Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الجينات تدق في كريسبر / Cas9 وفرز الخلايا في خطوط الخلايا الماكروفاج و تي

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

يستخدم هذا البروتوكول المراسلات الفلورية وفرز الخلايا لتبسيط التجارب في الماكروفاج وخطوط الخلايا التائية. وتستخدم اثنين من البلازميدات لهذه التجارب المبسطة في طرق، وهي CRISPR/Cas9- وDsRed2 التعبير عن البلازميد وplasmid المانحة إعادة التركيب متجانسة التعبير عن EBFP2، والتي يتم دمجها بشكل دائم في مكان Rosa26 في الخلايا المناعية.

Abstract

تتطلب دراسات الجينوم الوظيفية للجهاز المناعي التلاعب الجيني الذي ينطوي على حذف الجينات المستهدفة وإضافة عناصر إلى البروتينات ذات الاهتمام. تحديد وظائف الجينات في نماذج خط الخلية مهم لاكتشاف الجينات واستكشاف الآليات الجوهرية للخلايا. ومع ذلك ، فإن التلاعب الجيني للخلايا المناعية مثل الخلايا التائية وخطوط خلايا الضامة باستخدام CRISPR / Cas9 بوساطة طرق في صعبة بسبب انخفاض كفاءة العدوى من هذه الخلايا ، وخاصة في حالة هادئة. لتعديل الجينات في الخلايا المناعية، يتم استخدام اختيار مقاومة الأدوية والنواقل الفيروسية عادة لإثراء الخلايا التي تعبر عن نظام CRIPSR/Cas9، مما يؤدي حتما إلى تدخل غير مرغوب فيه للخلايا. في دراسة سابقة، قمنا بتصميم المراسلين الفلوريين المزدوجين إلى جانب CRISPR/Cas9 التي تم التعبير عنها بشكل عابر بعد الصعق الكهربائي. هذا الحل التقني يؤدي إلى حذف الجينات بسرعة في الخلايا المناعية; ومع ذلك ، فإن طرق الجينات في الخلايا المناعية مثل الخلايا التائية والكوافير دون استخدام اختيار مقاومة الأدوية أو ناقلات الفيروسات هو أكثر تحديا. في هذه المقالة، نظهر أنه باستخدام فرز الخلايا للمساعدة في اختيار الخلايا التي تعبر بشكل عابر عن بنيات CRISPR/Cas9 التي تستهدف مكان Rosa26 بالاشتراك مع بلازميد المانح، يمكن تحقيق طرق الجينات في كل من الخلايا التائية وال الضامة دون إثراء مقاومة للأدوية. وكمثال على ذلك، نعرض كيفية التعبير عن ACE2 البشري، وهو مستقبل للسارس-كوف-2، المسؤول عن وباء كوفيد-19 الحالي، في الضامة RAW264.7 من خلال إجراء تجارب طرق. يمكن استخدام هذه الخلايا الجينية على نطاق واسع للدراسات الميكانيكية.

Introduction

الخلايا المناعية حاسمة للدفاع ضد مسببات الأمراض. مطلوبة على حد سواء المناعة الفطرية والتكيفية لإزالة المصابات والحفاظ على التوازن النسيج1،2. نماذج خط الخلية هي أدوات أساسية لفهم الأسس الجزيئية للجهاز المناعي الثدييات. يتم استخدامها في المقايسات الوظيفية في المختبر ، مثل تلك التي تصمم تنشيط الخلايا التائية البشرية ، وفي تحديد وظيفة العوامل الوراثية في تنشيط أو تخفيف الاستجابات المناعية3،4. من المهم ملاحظة أن جهاز المناعة الثديي غير متجانس بشكل كبير ، وبنفس القدر من الأهمية ، يتحكم عدد كبير من الجزيئات في التمايز والهجرة ووظيفة نوع الخلية المحدد5،6.

تتجمع بانتظام قصيرة باليندروميك يكرر (CRISPR) / Cas9 أدوات تحرير الجينوم تسمح للتلاعب الجيني لأنواع الخلايا المحددة، مما يسهل التعليق الوظيفي للجينات بطريقة دقيقة7،8. وقد وصفت العديد من البروتوكولات المنشورة تسليم CRISPR / Cas9 في شكل مجمعات الحمض النووي الريبي Cas9 دليل المعروفة باسم ريبونوكليوبروتس (RNPs) في خلايا HEK293، خطوط الخلايا جوركات، الخلايا التائيةالأولية 9،10،الضامة11،12،13،الخلايا الجذعية14،وغيرها15،16. في هذه البروتوكولات ، يتم عادة وضع علامات الجينات عن طريق دمج علامة الفلورسنت إلى البروتينات الذاتية17،18. ومع ذلك بذلت محاولات قليلة لاستخدام المراسلين الفلورسنت المزدوج، والتي تتوافق مع فرز خلية واحدة، لتسهيل التجارب طرق في19،20،لا سيما في الخلايا المناعية.

تتطلب التحليلات الميكانيكية المتعمقة التي تهدف إلى فهم وظائف عامل وراثي جديد في الخلايا المناعية بشكل عام حذف جين معين من نوع الخلية ، وتجارب الإنقاذ الجيني ، وتحديد تفاعله بشكل مثالي. على الرغم من أن أساليب التحسين من الحذف الجيني للجينات في الخلايا المناعية قد نشرت9،15،21، تم الإبلاغ عن طرق أقل بكثير لإدخال أليليس طرق في وظائف متعددة لفهم الاستجابة المناعية. لذلك، نهدف في هذا البروتوكول إلى وصف بروتوكول فعال وقابل للاستنساخ بشكل كبير للتعبير عن بروتين مهم (POI) في مكان الميناء الآمن Rosa26 في كل من خطوط الخلايا المناعية البشرية والمرينية. صممنا نظام مراسلة من لونين لإثراء الخلايا المصابة بلازميدات تعبر عن CRISPR/Cas9 (DsRed2) وقالب الحمض النووي المؤتلف (EBFP2) ، والذي يمكن عزله عن طريق فرز الخلايا. بعد هذا البروتوكول، حصلنا على عدة خطوط طرق في خط الخلية التائية البشرية جوركات ومورين macrophage RAW264.7 للتحليلات الوظيفية للبروتينات درس بشكل سيئ.

كمثال على ذلك، نعرض في هذا البروتوكول كيفية الحصول على الضامة RAW264.7 التي تعبر بشكل ثابت عن ACE2 البشري (مستقبلات سارس-كوف-2)22. لأن الخلايا المناعية الفطرية تشارك في الإمراض من Covid-1923،24 ويعتبر ACE2 الإنسان كم مستقبلات رئيسية مطلوبة للدخول الفيروسي إلى الخلايا قبل النسخ المتماثل ، يمكن أن تكون الضامة مع طرق في ACE2 الإنسان بمثابة أداة مفيدة للدراسات الميكانيكية للتكاثر الفيروسي داخل الضامة. بالتوازي، نقدم أيضا مثالا على طرق في جين في مكان ROSA26 الإنسان للتعبير عن البروتين RASGRP1، الذي تم تنصهر في نهاية الأمينية مع تقارب التوأم ستريب العلامة (OST). الخلايا التائية هي الخلايا المستهدفة الرئيسية في العلاجات المناعية، وقد ركز عدد متزايد من الدراسات على التلاعب في استجابتها للسرطان25،26. كما Rasgrp1 ومن المعروف أن جزيء الإشارات الرئيسية المصب لمستقبلات الخلايا التائية والتفاعل لها ليست واضحة جيدا27، وOSST -RASGRP1 ضرب في نموذج يوفر الأساس لتحديد interactors تنظيم استجابة الخلايا التائية للأورام والعدوى. ويمكن استخدام هذه الأدوات معا لدراسات كوفيد-19 واكتشاف جزيئات جديدة تتفاعل مع Rasgrp1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم وبناء البلازميد من sgRNAs استهداف روسا26 لوكو

  1. دليل التصميم RNAs حول موقع الإدراج المطلوب
    1. تأكد من أن موقع الإدراج ل Rosa26 الماوس (فيما يلي يسمى mRosa26) تجارب knock-in يقع في intron الأول من mRosa26; وقد استخدم هذا الموقع في الدراسات السابقة28،29. للتجارب طرق في الخلايا البشرية، وضمان أن موقع الإدراج يقيم في مكان ROSA26 الإنسان (يشار إليها فيما بعد باسم hROSA26)،والتي تم تحديدها على أنها المثلية البشرية من mRosa2630.
    2. استخدم التسلسلات الجينومية للفأرة والأنواع البشرية التي تم الحصول عليها من معلوماتية الجينوم الماوس (http://www.informatics.jax.org/) ومتصفح الجينوم Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) ، على التوالي. نسخ 50 زوجا أساسيا (bp) من التسلسل الجينومي لموقع mRosa26 أو hROSA26 على كل جانب يحيط بموقع الإدراج المطلوب.
    3. تصميم دليل RNAs باستخدام أداة الويب على الانترنت CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. لصق 100 نقطة أساس من تسلسل الإدخال من 1.1.2. حدد اثنين من RNAs دليل مع درجة عالية التحديد، ودرجة كفاءة عالية، وانخفاض النشاط خارج الهدف. بالإضافة إلى ذلك، اختر أدلة الجيش الملكي النيبالي مع أعلى Doench عشرات وتجنب تلك التي وصفت بأنها "غير فعالة"32.
      ملاحظة: أدوات تصميم CRISPR البديلة هي أيضا قيمة ومتاحة للجمهور، على سبيل المثال أداة تصميم Benchling CRISPR (https://benchling.com/crispr). لزيادة وتيرة CRISPR/Cas9 بوساطة ضرب في الخلايا المتحولة، حدد اثنين من RNAs دليل قريب من موقع الإدراج المطلوب عندما يكون ذلك ممكنا33.
    4. بالنسبة إلى موقع mRosa26، استخدم اثنين من الرناسات الإرشادية المجاورة المعينة على أنها mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTCTCTAGAAGAT -3') و mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3')(الشكل 1A). بالنسبة إلى الموضع hROSA26، استخدم اثنين من الرناسات الإرشادية المجاورة، وهما hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGACACGCG -3') وhR26-sg2 (5'- AATCGAGAGGACTCGACA -3')(الشكل 1B).
      ملاحظة: تم تقييم أنشطة تحرير الجينوم من mR26-sg1 و mR26-sg2 وتلك hR26-sg1 و hR26-sg2 في خلايا RAW264.7 وخلايا جوركات، على التوالي (انظر الملف التكميلي، الشكل S1).
  2. استنساخ ناقلات التعبير CRISPR التي تحتوي على SgRNA استهداف مكان Rosa26
    1. توليف إلى الأمام وعكس oligos لدليل واحد الجيش الملكي النيبالي (انظر ملف تكميلي).
      ملاحظة: من الأفضل إضافة نويدات "G" إلى بداية تسلسل الدليل، مما يساعد على التعبير الذي يحركه مروج U6. على سبيل المثال، لاستنساخ mR26-sg1 المذكورة أعلاه، وإلى الأمام القلة هو CACCGCTCCAGTCTCTAGAAGAT والقلة العكسي هو AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. ويشار إلى G إضافية في أوليغو إلى الأمام ومكملها في أوليغو العكسي في جريئة.
    2. استنساخ oligos الاصطناعية المقابلة لدليل RNAs في الكل في واحد CRISPR التعبير المتجه pX458-DsRed2 ولدت في عملنا السابق21 (الشكل 1C)باستخدام البروتوكول العام لاستنساخ الحمض النووي الريبي التي وضعتها مختبر تشانغ (https://www.addgene.org/crispr/zhang/)؛ ومع ذلك، تخطي خطوة تنقية هلام وتنقية ناقلات هضم باستخدام عدة تنقية PCR (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: في البروتوكولات السابقة، تم تنفيذ تنقية هلام المتجه المهضوم BbsI؛ ومع ذلك، تستغرق هذه الخطوة وقتا طويلا. في هذا البروتوكول، يتم تنقية المنتج المهضوم باستخدام عدة تنقية PCR ويستخدم مباشرة لرد فعل الربط المصب، والتي تنتج عموما مستعمرات إيجابية مع كفاءة مماثلة.
    3. تحويل 10 ميكرولتر من المنتج ربط (الخطوة 1.2.2) إلى 50 ميكرولتر من الخلاياالمختصة إشريكيا القولونية DH5α وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اختيار عشوائيا ثلاث مستعمرات من لوحة أجار LB مع أمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) وتطعيم كل إلى 3 مل من المتوسط LB مع أمبيسلين لغرس بين عشية وضحاها.
    4. استخدام 1 مل من الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها لتسلسل سانجر والحفاظ على بقية في 4 درجة مئوية حتى يتم تأكيد بناء ليكون صحيحا: pDsR-mR26-sg1 وpDSR-mR26-sg2 ل mRosa26 مكان طرق في، وpDSR-hR26-sg1 وpDSR-hR26-sg2 لجراد hROSA26.
    5. إعداد تركيز عال من الحمض النووي البلازميد (حوالي 2 ميكروغرام / ميكرولتر) مع مجموعة ماكسيبريب لتنقية البلازميد من الدرجة transfection (انظر جدول المواد).

2. تصميم وبناء استهداف ناقلات قوالب إعادة التركيب متجانسة

  1. تصميم قالب إصلاح موجهة homology
    1. تصميم متجه استهداف للتعبير بشكل أساسي عن POI باستخدام كاسيت تعبير محسن من دراسة سابقة29، والتي تشمل مروج هجين CAG ، وموقع تقييد AscI يسمح باستنساخ cDNA من POI ، ومراسل IRES-EBFP2 ، وإشارة هرمون النمو البقري polyadenylation (bGH-polyA) (الشكل 1B والملف التكميلي).
    2. تصميم أسلحة التماثل (HAs) التي تشترك في علم الأوهام مع التسلسلات الجينومية للجراد mRosa26 أو hROSA26. تضمين ~ 1 كيلوبايت من 5 'HA المقابلة لتسلسل الجينوم المنبع من موقع الإدراج المطلوب إلى يسار كاسيت التعبير. وبالمثل، قم بتضمين ~ 1 كيلوبايت من 3 'HA المقابلة لتسلسل الجينوم المصب من موقع الإدراج إلى يمين كاسيت التعبير.
      ملاحظة: يتم إدراج كاسيت التعبير أقرب ما يمكن إلى مواقع الانقسام CRISPR/Cas934. لتجنب إعادة قطع الأليل المستهدف بواسطة CRISPR/Cas9 ، قم بدمج تغييرات النيوكليوتيدات في تسلسل الزخارف المجاورة ل protospacer (PAM) (5'NGG-3') في متجه الاستهداف34،35.
    3. للسماح الخطية من المتجه استهداف، إدراج موقع EcoRI فريدة من نوعها فقط المنبع من 5 'HA وموقع BamHI فريدة من نوعها فقط المصب من 3 'HA.
    4. يكون بائع تجاري توليف المتجهات استهداف وتعيينها pKR26-iBFP وpKhR26-iBFP ل mRosa26 و hROSA26 طرق في، على التوالي.
  2. إنشاء متجه استهداف كقالب إصلاح موجه بالهومولوجيا
    1. للتعبير عن POI، احصل على تسلسل cDNA (تسلسل الترميز) من متصفح الجينوم Ensembl واختر النص الذي يمتلك أطول تسلسل بروتين. على سبيل المثال، cDNA من الجين ACE2 الإنسان هو ACE2-202 ENST00000427411.2 وcDNA من الجين RASGRP1 الإنسان هو RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. توليف cDNA من POI بمساعدة بائع تجاري. ومن الممكن أيضا استنساخ cDNA عن طريق تضخيم PCR (غير موضح هنا). ضع تسلسل GGCGCGCCACC (5' - 3') ، والذي يتضمن موقع تقييد AscI (مائل وجريء) وموقع بدء الترجمة التوافقية Kozak (مسطر) ، مباشرة قبل بدء ATG codon من cDNA وموقع تقييد AscI آخر (5'- GGCGCGCC -3') بعد وقف codon من cDNA.
    3. هضم تسلسل توليفها مع ASCI وتنقية باستخدام مجموعة تنقية PCR مصممة لتنقية شظايا الحمض النووي بعد تقييد الهضم، وفقا لتعليمات الشركات المصنعة (انظر جدول المواد).
    4. Ligate إدراج cDNA المنقى في ناقلات العمود الفقري الخطية AscI pKR26-iBFP أو pKhR26-iBFP باستخدام T4 الحمض النووي ليغانيس اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    5. تحقق من موجه الاستهداف النهائي pKR26-POI-iBFP أو pKhR26-POI-iBFP، عن طريق التسلسل. استخدام maxprep لتنقية البنى التحقق وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    6. هضم المتجه المستهدف باستخدام EcoRI أو BamHI وتنقية منتج الهضم باستخدام عدة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تخزين متجه الاستهداف الخطي (~ 0.8 ميكروغرام/ميكرولتر) عند -20 درجة مئوية حتى الكهرومporation.

3. الكهرومربوجين من الماكروفاج وخطوط الخلية تي

  1. إعداد ثقافات الخلايا للكهرومporation
    1. إعداد معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) كوسيلة نمو كاملة لخلايا جوركات T. إعداد دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM) مع 10 ٪ FBS لزراعة الضامة RAW264.7. تكملة جميع وسائل الإعلام نمو كامل مع 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل streptomycin (القلم / ستريب) باستثناء وسائل الإعلام المستخدمة لاحتضان ما بعد العدوى قبل فرز الخلية.
    2. إجراء زراعة فرعية لخلايا RAW264.7 وJukat T وفقا لتعليمات المورد (انظر جدول المواد). عند إجراء زراعة فرعية لخلايا RAW264.7، استخدم محلول التريبسين-EDTA (0.25٪) استخدام FBS تكملها مع 10٪ (v/v) DMSO كوسيلة لالتبريد لRAW264.7 وخلايا جوركات.
    3. جمع الخلايا في 250 × غرام لمدة 5 دقائق لRAW264.7 الضامة و 90 × غرام لمدة 8 دقائق لخلايا T جوركات. ثم يغسل مع 5-10 مل من 1× DPBS (دون Ca2 + أو ملغ2 + الأيونات). إزالة DPBS.
    4. إعادة إنفاق بيليه الخلية باستخدام 2 مل من 1× DPBS. استخدام 10 ميكرولتر من الخلايا وتخلط مع حجم متساو من 0.2٪ تريبان الأزرق لتقدير عدد الخلايا وقابلية البقاء.
      ملاحظة: تأكد من أن ثقافة الخلية قد >90٪ صلاحية في يوم من transfection.
    5. لإجراء تجربة واحدة، قم بإجراء الكهربوسيفيشن مع 10 نصائح للنيوكليوفكشن 10 ميكرولتر مع خمسة تكرارات. حساب حجم اللازمة ل2.0 × 106 خلايا والكريه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. غسل بيليه الخلية مرة أخرى مع 1× DPBS كما هو موضح في الخطوة 3.1.3.
      ملاحظة: عند استخدام 10 ميكرولتر نصائح النيوكليوفكشن، هناك حاجة إلى 4.0 × 105 خلايا لكل كهربائي. وبناء على ذلك، إعداد ما لا يقل عن 2.0 × 106 خلايا لتجربة واحدة طرق في.
    6. إعداد لوحة 24 جيدا مع 0.5 مل من متوسط النمو الكامل (أعدت في الخطوة 3.1.1) لكل بئر دون القلم / ستريب وprewarm في حاضنة 37 درجة مئوية.
  2. الكهرومربوكهربائية لمكونات CRISPR/Cas9 وناقل الاستهداف
    1. قم بتشغيل نظام الكهرومporation. استخدام معلمات الكهربوكتروبوين الأمثل في دراسة سابقة21: 1400 V/20 ms/2 البقول لRAW264.7 الضامة و 1350 V/20 مللي ثانية / 2 نبض لخلايا جوركات T.
    2. مع مراعاة فقدان العينة بسبب الأنابيب، قم بإعداد خليط كهربية 55 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل يحتوي على 2.5 ميكروغرام من كل ناقل CRISPR/Cas9، و2.4 ميكروغرام من متجه الاستهداف الخطي، وحاجز Resuspension Buffer R.
      ملاحظة: لتوفير الوقت، يمكن تحضير خليط الكهربوجين أثناء الطرد المركزي (الخطوة 3.1.5).
    3. Resuspend 2.0 × 106 خلايا (أعدت في الخطوة 3.1.5) في خليط 55 ميكرولتر الكهربائي من الخطوة 3.2.2.
    4. يستنشق خليط الخلية/الكهربورات من الخطوة 3.2.3 باستخدام طرف النيوكليوفكشن 10 ميكرولتر مع ماصة.
      ملاحظة: أثناء الأنابيب، تجنب إدخال فقاعات الهواء، والتي قد تسبب فشل الكهرومporation.
    5. أضف العينة إلى أنبوب مملوء ب 3 مل من المخزن المؤقت E من مجموعة الكهرومporation.
    6. تطبيق معلمات الكهربومايشن نوعي الخلية كما هو موضح في الخطوة 3.2.1.
    7. نقل العينة إلى بئر واحد من لوحة 24 جيدا مع المتوسطة prewarmed من الخطوة 3.1.6.
    8. كرر الخطوات 3.2.4-3.2.7 للتكرار الأربعة الأخرى وكذلك موجه الاستهداف فقط وناقل التعبير CRISPR يتحكم فقط.
      ملاحظة: تغيير طرف النوى وأنبوب عند التبديل إلى نوع خلية مختلفة / الحمض النووي البلازميد.
    9. زراعة الخلايا المصابة لمدة 48-72 ساعة للسماح بالاسترداد بعد الكهرومربوز والتعبير عن مكونات CRISPR/Cas9 قبل تحليل قياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS). فحص التعبير عن DsRed2 باستخدام المجهر الفلوري مجهزة قناة حمراء في 24 ساعة بعد العدوى.
      ملاحظة: من فوائد مراقبة خلايا الفلورسنت DsRed2 أنه يمكن تقدير كفاءة الكهرومporation ويمكن التنبؤ بمدى ملاءمة المزيد من فرز الخلايا.

4. فرز الخلية لعزل المفترضة ضرب في الخلايا

  1. قبل فرز FACS، اغسل الخلايا المصابة مرة واحدة مع متوسط النمو الكامل. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 3.1.3 وإعادة إنفاق بيليه في 500 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة.
  2. تعيين فرز الخلية (الموجود في خزانة السلامة الحيوية) مع فوهة 85 ميكرومتر ومعدل تدفق منخفض. حدد وضع "الخلية المفردة" لفرز واختبار كفاءة ودقة فرز الخلية الواحدة عن طريق فرز 20-30 خلية على غلاف لوحة صغيرة 96 جيدا. قطرة واحدة مترجمة في وسط كل بئر يشير إلى الإعداد السليم للأداة.
  3. نقل تعليق الخلية من الخطوة 4.1 إلى أنابيب FACS العقيمة وإضافة SYTOX الأحمر بقعة الخلية الميتة إلى تركيز نهائي من 1 nM.
  4. تحليل عينات على sorter الخلية. SYTOX الأحمر وEBFP2 متحمسون من قبل ليزر 405 نانومتر والكشف عنها من قبل V450/BV421 وقنوات APC، على التوالي. DsRed2 متحمس من قبل ليزر 488 نانومتر والكشف عنها من قبل قناة PE. استخدام الخلايا غير المصابة وEBFP2- و DsRed2-واحد الخلايا الإيجابية كعناصر تحكم للتعويض الطيفي.
  5. فرز 10 خلايا واحدة في كل بئر من لوحة صغيرة 96 جيدا تحتوي على 150 ميكروغرام لكل بئر من المتوسط النمو الكامل قبل الحارة. استخدم لوحات صغيرة مستديرة أسفل لزراعة خطوط الخلايا المعلقة مثل خلايا Jurkat T واللوحات الدقيقة السفلية المسطحة لل الضامة RAW264.7 الملتصقة.
    ملاحظة: فرز 10 خلايا لكل بئر هو استراتيجية محسنة لتحسين بقاء الخلية وتقليل عدد اللوحات الدقيقة التي تحتاج إلى بذر وعدد العينات التي تحتاج إلى فحص عن طريق قياس التدفق الخلوي وال جينوتيبينج؛ إذا كان فرز خلية واحدة فقط لكل بئر، بذر أكثر microplates مطلوب لزيادة فرصة الحصول على خلايا تحريرها بشكل صحيح.

5. فحص والتحقق من صحة إيجابية ضرب في الخلايا

  1. فحص الخلايا المرشحة عن طريق قياس التدفق الخلوي
    1. احتضان الخلايا من الخطوة 4.5 لمدة 10-15 يوما وإضافة متوسط النمو الكامل كل 3 أيام ليحل محل السائل المفقود من خلال التبخر. بالنسبة لخلايا Jurkat T ، نقل الخلايا المزروعة في الجزء السفلي المستدير من لوحة 96 جيدا إلى لوحة سفلي مسطحة لتحسين انتشار الخلايا.
    2. نقل الخلايا المفرزة الموسعة إلى لوحات 48 بئرا لمزيد من التوسع.
    3. عندما تكون الخلايا قريبة من الالتقاء، استخدم نصف الثقافة لفحص تعبير EBFP2 عن طريق قياس التدفق الخلوي(الشكل 3). عادة، نصف الثقافة في لوحة 48 جيدا بعد نمو التقاء يعادل 0.5-1.0 × 105 خلايا، وهو ما يكفي لتحليل عينة واحدة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    4. نقل الخلايا المتبقية إلى لوحات 24 بئرا لمزيد من الانتشار.
    5. الحفاظ على مجموعات الخلايا المرشحة التي تمتلك نسبة عالية من الخلايا الإيجابية EBFP2 لمزيد من تجارب الإبادة الجماعية.
      ملاحظة: نظرا لفرز 10 خلايا في كل بئر من اللوحة الدقيقة ذات ال 96 بئرا، فمن الممكن أن تنمو الخلايا المقتحمة مع الخلايا التي لا تعبر عن الجين الضربة القاضية. لذلك، فمن الطبيعي إجراء جولة إضافية من فرز الخلايا لفصل الخلايا الإيجابية EBFP2 من الخلايا السلبية.
  2. فحص المرشح ضرب في الخلايا عن طريق PCR والتسلسل
    1. جمع 2 × 105 خلايا مرشح. استخراج الحمض النووي الجينوم باستخدام مجموعة الإعدادية الحمض النووي (انظر جدول المواد).
    2. للتحقق من أن إصلاح موجهة homology دقيقة (HDR) قد حدث في مكان MRosa26 بدلا من مواقع عشوائية في الجينوم من الخلايا المرشحة ضرب في, أداء PCR مع التمهيديات التي تمتد على كل جانب من HAs (الشكل 4). اختر التمهيدي الموجود في منطقة الجينوم خارج متجه الاستهداف (أوليغو خارجي) والتمهيدي الآخر الموجود داخل متجه الاستهداف (أوليغو داخلي).
      ملاحظة: يتم استخدام تصميم مشابه للتحقق من HDR في الموضع hROSA26. كما يمكن تصميم مبرمجات PCR بسهولة للكشف عن إدراج تسلسل POI. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن الأنماط الجينية الأليلية البرية من النوع والضربات القاضية في وقت واحد باستخدام PCR ثلاثية التمهيدي (انظر الملف التكميلي، الشكل S2).
    3. استنساخ منتجات PCR إيجابية باستخدام مجموعة استنساخ سريع (انظر جدول المواد). تحويل خليط التفاعل إلى خلايا DH5α المختصة.
    4. اختيار عشوائيا 8-10 المستعمرات البكتيرية الفردية لكل تحويل وتسلسل منتجات PCR من الخطوة 5.2.3 بواسطة تسلسل سانجر.
  3. التحقق من صحة الخلايا الإيجابية عن طريق تحليل اللوت المناعي وتنقية التقارب
    ملاحظة: تخضع الخلايا المرشحة لتحليل مناعة للتحقق من إدراج مؤشر البوي، أو تنقية التقارب (AP) لدراسات التفاعل بين البروتين والبروتين.
    1. إجراء تحليل مناعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للأجسام المضادة. انظر جدول المواد للحصول على معلومات بشأن استخدام الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية.
    2. موضوع lysates من الخلايا طرق في التعبير عن POI OST الموسومة إلى AP باستخدام حبات سيبهاروز ستريب-تاكتين اتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    3. الكشف عن chemiluminescence باستخدام الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد البروتوكول المذكور أعلاه لإجراء تجارب طرق في موقع mRosa26 باستخدام الضامة RAW264.7 مورين، صممنا متجه استهداف للتعبير عن ACE2 الإنسان، وهو مستقبل لفيروس سارس-كوف-2(الشكل 2A). باستخدام تصميم مماثل، ونحن ولدت الإنسان الخلايا T Jurkat مع طرق في من البروتين الانصهار RASGRP1 الموسومة OST(الشكل 2C). بعد نقل ثلاثة البلازميدات، اثنان منها استخدمت للتعبير عن CRISPR/Cas9 (DsRed2؛ pDsR-mR26-sg1 وpDsR-mR26-sg2 لmRosa26 ضرب في؛ pDsR-hR26-sg1 و pDsR-hR26-sg2 للطرق hROSA26) وآخر يستخدم كنموذج الحمض النووي لإعادة التركيب المتجانس (EBFP2)، تم فرز خلايا إيجابية مزدوجة تعبر عن اثنين من المراسلين الفلورية في لوحة من 96 بئرا. من الخلايا RAW264.7 فرزها باستخدام وضع فرز خلية واحدة، 0.91٪ كانت DsRed2+ EBFP2+، ولكن تم جمع 10 خلايا في كل بئر(الشكل 2B). كان لخلايا Jurkat T كفاءة أعلى في العدوى ، وكانت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية المزدوجة 7.91٪ في هذه التجربة التمثيلية ، مما يدل على نجاح ضرب بروتين الانصهار OST-RASGRP1(الشكل 2D).

في الخطوة التالية، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لفحص الآبار المرشحة مع خلايا إيجابية EBFP2. وأظهرت مخططات بيانية تمثيلية أن هناك مجموعات سكانية واضحة إيجابية EBFP2(الشكل 3). ومن الجدير بالذكر أن الخلايا ضرب في لم تعبر DsRed2 عندما تم إجراء قياس التدفق الخلوي بعد أسبوعين من فرز الخلايا.

للتمييز من طرق دقيقة والإدخال العشوائي، تم اختبار الحمض النووي الجينومي من الخلايا الإيجابية EBFP2 من خلال أداء PCR مع التمهيديات الاعتراف تسلسل الجينوم الخارجية لHAs من المتجه استهداف ومنطقة محددة داخل كاسيت التعبير(الشكل 4A و 4B). وأكد تحليل تسلسل هذه المنتجات PCR حدوث HDR في الموقع الهدف mRosa26 (الشكل 4C). يمكن تطبيق نفس استراتيجية الكتابة الجينية للتحقق من صحة الإدراج الدقيق لكاسيت التعبير في موضعhROSA26 لخلايا Jurkat T.

للحصول على مجموعة نقية من hACE2 التعبير عن RAW264.7 الخلايا، ونحن كذلك فرز الخلايا والتحقق من وجود المراسلين الفلورسنت بعد التوسع باستخدام خلايا من النوع البري كضوابط (الشكل 5A). كانت الخلايا الموسعة إيجابية EBFP2 ، وكان بروتين hACE2 يمكن اكتشافه بسهولة في الضامة RAW264.7 المرين(الشكل 5B و 5C). وبالمثل، قمنا بالتحقق من صحة التعبير عن المراسلين الفلورية وبروتين OST-RASGRP1 في خلايا جوركات T البشرية بعد الفحص وجولة ثانية من فرز الخلايا(الشكل 6A و 6B). وبالإضافة إلى ذلك، تم تنفيذ تنقية تقارب البروتين OST-RASGRP1 باستخدام الخرز المتاحة تجاريا. وجدنا كمية أعلى من البروتين RASGRP1 في مجموع الخلايا lysates من الخلايا Jurkat طرق في تلك التي من الخلايا البرية من نوع; RASGRP1 خروج المغلوب الخلايا جوركات استخدمت كضوابط (الشكل 6C). بعد تنقية باستخدام علامة OST، فقط في طرق في عينات كان RASGRP1 للكشف(الشكل 6D).

Figure 1
الشكل 1. استراتيجية استهداف الجينات لتوليد mRosa26/hROSA26 طرق في خطوط الخلية الإفراط في التعبير عن بروتين من الفائدة. (أ) mRosa26-محددة دليل تسلسل استهداف الجيش الملكي النيبالي والزخارف المجاورة protospacer (PAMs) في موقع الإدراج المطلوب يشار إليها في الحروف الزرقاء والحمراء، على التوالي. Cas9 عادة يشق 3-4 نقطة أساس المنبع من تسلسل PAM، الذي يشار إليه بالأسهم الخضراء. يستخدم متجه الاستهداف كنموذج للإصلاح الموجه بالدقة (HDR) مما يؤدي إلى الإدراج الدقيق لكاسيت التعبير في الماوس أو الجينوم البشري. يتم استخدام كل من تسلسل كيلوبايت واحد في المنبع والمصب للموقع المستهدف المطلوب كذراعين 5 و 3 'homology (HAs) في متجه الاستهداف. يتم فصل HAs بواسطة كاسيت تعبير يتكون من مروج CAG ، وتسلسل cDNA لبروتين الاهتمام (POI) مع علامة OST ، ومراسل IRES-EBFP2 ، وإشارة bGH-polyA (pA). ويستخدم موقع التقييد AscI لاستنساخ POI، وتستخدم EcoRI و BamHI لتدويل متجه الاستهداف خطيا. استراتيجية CRISPR/Cas9 بوساطة طرق في مكان hROSA26 مماثلة. (ب) رسم بياني لمرتكز ROSA26 البشري. ويشار إلى تسلسل استهداف hR26-sg1 و hR26-sg2 بأحرف زرقاء وتسلسلات PAM المقابلة باللون الأحمر. (C) التخطيطي للناقل التعبير CRISPR الكل في واحد pX458-DsRed2، الذي يحتوي على شريط التعبير SGRNA يحركها U6 الإنسان وكاسيت مراسل الفلورسنت Cas9-T2A-DsRed2. يسمح موقعان تقييد BbsI لاستنساخ الحمض النووي الريبي دليل. U6, الإنسان U6 RNA بوليمراز الثالث المروج; SgRNA، وهو الجيش الملكي النيبالي دليل واحد chimeric؛ CBh، الدجاج β-أكتين المروج الهجين؛ NLS، إشارة توطين النووية؛ T2A، تلك الفيروسات أسينا 2A الببتيد الذاتي الربط؛ bGH-pA, هرمون النمو البقري إشارة تعدد ال ملادينيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. فرز خلية واحدة من RAW264.7 وخلايا جوركات المصابة مع ناقلات CRISPR/Cas9 واستهداف ناقلات لإعادة التركيب متجانسة. استهداف النواقل المستخدمة للتعبير الجيني المستقر في خلايا RAW264.7 (A) و Jurkat (C).  رسم بياني تدفقي تمثيلي للماكروباجات RAW264.7 الماوس (B) وخلايا جوركات T البشرية (D) المصابة بمتجتجات CRISPR/Cas9 التي تعبر عن مراسل DsRed2 وناقل الاستهداف الذي يعبر عن مراسل EBFP2. وتعرضت الخلايا المشاركة في التعبير عن DsRed2 وEBFP2 لفرز الخلايا وتثقف للتوسع؛ تشير الأرقام المجاورة للمناطق المحددة إلى النسبة المئوية للخلايا في كل بوابة، وتم استخدام الخلايا غير المصابة كعنصر تحكم سالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. فحص الخلايا ضرب في الكشف عن التعبير EBFP2. تحليل التدفق الخلوي ل EBFP2+ و DsRed2+ RAW264.7 الضامة (A) وخلايا جوركات T (B) بعد 14 يوما من الكهرومporation. في المدرجات التكرارية، يتم عرض كثافة الفلورسينس (FI) إما EBFP2+ أو DsRed2+ الخلايا على المحور X ويتم عرض عدد الأحداث في كل قناة مضانة على المحور ص. (أ) كان التعبير عن EBFP2 و hACE2 مدفوعا بنفس المروج في مكان Rosa26 في الضامة RAW264.7 murine. (ب) في خلايا الجوركات، يرتبط تعبير OST-RASGRP1 بتعبير EBFP2 في موقع ROSA26 البشري. في 14 يوما بعد الكهرومغناطيسية، كشف تحليل تدفق الخلايا ما يقرب من صفر DsRed2+ الخلايا بين الخلايا المفرزة. تم استخدام الخلايا البرية (WT) كتحكم سلبي ، وترمز KI إلى الخلايا التي تدق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. فحص المرشح ضرب في الخلايا عن طريق PCR والتسلسل. (أ) استراتيجية لتوليد hACE2 ضرب في الخلايا. يشار إلى مواقع التمهيديات PCR المستخدمة للتمييز بين HDR الدقيق والإدراج العشوائي بواسطة الأسهم الخضراء. (ب) PCR genotyping من خمس خلايا مرشحة (# 4، # 15، # 22، # 25، و # 43) التي تم تحديدها عن طريق فحص تدفق قياس الخلايا للتعبير EBFP2 كما هو موضح في الشكل 3،أظهرت أن كلا من تقاطع 5 (1472 bp) و 3 تقاطع (1472 bp) التي تمتد على أذرع التماثل الجنسي كانت صحيحة. M، سلم الحمض النووي؛ WT، والسيطرة RAW264.7 البرية من نوع؛ H2O، السيطرة السلبية. (ج) كشف تسلسل سانجر لمنتجات PCR من B عن نجاح ضرب كاسيت hACE2-expression في مكان mRosa26 دون طفرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5. تم استخدام التحقق من صحة الضرب الناجح في كاسيت التعبير hACE2 في الموضع mRosa26 في الضامة RAW264.7. (A) WT RAW264.7 الضامة كتحكم سلبي لتحليل التدفق الخلوي. (ب) لفصل الخلايا الإيجابية EBFP2 من الخلايا السلبية، تم إجراء جولة إضافية من فرز الخلايا للحصول على مجموعة تتكون من ما يقرب من 100٪ EBFP2+ الخلايا طرق في، المعينة كخلايا KI hACE2. كما تم فحص التعبير DsRed2 للتأكد من أن كريسبر / Cas9 plasmid لم يتم دمجها في الجينوم من الضامة RAW264.7. في المدرجات التكرارية، يتم عرض كثافة الفلورسينس (FI) إما EBFP2+ أو DsRed2+ الخلايا على المحور X ويتم عرض عدد الأحداث في كل قناة مضانة على المحور ص. (ج) الكشف عن التعبير hACE2 عن طريق تحليل مناعة باستخدام أرنب المضادة للإنسان ACE2 الأجسام المضادة للنسيلة الواحدة. لوحظ التعبير عن hACE2 في الخلايا من آبار متعددة (# 4، # 15، # 22، # 25، و # 43). تم استخدام الضامة WT RAW264.7 كعنصر تحكم سالب وتم استخدام GAPDH كعنصر تحكم التحميل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6. تم استخدام التحقق من نجاح الضربة القاضية في كاسيت التعبير OST-RASGRP1 في الموضع hROSA26 في خلايا جوركات T. (A) WT Jurkat T الخلايا كتحكم سلبي لتحليل تدفق الخلايا. (ب) تم إثراء EBPF2+ الاكتظاظ السكاني الفرعي لخلايا الجوركات بجولات إضافية من فرز الخلايا وتوسيعها؛ تم تعيين هذه الخلايا كخلايا OST-RASGRP1 KI. تم تحليل الخلايا التي تدق في عن طريق قياس التدفق الخلوي ولم تحافظ على ناقلات DsRed2 التعبير. في المدرجات التكرارية، يتم عرض كثافة الفلورسينس (FI) إما EBFP2+ أو DsRed2+ الخلايا على المحور X ويتم عرض عدد الأحداث في كل قناة مضانة على المحور ص. (ج) الكشف عن التعبير OST-RASGRP1 في اثنين من الخلايا طرق في مستقلة (# 1 و # 2) عن طريق تحليل مناعة باستخدام الأجسام المضادة RASGRP1. تم استخدام خلايا WT Jurkat و RASGRP1-knockout Jurkat كعناصر تحكم وتم استخدام β-actin كعنصر تحكم في التحميل. (د) تم استخدام تنقية التقارب بوساطة OST للتحقق من صحة التعبير عن OST-RASGRP1 باستخدام خلايا خروج المغلوب RASGRP1 كعنصر تحكم سلبي. تحليل Immunoblot من كميات متساوية من البروتينات من lysates الخلية التي تعرضت إما لتنقية تقارب على حبات سيبهاروز ستريب-تكتين (تنقية تقارب) أو تحليلها مباشرة (مجموع اللاءات) وبحثت مع RASGRP1 أو GAPDH (تحميل التحكم) الأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي: أرقام الدعم، والجدول، وتسلسل الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في تجاربنا، أظهرنا كيفية إجراء التحرير طرق في الخلايا المناعية من تصميم بناء لفحص الخلايا طرق في والتحقق من صحة باستخدام خلايا T جوركات الإنسان وال الضامة RAW264.7 مورين كأمثلة. كل من الخلايا التائية وخطوط خلايا الضامة مقاومة لالعابر36،37؛ ومع ذلك ، يمكن التغلب على مشكلة انخفاض كفاءة تسليم CRISPR / Cas9 بمساعدة المراسلين الفلورية إلى جانب فرز الخلايا. هذا البروتوكول مناسب لتجارب الإنقاذ الجيني وتجارب التفاعل بين البروتين والبروتين ، ولكن لا يمكن تطبيقه على دراسة تسلسل الحمض النووي التنظيمي مثل المواقع الملزمة لعوامل النسخ لأن البروتوكول تم تطويره لتعديل مكان Rosa26.

ساعد المراسلون الفلوريون المزدوجون CRISPR/Cas9 في التحرير
نجحنا في تطبيق نظام مراسل فلوري مزدوج للتعبير بشكل عابر عن مجموعات مستقلة من ناقلات CRISPR/Cas9 في الخلايا المناعية ، مما أدى إلى حذف أجزاء كبيرة من الحمض النووي في الدراسات السابقة21. لقد صممنا أداة استهداف CRISPR/Cas9 باستخدام بروتين DsRed2 الفلوري كمراسل وبروتين فلوري إضافي متميز بشكل طيفي لتتبع تسليم قالب الحمض النووي للتعديل. لجعل تعديل أليل الضربة القاضية ممكنا ، استخدمنا مراسل البروتين الفلوري EBFP2 ، الذي ليس له امتداد طيفي مع RFP (DsRed2 في حالتنا) ، لمراقبة انتقال الحمض النووي المانح الذي يعمل كنموذج أثناء إعادة التركيب المثلي. لتحسين كاسيت التعبير عن POI ومراسل الفلورسنت، تم إدخال تسلسل IRES للحصول على بروتينات مستقلة. في دراستنا السابقة، لاحظنا أن الأحماض الأمينية المتبقية من الرابط P2A أو T2A المتبقية بعد الانقسام ما بعد النسخ أثرت على توطين البروتين على سطح الخلية. تسلسل IRES لا يترك مثل هذه الأحماض الأمينية المتبقية. كما هو موضح في دراسة سابقة، أدى IRES إلى مستويات أعلى من مراسل الفلورسنت، بعد التعبير عن البروتين Cas9 يقودها المروج CAG38.

الكل في واحد كريسبر / Cas9 بلازميد
وقد وصفت أشكال مختلفة وتركيبات من نظام CRISPR /Cas9 في الدراسات السابقة، مثل العدوى Cas9 كمرنا أو بروتين جنبا إلى جنب مع SgRNAs توليفها كيميائيا39. كما تم تسليم مجمعات CRISPR/Cas9 RNP إلى خلايا الثدييات. توفر هذه الاستراتيجية مزايا بداية مبكرة لنشاط النيوكليز وأقصر نصف العمر؛ ومع ذلك ، فإن وضع العلامات على RNPs أقل فعالية من حيث التكلفة مقارنة ببناء البلازميد الكل في واحد. في دراساتنا السابقة ، وجدنا أن استخدام فرز الخلايا المفردة لعزل تلك الخلايا النادرة التي تعبر عن CRISPR / Cas9 (DsRed2 إيجابي) والبروتين (EBFP2 الإيجابي) أقل تعقيدا بكثير من استخدام تسليم RNP ، ومن السهل إعداد البلازميدات. صحيح أن هذا البروتوكول يعتمد على فرز خلية واحدة. ولكن بروتوكولنا سهل الأداء وينتج عنه تعديلات ناجحة مع إمكانية إعادة إنتاج عالية.

التعبير عن POI من مكان Rosa26
هناك تقارير متعددة في الأدب تصف أساليب لوضع علامات على البروتينات الذاتية مع المراسلين الفلورسنت باستخدام CRISPR / Cas9 تحرير40،41،42. مزايا وضع العلامات الذاتية هي أنه من الممكن تحديد التعريب دون الخلوي وأداء تتبع الجسم الحي للبروتين الداخلي. ومع ذلك، قد تواجه مشاكل إذا لم يكن من الممكن تصميم دليل CRIPSR المناسب RNA في الموضع الداخلي. هنا قمنا بتطوير طريقة بديلة طرق في من خلال دمج POI-IRES-EBFP2 في الموضع الآمن الجينومي ميناء Rosa26، الذي يتغلب على القيود المفروضة على العثور على أدلة مناسبة لتحديد المواقع العلامات الذاتية.

ونلخص بعض النقاط الرئيسية التي ينبغي النظر فيها أثناء التجارب لضمان إمكانية إعادة الإنتاج التقني. أولا، يحتاج مفرز الخلية إلى ليزر بنفسجي 405 نانومتر لإثارة EBFP2 وليزر أزرق 488 نانومتر أو بدلا من ذلك ليزر أصفر 561 نانومتر لإثارة DsRed2. مع مثل هذه التكوينات، يمكن الكشف عن EBFP2 و DsRed2 مع عدم وجود امتداد الطيفية، والتي قد تؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة. في تجاربنا، كانت نسبة DsRed2+ EBFP2+ خلايا إيجابية مزدوجة منخفضة إلى 0.9٪؛ لذلك، كان غاينغ السكان المناسبين ضروريا لنجاح التجارب. تم إجراء جولة ثانية من الفرز لبوابة الخلايا الإيجابية EBFP2+ ، تليها التحقق من صحة PCR. بالإضافة إلى ذلك ، للكشف عن البروتين ، من الأفضل إدخال علامة بروتين مثل OST أو نوع آخر من العلامات. الضربة القاضية للجين قبل تجارب روسا26 الموضع طرق في يوفر فرصة جيدة لتقييم ما إذا كان الجسم المضاد لديه خصوصية مرغوب فيه. عندما لا تكون خصوصية الجسم المضاد كافية ، يجب إجراء الكشف عن البروتين الضربة القاضية بعد السحب عبر علامة البروتين. وأخيرا، أثناء فحص FACS للخلايا التي تعبر عن أليل الضربة القاضية، يمكن استخدام كثافة EBFP2 لتقييم ما إذا كانت هناك نسختين أو نسخة واحدة من أليل الضربة القاضية.

التطبيقات
في هذا البروتوكول وصفنا تعديل طرق في RASGRP1، جزيء رئيسي تشارك في تنشيط الخلية T27. حصلنا أولا RASGRP1 بالضربة القاضية خلايا Jurkat التي يمكن استخدامها لفقدان وظائف الدراسات، ونحن ولدت خلايا جوركات إضافية تعبر عن OST-RASGRP1 في الموضع hROSA26. خلايا الجوركات هي خط الخلية البشرية الأكثر استخداما لدراسة بيولوجيا الخلايا التائية43. بسبب نجاح العلاج المناعي في منع استنفاد الخلايا التائية في مرضى السرطان ، فإن علماء المناعة وعلماء الأحياء السرطانيين لديهم اهتمام كبير بتعديل خلايا جوركات للدراسات الوظيفية للجزيئات المرشحة. ومن الجدير بالذكر أيضا أن خط الخلية T جوركات يستخدم عادة لتشريح مسارات الإشارات، ولكن هناك قيود على استخدام هذا الخط الخلية، كما خلايا جوركات هي المنتجين الفقراء من IFN-γ على التحفيز44. استخدمت الدراسات السابقة تعديل الموضع الداخلي45 والهندسة الوراثية في الموضع hROSA26 46 لإجراء تجارب طرق في خلايا جوركات البشرية. ولكل من الاستراتيجيتين مزاياه الخاصة؛ عن طريق تعديل الموضع الداخلي البروتين هو التعبير عن يفترض على مستوى "الفسيولوجية". تعديل طرق في مكان hROSA26 تنتج نتائج يمكن التنبؤ بها لأنه يتم تجنب الربط البديل من مرنا، ووفرة البروتين المعدل هو أيضا يمكن الكشف عنها بسهولة. المرافئ الآمنة الجينومية الأخرى، مثل موقع الفيروس المرتبطة أدينو 1 (AAVS1) وchemokine (CC motif) مستقبلات 5 (CCR5)47،48 تستحق المزيد من الاستكشاف.

في دراستنا السابقة، عندما تم التعبير عن Vav1-OST في مستويات أعلى في موقع Rosa26 الماوس في الخلايا RAW264.7، والتي هي خلايا الضامة المستخدمة في كثير من الأحيان، تمكنا من الكشف عن تفاعلها مع جزيئات Vav3 أعرب عن منخفضة بسبب مستويات عالية من بروتين الطعم وكفاءة عالية من تنقية تقارب OST13. كما وصفنا تجارب الضربة القاضية لإنشاء خط خلية الضامة الذي يعبر بشكل ثابت عن hACE2 ، وهو مستقبل للسارس-CoV-2 ، حيث يتم ضمان التعبير الوفير. في قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، يتم التعبير عن murine Ace2 في الضامة الرئة، والنموذج الخلوي الوراثي التعبير عن hACE2 وضعنا يمكن أن تكون مفيدة لدراسات الضامة خلال عدوى السارس-CoV-2.

اعتبارات أخرى
تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد الخلايا التي تعبر عن POI بمساعدة التحليلات الخلوية التدفق لمراسل الفلورسنت، في حالتنا مراسل EBFP2. ومع ذلك، عندما الأجسام المضادة وضع العلامات السطحية التي يمكن الكشف عنها من قبل FACS متوفرة لبروتين سطح49،فإنه ليس من الضروري استخدام نظام المراسل50. وتستخدم أساسا الخلية T وخطوط الخلايا الضامة، فضلا عن أمثلة من البروتينات الموسومة OST المستخدمة لدراسات interactome، لدراسات الإشارات، ومعظم هذه الجزيئات الإشارات مترجمة في السيتوسول أو نواة الخلايا. وهكذا، قد تكون هناك حاجة إلى مراسل الفلورسنت لتحديد الخلايا طرق في المرغوب فيه.

من المهم الإشارة إلى أن هذا البروتوكول تم تطويره لخطوط الخلية ، ولم يتم التحقق من التطبيق على الخلايا المناعية الأولية مثل الخلايا التائية ، monocytes / الضامة. بسبب القدرة المحدودة للخلايا على الانتشار، لا نوصي بهذا البروتوكول للاستخدام مع الخلايا المناعية الأولية. كما تم التعبير عن مراسل الفلورسنت EBFP2 تحت نفس المروج مثل الجين ضرب في أو POI باستخدام عنصر IRES، لم نلاحظ الخلايا التي عبرت عن مراسل الفلورسنت في غياب الجين ضرب في. ونحن نشك في أن استعادة الخلايا الفلورية المعبرة عن البروتين تعتمد اعتمادا كبيرا على نجاح إعادة التركيب المتجانس. كما ورد في دراسة سابقة، فمن الممل لفرز وتوسيع وتحديد الصحيح ضرب في الخلايا عن طريق فرز خلية واحدة عندما تكون كفاءة ضرب في منخفضة جدا42،وهو ما يفسر أيضا لماذا كنا بحاجة لفرز الخلايا بكميات كبيرة لتحسين معدل النجاح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر مرفق التدفق الخلوي الأساسي لجامعة شينشيانغ الطبية. وقد تم دعم تطوير هذه التكنولوجيا من خلال منح NSFC 81601360 إلى LZ 81471595 32070898 إلى YL. ويدعم هذا العمل أيضا مؤسسة هينان لجنة التعليم رقم 21IRTSTHN030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 177، طرق في، CRISPR/Cas9، Rosa26،الضامة، الخلية التائية، hACE2
الجينات تدق في كريسبر / Cas9 وفرز الخلايا في خطوط الخلايا الماكروفاج و تي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter