비합니다.
- 액체 다이어트 피더의 경우, 뜨거운 접시 / 스토브에 20 게이지 바늘의 끝을 가열하고 튜브의 바닥에 두 번 구멍을 뚫습니다. 구멍 구멍 중 하나를 통해 튜브 뚜껑과 피펫 약 1.5mL의 자당 용액 또는 물을 닫습니다. 튜브가 QMC에 추가될 때까지 구멍을 뚫은 쪽으로 아래로 설정합니다.
- 꽃가루 보충 피더의 경우 면도날을 사용하여 튜브 바닥을 잘라냅니다. 뚜껑을 닫고 1-2g의 꽃가루 공을 튜브에 밀어 넣고 뚜껑에 닿을 때까지 튜브에 넣습니다.
- CMC에 배치하기 전에 피더 가중치를 기록합니다. 사용하지 않은 식단을 48시간 이상 사용하지 않도록 하십시오.
| 원하는 농도 | 원하는 용매 차량 농도 | 자당 용액의 원하는 최종 부피 /질량 | 주식 솔루션의 보증 | 재고 솔루션의 이미다클로프리드 | 추천 스톡 솔루션 레시피 | |
| 수크로오스 솔루션 | 10 ppb (w / w) | 0.05% (v/v) | 81.45 mL/100 g* | 40.7 μL | 0.001 mg/40.7 μL | 0.02 mg/814 μL |
| 꽃가루 보충 | 10 ppb (w / w) | 10 g** | 4.07 μL | 0.0001 mg/4.07 μL | 0.02 mg/814 μL | |
| 수크로오스 솔루션 | 50 ppb (w / w) | 0.05% (v/v) | 78.5mL/100 g* | 40.7 μL | 0.005 mg/40.7 μL | 0.1 mg/814 μL |
| 꽃가루 보충 | 50 ppb (w / w) | 10 g** | 4.07 μL | 0.0005 mg/4.07 μL | 0.1 mg/814 μL |
표 1: 치료 된 자당 용액, 꽃가루 보충 및 재고 용액을위한 예제 조리법. * 50 % (w / w) 자당 용액 (1.228 g / mL)의 밀도를 기준으로 볼륨. **꽃가루 보충제의 밀도는 어떤 제품이 사용되는지에 따라 달라지지만,이 용매 부피가 사용되는 경우 꽃가루 보충제의 최종 용매 농도는 부피별로 ≤ 5 %의 원하는 범위 내에 있을 것입니다.
3. 모니터링 - 계란 생산 속도
- 아침및/또는 저녁에 하루에 1~2회 누워 있는 달걀을 정량화합니다. 먼저 인큐베이터에서 QMC를 제거하여 계란을 확인합니다.
참고: 성공적인 실험에서 계란 생산은 초기 케이지 조립 후 3일 이내에 대부분의 제어 QMC에서 시작됩니다. 10분 이내에 확인 및 공급할 수 있는 한 번에 많은 QMC만 인큐베이터에서 제외됩니다. 인큐베이터 외부의 기간이 길어지면 계란 생산이 방해될 수 있습니다. - 계란에 대 한 명확한 EP의 뒷면을 검사. 계란이 있는 경우 관심 있는 접시 앞의 문 패널을 제거하십시오. ELP 를 가로질러 테이프를 제거하고 ELP와 QMC 내부의 꿀벌 사이의 도어 패널을 조심스럽게 밀어 내고 ELP의 세포를 청소할 수 있는 꿀벌을 분쇄하지 않도록 주의하십시오.
- 도어 패널을 제자리에 두고 ELP를 제거하고 ELP 셀 내부의 계란 수를 계산하고 기록합니다. ELP의 가장자리를 눌러 계란을 제거, 아래로 셀 측을 엽니 다, 하드 표면에 (폐기물 리셉터클의 입술등). 계란이 빠지면 QMC의 빈 ELP를 교체하십시오. QMC 바깥쪽의 ELP 뒤에 있는 도어 패널을 부드럽게 제거하고 교체합니다. 두 번째 ELP에서 필요에 따라 반복하고 완료되면 QMC 전체에서 테이프를 교체합니다.
참고: 계란 생산은 일반적으로 감소하고 2 주32,33후에 QMC에 있는 사망률 증가, 따라서 14 일 후에 실험을 끝내는 것이 좋습니다.
4. 모니터링 - 식품 소비
- QMC 피더에 남은 모든 음식을 2일마다 갓 준비한 식단으로 대체하십시오. 모니터링을 위해 인큐베이터에서 QMC를 제거하기 전에 새로운 피더 튜브(물 포함)를 준비하고 무게를 측정합니다. 모든 오래된 튜브를 새로운 튜브로 바꾸고 소비되지 않은 식단을 폐기하기 전에 오래된 튜브의 무게를 측정하십시오. 영양 튜브와 소비되지 않은 식단의 최종 체중을 QMC에 넣기 전에 동일한 피더 튜브의 무게와 비교하여 식단 소비를 추정합니다.
- 피더를 교체할 예정인 날 사이에 하루에 한 번(QMC가 계란 생산을 위해 모니터링되는 경우 동시에) 식이 요법 소비를 확인하여 피더가 비어 있는 것이 아닙니다. 피더 튜브가 비어 있거나 비어 있는 경우 제거하고 리필하고, 튜브의 무게를 전후기록하고 QMC의 2일 다이어트 소비 합계에 차이를 추가합니다.
5. 모니터링 - 배아 생존 가능성
- QMC 실험 중 선택한 지점에서 3단계에따라 QMC에서 갓 낳은 알을 함유한 ELP를 제거하지만 ELP에서 계란을 빼내지 는 않습니다.
- ELP를 범용 마이크로플레이트 뚜껑으로 덮고 포화 된 K2SO4 용액 (150g K2SO4 인 물 1 L, 얕은 접시에 보관)로 건조기 내부에 놓습니다.
참고: 혼합물이 인큐베이터의 온도에 도달한 후 일부 소금은 접시 바닥에 표시되어야 합니다. - 건조기를 34.5°C로 설정된 인큐베이터에 보관하여,콜린스(49)가사용하는 조건과 유사한 건조기 내부에 95%의 상대 습도가 발생한다.
참고: 거의 모든 계란이49로배치된 후 72± 6시간 이내에 부화되므로 QMC에서 EP가 제거된 후 78시간 이내에 부화율을 평가할 수 있습니다. 셀 하단에 있는 "C" 모양 유충은 성공적인 부화 이벤트를 나타냅니다. 예를 들어, 계란이 드론이 아닌작업자(50)인경우 이 타이밍의 일부 변형이 가능합니다.
6. 작업자 샘플링
- QMC가 초과 작업자로 채워진 경우, 생리학의 치료 유도 된 변화의 평가를위한 실험 중에 선택한 시점에서 작업자 꿀벌을 샘플링하십시오. 매일 수유 및 계란 계산 활동과 함께 컬렉션을 수행하여 QMC가 인큐베이터 외부에 있는 시간을 최소화합니다.
- 샘플링하기 전에 ELP와 QMC 내부 사이에 도어 패널을 배치하고 ELP를 제거합니다. 케이지 의 기지에서 약 0.5cm 의 문 패널을 조심스럽게 들어 올리고 페더급 핀셋을 사용하여 QMC 내부에서 작업자 꿀벌을 제거합니다. 꿀벌이 탈출하는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 장갑을 낀 손가락이나 면 조각으로 0.5cm 개구부의 일부를 덮습니다.
- 수집된 꿀벌을 후속 분석을 위해 보존하고 원하는 샘플 수가 수집될 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 유전자 발현 분석을 위해, 액체 질소에서 꿀벌을 스냅하고 -80 °C에서 즉각적인 저장을권장51.
7. 근로자 사망
- 수유실과 계란 누워 챔버의 바닥에 죽은 꿀벌의 수를 계산하여 실험 중에 노동자 사망률을 평가합니다. 매일 계란 누워 정량화와 함께이 평가를 수행.
- 집게를 사용하여 피더 구멍을 통해 죽은 꿀벌을 조심스럽게 제거하고 집게가 삽입되지 않은 동안 장갑을 낀 손가락이나 면 조각으로 구멍을 덮습니다.
- 케이지 의 기지에서 약 0.5cm의 문 패널을 조심스럽게 들어 올리고 집게를 삽입하여 계란 누워 챔버에서 죽은 꿀벌을 제거합니다. 꿀벌이 탈출하는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 장갑을 낀 손가락이나 면 조각으로 0.5cm 개구부의 일부를 덮습니다.
- 나머지 꿀벌을 안락사시키기 전에 이전에 설명한 방법을 사용하여 QMC에서 죽은 꿀벌을 모두 제거하고 계산하여 실험이 끝날 때 작업자 사망률을 평가합니다.
참고: 일꾼 꿀벌이 없을 경우, 여왕은 계란을 생산하지 않으며 24 시간 이내에 굶어 지을 것입니다. 따라서 QMC의 모든 작업자가 죽은 것으로 관찰되면 실험에서 QMC를 제거해야 합니다. 마찬가지로 실험 중에 여왕이 죽으면 QMC를 제거하고 데이터를 적절하게 검열해야 합니다.
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Representative Results
계란의 생산은 계란 생산의 한 번 매일 관찰과 치료 그룹 당 15 케이지와 위에서 설명 한 대로 조립 및 유지 QMC에서 모니터링되었다. 주로 카니올란 주식의 새로 짝을 이린 여왕은 여왕 사육자로부터 하룻밤 사이에 구입하여 출하했으며, 일리노이 어바나 샴페인 대학의 꿀벌 연구 시설에서 표준 상업 방법에 따라 유지된 3개의 식민지에서 꿀벌 노동자를 얻었습니다. 여기서, 4개의 규정식 처리 단은 이용되었습니다: 1) 50 ppb (g/g) 자당 용액 및 꽃가루 보충교재 (50 ppb - p +s), 2) 10 ppb imidacloprid 자당 용액 및 설문 조사 엔 보충 (10 ppb -p+s), 3) 10 ppb imidacloprid 꽃가루 보충 단독으로 (10 ppb - p), 및 4) 치료 그룹과 같은 아세톤의 동등한 볼륨을 포함하는 다이어트 주어진 대조군 (CTRL).
매일 계란 수의 치료 관련 변화는 경미한 수정과 함께 Fine et al.32에 설명된 바와 같이 평가되었다. 간략하게, 자동 회귀(AR-1) 상관 매트릭스 구조를 가진 푸아송 로그 선형 GEE가 시간이 지남에 따라 계란 생산의 치료 관련 변화를 평가하기 위해 구현되었다. 여기서, 시간(day)은 연속 변수로 처리되었고 치료는 범주적이었다. Wald 치 스퀘어 포스트 호크 테스트는 중요성을 결정하는 데 사용되었다. 실험 첫날에 알 낳기가 관찰되지 않아, 이날은 GEE의 가정에 부합하기 위해 분석에서 제외되었다. 이 분석 결과는 표 S1에표시됩니다. 일일 계란 생산은 50 ppb p+s 치료 그룹에서 QMC에서 현저히 낮았습니다(θ 2=43.99, p<0.001; 그림 2A).
치료에 의해 QMC에서 생산된 계란의 총 수의 차이는 단방향 ANOVA 및 투키 HSD 포스트 Hoc 시험을 사용하여 분석하였다(그림3). 이 분석을 위해, 여왕 또는 근로자 의 죽음으로 인한 14 일 모니터링 기간이 끝나기 전에 실험에서 제거 된 QMC는 제외되어 CTRL및 50 ppb에 대한 N = 13 각 - p + s 그룹, P + s 그룹 N = 14 대 10 ppb - p 및 10 ppb - p + s에 대한 N =15. 용량 의존 효과는 자당과 꽃가루 모두에서 투여 된 치료에 대해 관찰되었으며, 50 ppb에서 관찰 된 대조군에 비해 계란 생산이 가장 큰 감소 - p +s는 10 ppb - p +s로 뒤따랐다. 생성된 총 계란의 차이는 CTRL과 10 ppb - p (F3,52=17.95, p<0.001, Tukey HSD) 사이에서 관찰되지 않았다.
꽃가루 보충및 물의 소비는 10 일 동안 48 시간마다 기록되었으며, 자당 용액의 소비는 12 일 동안 48 시간마다 기록되었습니다. 다이어트 소비율의 변화는 상기와 동일한 매개변수를 가진 가우시안 분산 GEEs를 사용하여 평가하였다(그림2B-D). 결과는 표 S1에요약됩니다. 간단히, 자당 소비의 일일 비율은 실험이 진행됨에 따라 크게 증가 (θ2=6.03, p =0.014), 하지만 꽃가루 보충 소비의 비율은 감소 (θ2=174.98, p<0.001). 꽃가루 소비의 상당히 높은 비율은 imidacloprid 혼자 꽃가루 보충에서 10 ppb에서 투여 될 때 관찰되었다 (θ2=21.44, p<0.001) 그것은 꽃가루 보충 및 자당 솔루션에 10 또는 50 ppb에서 투여 될 때 크게 감소 (10 ppb - p +s:20ppb - p+s: 2 =6.50; ppb+pb; ppb; pp2=6.50; ppb;pb;pb θ2=14.47, p=0.0001).
계란은 실험 7일째에 QMC로부터 수집되었고, 농약 치료에 모계 노출에 따라 부화하는 계란의 수의 변화는 이소미 분포와 QMC ID를 임의의 효과로 처리한 일반화선형 혼합 모델(GMLR)을 사용하여 평가되었다. 꽃가루에서만 10 ppb또는 꽃가루 및 자당 용액에서 투여된 이미다클로프리드에 대한 모계 노출은 계란 부화율(10 ppb - p+s: Z=-0.139, p=0.290; 10 ppb - p: Z=0.182, p=0.856)에 영향을 미치지 않았다. 부화율은 이 처리 단에 있는 계란 생산의 낮은 비율로 인해 50 ppb imidacloprid laced 규정식으로 프로비저닝된 QMC에 있는 여왕에 의해 놓인 계란을 평가할 수 없었습니다.
이 작품의 경우 모든 통계 분석은 R Studio 1.2.5003(미국 보스턴)에서 수행되었습니다. 수치는 JMP 프로 를 사용하여 준비되었다 15 포토샵 CC 2019 (어도비 Inc., 산호세, 캘리포니아). 데이터는 보충 파일 S1에서사용할 수 있습니다.
그림 2. A: QMC에서 하루 평균 ± SE 계란: 평균 ± SE 꽃가루 보충, C: 자당 용액, D: 그리고 물 (g) QMC에서 48 시간 기간 동안 소비. 치료의 중요성 ("*"에 의해 표시) GEE와 Wald 치 스퀘어 포스트 hoc 테스트에 의해 결정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 실험 중 치료에 의해 낳은 계란의 평균 ± SE 합계. ANOVA 및 투키 HSD 포스트 호크 테스트에 의해 결정된 중요성(문자로 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 S1: 시간이 지남에 따라 QMC에서 계란 누워 속도 및 다이어트 소비의 변화를 분석 하는 GEEs의 결과. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S1 : 이 보충 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여성 독방 곤충뿐만 아니라 안락 사회 곤충 식민지의 여왕은 농약25,28,29,30,33과같은 생물학적 스트레스에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 꿀벌에서, 그들은 그들의 배려와 노동자 꿀벌에 의해 먹이의 변경을 통해 발생할 수 있기 때문에 여왕에 농약의 효력은 간접적일 지도 모릅니다. 현장 기반 연구29에서보고된 것과 유사한 대표적인 결과는 CMC를 사용하여 실험실 환경에서 암화학 물질이 퀸 성능에 미치는 영향을 효율적으로 측정하여 현장 기반 접근법에 유사한 결과를 생성할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 이러한 결과 노동자 다이어트 소비와 계란 생존에 imidacloprid의 영향에 빛을 발산.
Imidacloprid 는 자당 용액과 꽃가루 보충에서 함께 투여 되었을 때 계란 생산에 명확한 부정적인 영향을 했다. 이는 imidacloprid laced 시럽으로 프로비전된 관측 두드러기를 사용하여 보고되고29를자유롭게 사료할 수 있는 결과와 유사합니다. 그러나, 여기서, 투여량 의존반응이 관찰되었고, QMC에서 가장 뚜렷한 효과가 낮은 농도에 비해 50 ppb 이미다클로프리드로 프로비전되었다. 필드 식민지에 대 한 보고 된 것과는 달리, 이 그룹은 계란 생산의 거의 중단을 경험. 이 작업에 사용되는 50 ppb를 포함한 모든 농도는 이미다클로프리드가 종자 처리로 적용될 때 일반적으로 관찰되는 꽃가루 및 넥타 잔기보다 높으며 토양응용(40)에따른 잔여물을 더 대표한다는 점에 유의해야 한다. 관련 식물의 예로는 도시경관(29)에서발견되는 cucurbits 및 장식품이 포함되어 있으므로 이러한 결과는 이러한 맥락에서 해석되어야 합니다. 추가적으로, 이러한 결과와 필드 콜로니를 사용하여 생성된 결과 사이의 차이는, 결과가 가장 높은 치료 그룹에서조차 뚜렷하지 않은 경우, 다른 실험실 기반 분석과 마찬가지로 QMC가 데이터를 해석할 때 고려해야 할 전체 크기의콜로니(52)를사용하는 것보다 더 민감할 수 있음을 시사한다.
이전에 보고된 CMC에서 곤충 성장 조절기(IGR)에 노출된 oviposition을 조사한 결과, IgRs가 여왕 계란 누워율33의감소를 초래한다는 것을 발견하지 못했으며, 계란 생산의 중단이 균일한 스트레스 반응이 아니라는 것을 입증했습니다. 전체 크기의 식민지를 이용한 현장 수준 평가는 식민지 건강에 농약의 효력의 더 전체적인 보기를 제공할 수 있더라도, 이 사실 인정은 QMC가 꿀벌 여왕 oviposition에 영향을 미칠 수 있는 imidacloprid 같이 화학제품을 확인하는 공구로 이용될 가능성이 있다는 것을 건의합니다. 꿀벌 건강의 다른 지표에 대한 사용 패턴, 노출 패턴 및 기타 지표에 대한 효과를 고려한 광범위한 위험 평가 전략의 맥락에서 사용되는 경우 QMC에서 생성한 계란 생산 데이터는 꿀벌 식민지에 대한 농약의 잠재적 영향에 대한 보다 포괄적인 이해를 얻을 수 있습니다.
양적 배기 데이터를 생성하는 것 외에도 QMC를 사용하여 근로자 식단 소비의 패턴과 생리학의 변화를 평가할 수 있습니다. 여기서, 꽃가루 식단에서 10 ppb 이미다클로프리드가 짝짓기 여왕의 존재에서 근로자의 꽃가루 보충 소비를 자극한다는 것을 보여주었습니다. 이 효과는 QMC가 꽃가루 보충제와 자당 용액 모두에서 이미다클로프리드로 프로비저닝되었을 때 다른 식이 요법에서도 관찰되지 않았습니다. QMC에 남아있는 꿀벌의 정확한 수에 따라 사망률을 추적하고 식단 소비의 측정값을 조정함으로써 소비 율의 더 정확한 추정을 얻을 수 있지만, 사망률이 치료 전반에 걸쳐 지속적으로 낮은 경우, 몇 가지 비교가 이루어질 수 있습니다. 이미다클로프리드의 농도를 동일한 농도함유 꽃가루 식단의 소비에 대한 치료 간의 불일치는 이미다클로프리드가 자당과 꽃가루 보충제에 존재할 때 꿀벌에게 투여되는 더 높은 총 용량의 차이와 관련이 있을 수 있다.
낮은 수준에서, 꿀벌네오니코티노이드 살충제를 함유 하는 식품 소스를 선호 하는 증거가 있다18,그리고 그들은 니코틴을 포함 하는 꽃 자원에 대 한 유사한 선호를 나타내는 보고 되었습니다53. 이러한 선호도는 니코틴과 네오니코티노이드의 신경 자극성 특성 때문일 수 있으며, 이는 니코틴 아세틸콜린테라아체 수용체54를 학습 및메모리에관여하는 꿀벌 뇌의 일부에서 발현되어 있다. 거미 미다클로프리드에서, imidacloprid는 증가 ovposition 및 fecundity22의결과로, 규정식 소비를 자극합니다. 여기서, 꽃가루 보충 소비에 있는 imidacloprid 관련 증가는 oviposition에 있는 증가와 관련이 없었고, 이 일에 있는 노동자 생리학에 imidacloprid의 효력은 탐구될 남아 있습니다. 그러나, 식민지 내부 농약 레이스 다이어트 꿀벌의 양을 이해 하면 소비 가능성이, 특히 그들의 다이어트에 더 많은 꽃가루를 필요로 하는 노동자 적극적으로 누워 여왕56,식민지 성능의 다양 한 측면에 농약의 위험을 알 릴 수 있습니다.
Imidacloprid는 단독으로 또는 꽃가루 보충 및 자당 용액모두에서 10 ppb imidacloprid로 프로비저닝 한 QMC에서 수집 한 계란의 부화 율에 의해 측정 된 배아 생존가능성에 측정 가능한 변화를 일으키지 않았다. 이는 QMC33에서IGR 노출 에 따른 계란 부화율의 감소와 는 다르며, QMC를 사용하여 여왕 의 구체적이고 다양한 측면을 검사할 수 있음을 다시 한번 입증합니다. Imidacloprid는 높은 수용성 이며 가능성이 대사 하 고 IgRs 같은 더 많은 지방 수용성 농약 보다 다르게 물질 대사 하 고 배설57,이는 transovarially 제거 될 수 있습니다58,59,60,61 어느 정도, 배아 개발에 미치는 영향의 결과. 대안적으로,신경독소(36)인 이미다클로프리드는 곤충 발달과 관련된 경로를 표적으로 하는 IgRs와 동일한 방식으로 배아 개발에 영향을 미치지 않을 수 있다62.
꿀벌 번식에 농약의 영향을 이해하고자하는 연구원에 의해 일반적으로 묻는 한 가지 질문은 식품9,63로선 분비물로 그녀를 프로비저닝하는 근로자에 의존하는 성인 여왕이 농화학 적 잔류물에 직접 노출되는지 여부입니다. 이것은 탐구되지 않았으며 여기에보고 된 결과에 표시되지 않습니다. 그러나, 작업자 선 분비물에서 농약적 잔류물은 일반적으로 통제된 식민지 공급 시나리오64에서작업자가 프로비저닝되는 것에 비해 크게 감소된다. 마찬가지로, 전체 크기의 식민지가 난소 감소를 초래한 이미다클로프리드의 농도에 노출되었을 때, 퀸즈29에서는잔류물이 발견되지 않았으며, 참조된 작업에서 관찰된 배양 비율의 변화는 쉽게 배설된 미량에 대한 직접적인 노출 때문이었으며, 여왕에게 관찰된 효과는 imidacrid 의 효과에 기인했기 때문임을 시사합니다. 여기에 제시된 방법은 성인 용백에서 샘플링 시간까지 처리된 식단을 섭취한 것으로 알려진 작업자 꿀벌의 샘플링을 허용합니다. 설명된 실험에서 샘플링된 작업자 꿀벌의 생리학에 대한 imidacloprid의 효과를 검토하는 후속 작업은 이 질문을 설명하는 데 도움이 될 것입니다.
요약하자면, 여기에 제시된 방법은 연구원이 꿀벌의 fecundity, 생존 및 발달과 관련된 종점을 평가함으로써 꿀벌에 대한 농약의 위험을 더 잘 평가할 수 있게 합니다. 설명된 기술은 필드 및 반필드 실험을 사용하여 획득하기 어렵고 자원 집약적 일 수 있는 여왕 fecundity에 관련있는 정량적 데이터를 생성하여 농약적 위험 평가를 크게 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, 누워 여왕의 존재는 일반적으로 여왕9의보살핌과 먹이를 담당하는 식민지의 구성원인 젊은 노동자들에게 수행 된 실험에 리얼리즘을 추가합니다. 이 기술을 사용하여 꿀벌 식민지 건강, 장수 및 성능에 대한 농약의 위험이 더 잘 예측되고 완화 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
에이미 캐시 아메드 박사, 나다니엘 J. 비치, 앨리슨 엘 산키 박사님이 이 사업을 수행해 주셔서 감사합니다. 이 출판물에서 무역 이름이나 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 동등한 기회 제공 자 및 고용주입니다. 이 연구는 국방 고급 연구 프로젝트 기관 # HR0011-16-2-0019에서 진 E. 로빈슨과 후이민 자오, USDA 프로젝트 2030-21000-001-00-D, 일리노이 시내 샹치에 있는 커뮤니티 칼리지 학생들을 위한 페노티픽 가소성 연구 경험의 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluon | BioQuip, Rancho Dominguez, CA | 2871A | |
| Honey bee queens | Olivarez Honey Bees, Orland, CA | ||
| Imidacloprid | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | 37894 | |
| MegaBee Powder | MegaBee, San Dieago, CA | ||
| Microcentrifuge tubes 2 mL | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | 02-682-004 | |
| Needles 20 gauge | W. W. Grainger, Lake Forest, IL | 5FVK4 | |
| Potassium Sulfate | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | P0772 | |
| Queen Monitoring Cages | University of Illinois Urbana-Champaign | Patent application number: 20190350175 | |
| Sucrose | Sigma-Aldritch, St. Louis, MO | S8501 | |
| Universal Microplate Lids | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | 5500 |
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