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Biology

Evaluación del riesgo agroquímico para las reinas de abejas melíferas apareadas

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62316
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3,4
1Invasive Species and Pollinator Health Research Unit, USDA-ARS, 2Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Department of Entomology, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Este protocolo fue desarrollado para mejorar la comprensión de cómo los agroquímicos afectan la reproducción de lasabejas melíferas (Apis mellifera)mediante el establecimiento de métodos para exponer a las reinas de las abejas melíferas y sus cuidadores trabajadores a los agroquímicos en un entorno controlado y de laboratorio y monitoreando cuidadosamente sus respuestas relevantes.

Abstract

Las estrategias actuales de evaluación de riesgos para las abejas melíferas dependen en gran medida de las pruebas de laboratorio realizadas en abejas obreras adultas o inmaduras, pero estos métodos pueden no capturar con precisión los efectos de la exposición a agroquímicos en las reinas de las abejas melíferas. Como el único productor de huevos fertilizados dentro de una colonia de abejas melíferas, la reina es posiblemente el miembro individual más importante de una unidad de colonia en funcionamiento. Por lo tanto, comprender cómo los agroquímicos afectan la salud y la productividad de las reinas debe considerarse un aspecto crítico de la evaluación del riesgo de los plaguicidas. Aquí, se presenta un método adaptado para exponer a las reinas de las abejas melíferas y a las asistentes de las reinas obreras a los factores estresantes agroquímicos administrados a través de una dieta de trabajadores, seguido de un seguimiento de la producción de huevos en el laboratorio y la evaluación de la primera eclosión instar utilizando una jaula especializada, conocida como jaula de monitoreo de reinas. Para ilustrar el uso previsto del método, se describen los resultados de un experimento en el que los asistentes a la reina obrera fueron alimentados con una dieta que contenía dosis subletales de imidacloprid y se monitorearon los efectos en las reinas.

Introduction

Debido al aumento de la demanda mundial de productos agrícolas, las prácticas agrícolas modernas a menudo requieren el uso de agroquímicos para controlar numerosas plagas conocidas por reducir o dañar los rendimientos de los cultivos1. Simultáneamente, los productores de muchos cultivos de frutas, verduras y nueces dependen de los servicios de polinización proporcionados por las colonias comerciales de abejas melíferas para garantizar abundantes rendimientos decultivos 2. Estas prácticas pueden dar lugar a que los polinizadores, incluidas las abejasmelíferas (Apis mellifera),estén expuestos a niveles nocivos de residuos de plaguicidas3. Al mismo tiempo, la presencia generalizada de infestaciones parasitarias de ácaros Varroa destructor en colonias de abejas melíferas con frecuencia requiere que los apicultores traten sus colmenas con miticidas, lo que también puede ejercer efectos negativos sobre la salud y la longevidad de la colonia4,5,6. Para reducir y mitigar los efectos nocivos de los productos agroquímicos, es necesario evaluar completamente su seguridad para las abejas melíferas antes de su implementación para que se puedan hacer recomendaciones para su uso para proteger a los insectos beneficiosos.

Actualmente, la Agencia de Protección Ambiental (EPA) se basa en una estrategia de evaluación de riesgos escalonada para la exposición a pesticidas de abejas melíferas, que implica pruebas de laboratorio en abejas adultas y, a veces, larvas de abejas melíferas7. Si las pruebas de laboratorio de nivel inferior no logran aliviar las preocupaciones de toxicidad, se pueden recomendar pruebas de campo y semicampo de nivel superior. Si bien estas pruebas de laboratorio proporcionan información valiosa sobre los efectos potenciales de los agroquímicos en la longevidad de los trabajadores, no son necesariamente predictivas de sus efectos en las reinas, que difieren significativamente de las obreras biológicamente8 y conductualmente9. Además, existen numerosos efectos potenciales de los agroquímicos sobre los insectos más allá de la mortalidad, lo que puede tener consecuencias considerables para los insectos sociales que dependen de comportamientos coordinados para funcionar como una unidad de colonia10,11.

Aunque la mortalidad es el efecto más comúnmente considerado de los plaguicidas agroquímicos12,estos productos pueden tener una amplia gama de efectos tanto en artrópodos objetivo como no objetivo, incluido el comportamiento alterado13,14,15,16,repelencia o atracción17,18,19,cambios en los patrones de alimentación20,21,22 , y aumento o disminución de la fecundidad20,21,22,23,24,25. Para los insectos sociales, estos efectos pueden interrumpir sistemáticamente las interacciones y funciones de las colonias11. De estas funciones, la reproducción, que depende en gran medida de una sola reina ponedora de huevos apoyada por el resto de la unidad9de la colonia, puede ser particularmente vulnerable a la perturbación debido a la exposición a pesticidas.

Los estudios realizados en reinas inmaduras han demostrado que la exposición del desarrollo a miticidas puede afectar el comportamiento de las reinas adultas, la fisiología, la supervivencia26,27. Del mismo modo, los estudios que utilizan colonias de tamaño completo o reducido han demostrado que los agroquímicos pueden afectar a las reinas adultas de las abejas melíferas al disminuir el éxito de apareamiento28,disminuir la oviposición29y disminuir la viabilidad de los huevos producidos25,30,31. Estos fenómenos han sido previamente difíciles de observar sin el uso de colonias enteras, debido en gran parte a la falta de métodos de laboratorio disponibles. Sin embargo, un método para estudiar la oviposición de reinas en condiciones de laboratorio estrechamente controladas utilizando Jaulas de Monitoreo de Reinas (QMC)32 ha sido adaptado recientemente para examinar los efectos de los agroquímicos en la fecundidad de las reinas33. Aquí, estas técnicas se describen en detalle junto con métodos adicionales para medir y rastrear el consumo de la dieta de los trabajadores en los MGC.

Estos métodos son más ventajosos que los experimentos que requieren colonias de tamaño completo porque permiten la administración de dosis precisas de agroquímicos a un número muy reducido de trabajadores en relación con las decenas de miles típicamente presentes dentro de una colonia34,que luego aprovisionan a la reina. Esta técnica de exposición refleja la exposición de segunda mano que las reinas experimentarían en escenarios del mundo real porque, dentro de una colonia, las reinas no se alimentan y dependen de las obreras para proporcionarles una dieta9. Del mismo modo, las reinas generalmente no abandonan la colmena excepto durante la reproducción de la colonia (enjambre) para los vuelos de apareamiento35. Las reinas de abejas melíferas apareadas se pueden comprar a criadores de reinas comerciales y enviarse durante la noche. Por lo general, los criadores de reinas venden reinas directamente después de confirmar que han comenzado a poner huevos, lo que se toma como una indicación de apareamiento exitoso. Si se necesita información más precisa sobre la edad de la reina o la relación, los investigadores pueden consultar con el criador de reinas antes de realizar un pedido.

Los MGC permiten la observación precisa y la cuantificación de la oviposición de la reina abeja melífera y las tasas de eclosión dehuevos 32,33, lo que arroja datos valiosos relacionados con los efectos de la exposición a agroquímicos en la fecundidad de la reina. Los resultados representativos presentados aquí describen un experimento que cuantifica la oviposición, el consumo de dieta y la viabilidad embrionaria en MGC bajo exposición crónica a concentraciones relevantes para el campo del pesticida neonicotinoide neurotóxico sistémico imidacloprid36. Una vez aplicado, el imidacloprid se transloca a los tejidos vegetales37,y se han detectado residuos del polen y néctar de numerosas plantas polinizadas por abejas38,39,40. La exposición al imidacloprid puede tener una amplia gama de efectos perjudiciales sobre las abejas melíferas, incluido el rendimiento de forrajeo deteriorado16,la función inmune deteriorada41y la disminución de las tasas de expansión y supervivencia de la colonia42,43. Aquí, el imidacloprid fue seleccionado para su uso como sustancia de prueba porque los experimentos de campo han demostrado que puede afectar la oviposición de la reina de la abejamelífera 29

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Protocol

1. Montaje QMC

  1. Ensamble los MGC a partir de piezas (Figura 1A) con una sola placa de puesta de huevos (ELP) insertada como se muestra en la Figura 1B. No agregue tubos de alimentación hasta después de que los trabajadores se hayan agregado a la jaula. Cubra temporalmente los 4 orificios del alimentador con cinta de grado de laboratorio.
  2. Inserte el exclusor de reina y la puerta de la cámara de alimentación sobre la cámara de alimentación para evitar que la reina entre en la cámara de alimentación y entre en contacto con la dieta tratada. Véase Fine et al.32 para más detalles sobre el montaje.
  3. Recoja los marcos de peine de cera que contienen la cría obrera tapada de las colonias de abejas melíferas 24 h antes de la eclosión adulta y colóquelos en una incubadora (34.5 ° C) dentro de una caja de cría. 24 horas más tarde, cepille las abejas eclosionadas de los marcos y en un recipiente abierto que haya sido forrado con una pintura de barrera contra insectos (por ejemplo, Fluon) para evitar que las abejas se arrastren.
  4. Agregue al menos 50 abejas en peso (5 g ≈ 50 abejas44,45) a la cámara de puesta de huevos de cada QMC. Para garantizar que un grupo genético diverso de trabajadores esté representado en el experimento, obtenga un número aproximadamente igual de abejas obreras de al menos tres colonias y mézclelas antes de agregarlas a los MGC.
    NOTA: Las abejas obreras recién eclosadas de menos de 1 día de edad no pueden volar ni picar debido a sus músculos de vuelo subdesarrollados y su cutícula no endurecida. Si se agregan a esta edad, no hay necesidad de anestesiarlos antes de manipularlos. Se pueden pesar recogiendo suavemente las abejas del recipiente usando una pequeña taza medidora de volumen de 1/4 de taza y colocándolas en un segundo recipiente (forrado con pintura de barrera contra insectos, por ejemplo, Fluon) que ha sido manchado en una báscula. El área de los marcos cubiertos por la cría tapada debe ser aproximadamente igual para garantizar que las colonias de origen estén igualmente representadas en las poblaciones de trabajadores de QMC. La homogeneización de las abejas obreras se puede lograr cepillando las abejas recién eclosadas de los marcos tomados de todas las colonias en el mismo recipiente y permitiéndoles mezclar durante 5 minutos antes de agregarlas a los MGC.
  5. Añadir los comederos que contengan solución de sacarosa, agua y suplemento de polen (ver sección 2).
  6. Exponga a las reinas apareadas individuales al gas CO2 para estimular la puesta dehuevos 46 y facilitar la transferencia a QMC.
    1. Use reinas compradas a un criador comercial dentro de las 48 horas posteriores a la recepción. Mientras la reina todavía está dentro de la jaula de envío, colóquela en una bolsa de plástico transparente. Coloque un extremo de un tubo de plástico conectado a un recipiente de gas CO2 dentro de la bolsa y abra suavemente la válvula del recipiente para permitir que el gas CO2 fluya.
    2. Cuando la bolsa se haya inflado con gas, cierre simultáneamente la válvula del recipiente y mantenga la bolsa cerrada para atrapar el gas en el interior. Mantenga la bolsa cerrada durante 30 s o hasta que la reina haya dejado de moverse. Retire a la reina y abra la jaula de embarque una vez que se observe que está inconsciente.
  7. Abra parcialmente la puerta de la cámara de puesta de huevos, coloque suavemente a la reina inconsciente dentro y cierre la tapa, teniendo cuidado de no aplastar a la reina o a las obreras en el interior. Agregue el segundo plato de puesta de huevos a cada QMC como se muestra en la Figura 1C. Coloque un trozo de cinta de laboratorio en la parte superior de los dos ELP para evitar que se separen del marco QMC y evitar que los trabajadores salgan de la jaula.
  8. Coloque las jaulas en una incubadora oscura con condiciones ambientales estables de 34 ± 0.5 ° C y 60% ± 10% de humedad relativa, como las condiciones dentro de una colonia normal.

Figure 1
Figura 1. R: QMC desmontado. B: QMC parcialmente ensamblado con 1 ELP insertado. C: QMC totalmente ensamblado con 2 ELP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparar y administrar dietas mezcladas con agroquímicos

  1. Para preparar 1000 g de solución de sacarosa al 50% (g/g), coloque una barra de agitación en el fondo de una botella limpia de reactivo de vidrio de 1 L. Añadir 500 g de sacarosa y 500 ml de agua desionizada. Desenrosque la tapa de la botella y use una placa de agitación calentada a fuego lento para mezclar la solución hasta que toda la sacarosa se haya disuelto. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de agregar las soluciones de stock de agroquímicos.
  2. Preparar las soluciones madre de agroquímicos en un disolvente apropiado, como la acetona, a una concentración que se pueda agregar a la dieta para lograr la concentración final deseada del agroquímico de interés.
    NOTA: Cuando se utiliza acetona como disolvente vehicular, las directrices de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) estipulan que la concentración final de acetona en la dieta debe ser ≤ 5% para las pruebas de toxicidad oral crónica en abejas melíferas adultas47. Sin embargo, algunos disolventes como la n-metil-2-pirrolidona5,31 y el dimetilsulfóxido25 puedenejercer efectos tóxicos por debajo de esta concentración, por lo que se recomienda mantener las concentraciones de disolventes lo más bajas posible en la dieta de tratamiento. Dependiendo del volumen y el tipo de disolvente utilizado, puede ser necesario incluir tanto un grupo de control de disolventes como un grupo de control negativo para garantizar que se detecten los posibles efectos debidos a la toxicidad del disolvente. Cuando se utilizan productos formulados, la cantidad del producto utilizado debe ajustarse en función de la concentración presente en la formulación. Dependiendo de la estabilidad del agroquímico de interés en el disolvente, las soluciones madre se pueden mantener durante un máximo de 2 semanas a -20 °C.
  3. Seleccionar dosis subletales basadas en los resultados de la Prueba Nº 245 de la OCDE: Abeja melífera(Apis mellifera L.),Prueba de toxicidad oral crónica (alimentación de 10días) 47,e identificar la literatura relevante consultando la base de conocimientos de Ecotox48.
  4. Administre los tratamientos agroquímicos en una solución de sacarosa, un suplemento de polen comercial (si está disponible en polvo) o ambos. Prepare la dieta experimental para su uso el mismo día agregando una cantidad adecuada de solución madre a la solución de sacarosa al 50% refrigerada / temperatura ambiente (p / p). Mezclar bien por vórtice o con una barra de agitación ajustada a velocidad media. Para los suplementos de polen, agregue la solución de sacarosa con agroquímicos al suplemento en polvo en lugar del jarabe de acuerdo con los protocolos del fabricante, asegurándose de ajustar el volumen de la solución madre utilizada de acuerdo con el peso final de la dieta de polen. Véase la Tabla 1 para ver cálculos de ejemplo.
  5. Prepare los tubos de alimentación a partir de tubos de microcentrífuga de 2 ml.
    1. Para los comederos de dieta líquida, caliente la punta de una aguja de calibre 20 en una placa caliente / estufa y perfore la parte inferior del tubo dos veces. Cierre la tapa del tubo y la pipete con aproximadamente 1,5 ml de solución de sacarosa o agua a través de uno de los orificios de punción. Coloque el tubo hacia abajo con el lado perforado hacia arriba hasta que se agregue al QMC.
    2. Para los comederos de suplementos de polen, use una cuchilla de afeitar para cortar la parte inferior del tubo. Cierre la tapa y empuje una bola de 1-2 g de suplemento de polen en el tubo hasta que toque la tapa.
  6. Registre los pesos del alimentador antes de colocarlos en los MGC. No mantenga la dieta no utilizada a 4 °C durante más de 48 horas.
Concentración deseada Concentración deseada de vehículos solventes Volumen/masa final deseada de solución de sacarosa Voume de solución de stock Imidacloprid en solución madre Receta de solución de stock sugerida
Solución de sacarosa 10 ppb (w/w) 0.05% (v/v) 81,45 ml/100 g* 40,7 μL 0,001 mg/40,7 μL 0,02 mg/814 μL
Suplemento de polen 10 ppb (w/w) 10 g** 4,07 μL 0,0001 mg/4,07 μL 0,02 mg/814 μL
Solución de sacarosa 50 ppb (w/w) 0.05% (v/v) 78,5 ml/100 g* 40,7 μL 0,005 mg/40,7 μL 0,1 mg/814 μL
Suplemento de polen 50 ppb (w/w) 10 g** 4,07 μL 0,0005 mg/4,07 μL 0,1 mg/814 μL

Tabla 1: Ejemplos de recetas para solución de sacarosa tratada, suplemento de polen y solución madre. *Volumen basado en la densidad de solución de sacarosa al 50% (p/p) (1.228 g/mL). **La densidad del suplemento de polen variará dependiendo del producto que se utilice, pero si se utiliza este volumen de disolvente, la concentración final de disolvente en el suplemento de polen estará dentro del rango deseado de ≤ 5% por volumen.

3. Monitoreo - Tasa de producción de huevos

  1. Cuantifique la puesta de huevos de 1 a 2 veces al día por la mañana y / o por la noche. Comience por retirar los MGC de la incubadora para verificar si hay huevos.
    NOTA: En un experimento exitoso, la producción de huevos comenzará en la mayoría de los MGC de control dentro de los 3 días posteriores al ensamblaje inicial de la jaula. Solo saque tantos MGC de la incubadora a la vez que se puedan verificar y alimentar dentro de los 10 minutos. Los períodos más largos fuera de la incubadora pueden interrumpir la producción de huevos.
  2. Examine la parte posterior de los ELP claros en busca de huevos. Si hay huevos, retire el panel de la puerta frente a la placa de interés. Retire la cinta de los ELP y deslice cuidadosamente el panel de la puerta entre el ELP y las abejas dentro del QMC, teniendo cuidado de no aplastar a ninguna abeja que pueda estar limpiando las células en los ELP.
  3. Con el panel de la puerta en su lugar, retire el ELP y cuente y registre el número de óvulos dentro de las células ELP. Retire los huevos golpeando el borde del ELP, abierto del lado de la celda hacia abajo, sobre una superficie dura (como el labio de un recipiente de desechos). Una vez que los huevos se caigan, reemplace el ELP vacío en el QMC. Retire y reemplace suavemente el panel de la puerta detrás del ELP en el exterior del QMC. Repita según sea necesario con el segundo ELP y reemplace la cinta en todo el QMC cuando haya terminado.
    NOTA: La producción de huevos generalmente disminuye y la mortalidad aumenta en los MGC después de 2 semanas32,33, por lo tanto, se recomienda concluir los experimentos después de 14 días.

4. Monitoreo - Consumo de alimentos

  1. Reemplace todos los alimentos que quedan en los comederos QMC con una dieta recién preparada cada dos días. Prepare nuevos tubos de alimentación (incluido el agua) y péselos antes de retirar los MGC de la incubadora para su monitoreo. Cambie todos los tubos viejos por otros nuevos y pese los tubos viejos antes de deshacerse de la dieta no consumida. Compare el peso final del tubo alimentador y la dieta no consumida con el peso del mismo tubo alimentador antes de colocarlo en el QMC para estimar el consumo de dieta.
  2. Entre los días en que se programe el reemplazo de los comederos, verifique el consumo de dieta una vez al día (al mismo tiempo que se monitorean los MGC para la producción de huevos) para asegurarse de que los comederos nunca estén vacíos. Si un tubo alimentador está vacío o casi vacío, retírelo, vuelva a llenarlo, registre el peso del tubo antes y después y agregue la diferencia al consumo total de dieta de 2 días para el QMC.

5. Monitorización - Viabilidad embrionaria

  1. En un punto seleccionado durante un experimento de QMC, retire los ELP que contengan huevos recién puestos del QMC de acuerdo con el paso 3,pero no desaloje los huevos del ELP.
  2. Cubra el ELP con una tapa universal de microplaca y colóquelo dentro de un desecador con una solución saturada K2SO4 (150 g K2SO4 en 1 L de agua, mantenido en un plato poco profundo).
    NOTA: Un poco de sal debe ser visible en el fondo del plato después de que la mezcla llegue a la temperatura en la incubadora.
  3. Mantenga el desecador en una incubadora a 34,5 °C, lo que resulta en una humedad relativa del 95% dentro del desecador, similar a las condiciones utilizadas por Collins49.
    NOTA: Casi todos los huevos eclosionarán dentro de las 72 ± 6 horas de cuando se pusieron49,por lo tanto, las tasas de eclosión se pueden evaluar tan pronto como 78 horas después de que los ELP fueron retirados del QMC. Una larva en forma de "C" en la parte inferior de la célula es indicativa de un evento de eclosión exitoso. Alguna variación en este tiempo es posible si, por ejemplo, los huevos son drones y no trabajadores50.

6. Muestreo de trabajadores

  1. Si los MGC se han llenado con exceso de trabajadores, muestree las abejas obreras en un punto de tiempo seleccionado durante el experimento para evaluar los cambios inducidos por el tratamiento en su fisiología. Realice las colecciones junto con las actividades diarias de alimentación y conteo de huevos para minimizar el tiempo durante el cual los MGC están fuera de la incubadora.
  2. Antes del muestreo, coloque un panel de puerta entre un ELP y el interior del QMC, y retire el ELP. Levante con cuidado el panel de la puerta aproximadamente a 0,5 cm de la base de la jaula y retire una abeja obrera del interior del QMC con pinzas de peso pluma. Para evitar que las abejas se escapen, cubra partes de la abertura de 0,5 cm con un dedo enguantado o un trozo de algodón según sea necesario.
  3. Conserve la abeja recolectada para el análisis de seguimiento y repita este proceso hasta que se haya recolectado el número deseado de muestras. Para el análisis de la expresión génica, se recomienda encarecidamente la congelación instantánea de abejas en nitrógeno líquido y el almacenamiento inmediato a -80 °C51.

7. Mortalidad de los trabajadores

  1. Evalúe la mortalidad de los trabajadores durante el experimento contando el número de abejas muertas en la parte inferior de la cámara de alimentación y la cámara de puesta de huevos. Realice esta evaluación junto con la cuantificación diaria de la puesta de huevos.
  2. Usando fórceps, retire cuidadosamente las abejas muertas a través de los orificios del comedero, cubriendo el orificio con un dedo enguantado o un trozo de algodón mientras las pinzas no estén insertadas.
  3. Retire las abejas muertas de la cámara de puesta de huevos levantando cuidadosamente el panel de la puerta aproximadamente a 0,5 cm de la base de la jaula e insertando pinzas. Para evitar que las abejas se escapen, cubra partes de la abertura de 0,5 cm con un dedo enguantado o un trozo de algodón según sea necesario.
  4. Evalúe la mortalidad de los trabajadores al final del experimento eliminando y contando todas las abejas muertas de los MGC utilizando los métodos descritos anteriormente antes de sacrificar a las abejas restantes.
    NOTA: En ausencia de abejas obreras, las reinas no producirán huevos y morirán de hambre dentro de las 24 horas. Por lo tanto, si se observa que todos los trabajadores de un QMC están muertos, el QMC debe eliminarse del experimento. Del mismo modo, si una reina muere durante el experimento, el QMC debe eliminarse y los datos deben censurarse adecuadamente.

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Representative Results

La producción de huevos se monitoreó en CGC ensamblados y mantenidos como se describió anteriormente con observaciones una vez al día de la producción de huevos y 15 jaulas por grupo de tratamiento. Las reinas recién apareadas de ganado carniolan principalmente fueron compradas y enviadas durante la noche a un criador de reinas, y las obreras de abejas melíferas se obtuvieron de 3 colonias mantenidas de acuerdo con métodos comerciales estándar en The Bee Research Facility en la Universidad de Illinois Urbana-Champaign. Aquí, se utilizaron 4 grupos de tratamiento dietético: 1) 50 ppb (g / g) imidacloprid en solución de sacarosa y suplemento de polen (50 ppb - p + s), 2) 10 ppb imidacloprid en solución de sacarosa y suplemento de polen (10 ppb - p + s), 3) 10 ppb imidacloprid en suplemento de polen solo (10 ppb - p), y 4) un grupo de control que recibió una dieta que contiene un volumen equivalente de acetona como los grupos de tratamiento (CTRL).

Los cambios relacionados con el tratamiento en los recuentos diarios de óvulos se evaluaron como se describe en Fine et al.32 con modificaciones menores. Brevemente, se implementó un GEE log-lineal de Poisson con una estructura de matriz de correlación autorregresiva (AR-1) para evaluar los cambios relacionados con el tratamiento en la producción de huevos a lo largo del tiempo. Aquí, la hora (día) se trató como una variable continua y el tratamiento fue categórico. Se utilizaron pruebas post hoc de Wald chi-cuadrado para determinar la significación. Debido a que no se observó ninguna puesta de huevos en el día 1 del experimento, este día se excluyó del análisis para ajustarse a los supuestos del GEE. Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla S1. La producción diaria de huevos fue significativamente menor en los MGC en el grupo de tratamiento de 50 ppb p+s(χ 2= 43,99, p<0,001; Figura 2A).

Las diferencias en el número total de óvulos producidos en los MGC por tratamiento se analizaron mediante una prueba post hoc ANOVA unidireccional y Tukey HSD(Figura 3). Para este análisis, se excluyó cualquier QMC eliminado del experimento antes del final del período de monitoreo de 14 días debido a la muerte de la reina o del trabajador, lo que resultó en N = 13 cada uno para los grupos CTRL y 50 ppb - p + s, N = 14 para 10 ppb - p y N = 15 para 10 ppb - p + s. Se observó un efecto dependiente de la dosis para los tratamientos administrados tanto en sacarosa como en polen, con la mayor reducción en la producción de huevos en relación con el control observada en 50 ppb - p + s seguida de 10 ppb - p + s. No se observaron diferencias en el total de huevos producidos entre CTRL y 10 ppb - p (F3,52= 17.95, p<0.001, Tukey HSD).

El consumo de suplemento de polen y agua se registró cada 48 horas durante 10 días, y el consumo de solución de sacarosa se registró cada 48 horas durante 12 días. Los cambios en las tasas de consumo de dieta se evaluaron utilizando GEEs distribuidos gaussianos con los mismos parámetros descritos anteriormente(Figura 2B-D). Los resultados se resumen en la Tabla S1. Brevemente, las tasas diarias de consumo de sacarosa aumentaron significativamente a medida que avanzaba el experimento(χ 2= 6.03, p = 0.014), pero las tasas de consumo de suplementos de polen disminuyeron(χ 2= 174.98, p<0.001). Se observaron tasas significativamente más altas de consumo de polen cuando se administró imidacloprid a 10 ppb en suplemento de polen solo(χ 2= 21,44, p<0,001) y disminuyeron significativamente cuando se administró a 10 o 50 ppb en suplemento de polen y solución de sacarosa juntos (10 ppb - p + s:χ 2= 6,59, p = 0,010; 50 ppb - p + s: χ2= 14,47, p = 0,0001).

Los huevos se recolectaron de los MGC en el día 7 del experimento, y los cambios en el número de huevos que eclosionaron con éxito después de la exposición materna a tratamientos con agroquímicos se evaluaron utilizando un modelo mixto lineal generalizado (GMLR) con una distribución binomial y la identidad QMC tratada como un efecto aleatorio. La exposición materna a imidacloprid administrado a 10 ppb en polen solo o en solución de polen y sacarosa no afectó las tasas de eclosión de huevos (10 ppb - p+s: Z=-0,139, p=0,290; 10 ppb - p: Z=0,182, p=0,856). No se pudieron evaluar las tasas de eclosión de los huevos puestos por reinas en los MGC provistos de una dieta con 50 ppb con imidacloprid debido a las bajas tasas de producción de huevos en este grupo de tratamiento.

Para este trabajo, todo el análisis estadístico se realizó en R Studio 1.2.5003 (Boston, MA, USA). Las figuras se prepararon utilizando JMP Pro 15 y Photoshop CC 2019 (Adobe Inc., San José, CA). Los datos están disponibles en el archivo complementario S1.

Figure 2
Figura 2. A: Promedio ± huevos SE por día en QMCs. B: Promedio ± suplemento de polen SE, C: solución de sacarosa, D: y agua (g) consumida durante períodos de 48 horas en QMCs. Importancia de los tratamientos (indicado por "*") determinado por GEE y Wald chi-cuadrado post hoc test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Promedio ± suma SE de huevos puestos por tratamiento durante el experimento. Significancia (indicada por letras) determinada por ANOVA y tukey HSD post hoc test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla S1: Resultados de gees que analizan los cambios en las tasas de puesta de huevos y el consumo de dieta en los MGC a lo largo del tiempo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario S1: Haga clic aquí para descargar este archivo complementario.

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Discussion

La fecundidad de las hembras de insectos solitarios, así como de las reinas en las colonias de insectos eusociales, puede estar influenciada por factores estresantes abióticos como los agroquímicos25,28, 29,30,33. En las abejas melíferas, los efectos de los agroquímicos en las reinas pueden ser indirectos, ya que pueden ocurrir a través de cambios en su cuidado y alimentación por parte de las abejas obreras. Nuestros resultados representativos, que son similares a los reportados en un estudio de campo29,demuestran que los efectos de los agroquímicos en el rendimiento de la reina se pueden medir de manera eficiente en un entorno de laboratorio utilizando MGC, generando resultados comparables a los enfoques basados en el campo. Además, estos resultados arrojan luz sobre la influencia del imidacloprid en el consumo de la dieta de los trabajadores y en la viabilidad del huevo.

El imidacloprid tuvo claros efectos negativos en la producción de huevos cuando se administró en solución de sacarosa y suplemento de polen juntos. Esto es similar a los resultados reportados utilizando colmenas de observación provistas con jarabe de imidacloprid y permitidas para alimentarse libremente29. Sin embargo, aquí, se observó una respuesta dependiente de la dosis, con el efecto más pronunciado observado en los MGC provistos con 50 ppb de imidacloprid en relación con la concentración más baja. A diferencia de lo que se informó para las colonias de campo, este grupo experimentó un casi cese de la producción de huevos. Cabe señalar que todas las concentraciones, incluidas las 50 ppb utilizadas en este trabajo, son más altas que los residuos de polen y néctar típicamente observados cuando se aplica imidacloprid como tratamiento de semillas y son más representativas de los residuos encontrados después de las aplicaciones en el suelo40. Ejemplos de plantas relevantes incluyen cucurbitáceas y ornamentales que se encuentran en paisajes urbanos29, y por lo tanto, estos resultados deben interpretarse en este contexto. Adicionalmente, las diferencias observadas entre estos resultados y los generados utilizando colonias de campo, donde los resultados no fueron tan pronunciados, incluso en los grupos de tratamiento más altos, sugieren que al igual que otros ensayos de laboratorio, los MGC pueden ser más sensibles que el uso de colonias de tamaño completo52,lo que debe considerarse al interpretar los datos.

El trabajo previamente informado que examinó la oviposición con la exposición a reguladores de crecimiento de insectos (IGR) en MGC no encontró que los IGR causen reducciones en las tasas de puesta de huevos de reina33,lo que demuestra que la interrupción de la producción de huevos no es una respuesta uniforme al estrés. Aunque las evaluaciones a nivel de campo utilizando colonias de tamaño completo pueden proporcionar una visión más holística de los efectos de los agroquímicos en la salud de las colonias, estos hallazgos sugieren que los MGC tienen el potencial de ser utilizados como una herramienta para identificar productos químicos como el imidacloprid que pueden afectar la oviposición de la reina de la abeja melífera. Cuando se utilizan en el contexto de una estrategia amplia de evaluación de riesgos que tiene en cuenta los patrones de uso, los patrones de exposición y los efectos en otras métricas de la salud de las abejas melíferas, los datos de producción de huevos generados por los MGC pueden producir una comprensión más completa de los efectos potenciales de un agroquímico en las colonias de abejas melíferas.

Además de generar datos cuantitativos de oviposición, los MGC se pueden utilizar para evaluar patrones en el consumo de dieta de los trabajadores y cambios en la fisiología. Aquí, se demostró que 10 ppb imidacloprid en la dieta del polen solo estimula el consumo de suplementos de polen en las obreras en presencia de una reina apareada. Este efecto no se observó en otros tratamientos dietéticos cuando los MGC fueron provistos de imidacloprid tanto en suplemento de polen como en solución de sacarosa, incluso a la misma concentración. Cabe señalar que se pueden obtener estimaciones más precisas de la tasa de consumo mediante el seguimiento de la mortalidad y el ajuste de las medidas de consumo de dieta en función del número exacto de abejas que permanecen en los MGC, pero si la mortalidad es consistentemente baja en todos los tratamientos, se pueden hacer algunas comparaciones. La discrepancia entre los tratamientos en el consumo de una dieta de polen que contenga la misma concentración de imidacloprid puede estar relacionada con la diferencia en la dosis total más alta administrada a las abejas cuando el imidacloprid está presente tanto en la sacarosa como en el suplemento de polen en comparación con cuando está presente en el suplemento de polen solo.

A niveles bajos, hay evidencia de que las abejas melíferas prefieren las fuentes de alimentos que contienen pesticidas neonicotinoides18, y se ha informado que exhiben una preferencia similar por los recursos florales que contienen nicotina53. Se ha sugerido que estas preferencias pueden deberse a las propiedades neuroestimulantes de la nicotina y los neonicotinoides, que activan los receptores nicotínicos de acetilcolinesterasa54 expresados en partes del cerebro de las abejas melíferas implicadas en el aprendizaje y la memoria55. En los ácaros, el imidacloprid estimula el consumo de dieta, lo que resulta en un aumento de la oviposición y la fecundidad22. Aquí, los aumentos relacionados con imidacloprid en el consumo de suplementos de polen no se relacionaron con aumentos en la oviposición, y los efectos de imidacloprid en la fisiología del trabajador en este trabajo aún no se han explorado. Sin embargo, comprender cuánto de una dieta con agroquímicos es probable que consuman las abejas dentro de una colonia, particularmente las obreras que requieren más polen en su dieta para aprovisionar activamente a una reina ponedora56,puede ayudar a informar el riesgo de un agroquímico a varios aspectos del rendimiento de la colonia.

El imidacloprid no causó ningún cambio medible en la viabilidad embrionaria, según lo medido por las tasas de eclosión en huevos recolectados de MGC provistos con 10 ppb de imidacloprid en suplemento de polen solo o tanto en suplemento de polen como en solución de sacarosa. Esto difiere de las disminuciones en las tasas de eclosión de huevos reportadas después de la exposición a IGR enlos CMC 33,demostrando nuevamente que los CMC se pueden usar para examinar aspectos específicos y diversos de la fecundidad de la reina. El imidacloprid es altamente soluble en agua y es probable que las abejas lo metabolizen y excreten de manera diferente a los agroquímicos más solubles en grasa como los IGR57,que pueden ser eliminados transovarialmente58,59,60,61 hasta cierto punto, lo que resulta en efectos sobre el desarrollo embrionario. Alternativamente, el imidacloprid, que es una neurotoxina36, puede no afectar a los embriones en desarrollo de la misma manera que los IGR, que se dirigen a las vías asociadas con el desarrollo de insectos62.

Una pregunta comúnmente hecha por los investigadores que buscan comprender los efectos de los agroquímicos en la reproducción de las abejas melíferas es si las reinas adultas, que dependen de las obreras para suministrarlas secreciones glandulares como alimento9,63,están directamente expuestas a residuos agroquímicos. Esto no se exploró y no está representado en los resultados informados aquí. Sin embargo, los residuos agroquímicos en las secreciones glandulares de los trabajadores suelen reducirse en gran medida en relación con lo que se aprovisiona a los trabajadores en los escenarios de alimentación controlada de colonias64. Del mismo modo, cuando las colonias de tamaño completo fueron expuestas a concentraciones de imidacloprid que resultaron en una disminución de la oviposición, no se detectaron residuos en las reinas29,lo que sugiere que los cambios en las tasas de oviposición observados en el trabajo referenciado se debieron a la exposición directa a pequeñas cantidades que se excretaron fácilmente, o que los efectos observados en las reinas se debieron a los efectos del imidacloprid en las obreras responsables del cuidado y aprovisionamiento de la reina. El método presentado aquí permite el muestreo de abejas obreras que se sabe que han ingerido la dieta tratada desde la eclosión adulta hasta el momento del muestreo. El trabajo de seguimiento que examina los efectos del imidacloprid en la fisiología de las abejas obreras muestreadas del experimento descrito ayudará a dilucidar esta pregunta.

En resumen, los métodos presentados aquí permitirán a los investigadores evaluar mejor el riesgo de agroquímicos para las abejas melíferas mediante la evaluación de puntos finales relacionados con la fecundidad, la supervivencia y el desarrollo de las abejas melíferas. La técnica descrita tiene el potencial de mejorar en gran medida la evaluación del riesgo de agroquímicos mediante la generación de datos cuantitativos relacionados con la fecundidad de la reina que pueden ser difíciles y de adquirir recursos utilizando experimentos de campo y semicampo. Además, la presencia de una reina ponedora agrega realismo a los experimentos realizados en trabajadores jóvenes, que suelen ser los miembros de la colonia responsables del cuidado y la alimentación de la reina9. Usando esta técnica, los riesgos de los agroquímicos en la salud, la longevidad y el rendimiento de las colonias de abejas melíferas se pueden predecir y mitigar mejor.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Gracias a la Dra. Amy Cash-Ahmed, Nathanael J. Beach y Alison L. Sankey por su ayuda en la realización de este trabajo. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. El USDA es un proveedor y empleador de igualdad de oportunidades. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa # HR0011-16-2-0019 a Gene E. Robinson y Huimin Zhao, el proyecto 2030-21000-001-00-D del USDA, y la Experiencia de Investigación de Plasticidad Fenotípica para Estudiantes de Colegios Comunitarios en la Universidad de Illinois en Urbana Champaign.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluon BioQuip, Rancho Dominguez, CA 2871A
Honey bee queens Olivarez Honey Bees, Orland, CA
Imidacloprid Sigma-Aldritch, St. Louis, MO 37894
MegaBee Powder MegaBee, San Dieago, CA
Microcentrifuge tubes 2 mL ThermoFisher Scientific, Waltham, MA 02-682-004
Needles 20 gauge W. W. Grainger, Lake Forest, IL 5FVK4
Potassium Sulfate Sigma-Aldritch, St. Louis, MO P0772
Queen Monitoring Cages University of Illinois Urbana-Champaign Patent application number: 20190350175
Sucrose Sigma-Aldritch, St. Louis, MO S8501
Universal Microplate Lids ThermoFisher Scientific, Waltham, MA 5500

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Biología Número 169
Evaluación del riesgo agroquímico para las reinas de abejas melíferas apareadas
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Fine, J. D., Torres, K. M., Martin,… More

Fine, J. D., Torres, K. M., Martin, J., Robinson, G. E. Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens. J. Vis. Exp. (169), e62316, doi:10.3791/62316 (2021).

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