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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Knock-in de gènes par CRISPR/Cas9 et tri cellulaire dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

Ce protocole utilise des rapporteurs fluorescents et le tri cellulaire pour simplifier les expériences d’entraînement dans les macrophages et les lignées cellulaires T. Deux plasmides sont utilisés pour ces expériences d’entraînement simplifiées, à savoir un plasmide exprimant CRISPR/Cas9 et DsRed2 et un plasmide donneur de recombinaison homologue exprimant EBFP2, qui est intégré en permanence au locus Rosa26 dans les cellules immunitaires.

Abstract

Les études de génomique fonctionnelle du système immunitaire nécessitent des manipulations génétiques qui impliquent à la fois la délétion des gènes cibles et l’ajout d’éléments aux protéines d’intérêt. L’identification des fonctions des gènes dans les modèles de lignées cellulaires est importante pour la découverte de gènes et l’exploration des mécanismes intrinsèques des cellules. Cependant, les manipulations génétiques des cellules immunitaires telles que les cellules T et les lignées cellulaires de macrophages utilisant l’entraînement médié par CRISPR / Cas9 sont difficiles en raison de la faible efficacité de transfection de ces cellules, en particulier dans un état de repos. Pour modifier les gènes dans les cellules immunitaires, la sélection de la résistance aux médicaments et les vecteurs viraux sont généralement utilisés pour enrichir les cellules exprimant le système CRIPSR / Cas9, ce qui entraîne inévitablement une intervention indésirable des cellules. Dans une étude précédente, nous avons conçu des rapporteurs fluorescents doubles couplés à CRISPR / Cas9 qui ont été exprimés transitoirement après électroporation. Cette solution technique conduit à une délétion rapide des gènes dans les cellules immunitaires; cependant, l’inserment de gènes dans les cellules immunitaires telles que les lymphocytes T et les macrophages sans l’utilisation de la sélection de la résistance aux médicaments ou de vecteurs viraux est encore plus difficile. Dans cet article, nous montrons qu’en utilisant le tri cellulaire pour faciliter la sélection de cellules exprimant transitoirement les constructions CRISPR / Cas9 ciblant le locus Rosa26 en combinaison avec un plasmide de donneur, le knock-in de gène peut être réalisé à la fois dans les cellules T et les macrophages sans enrichissement en résistance aux médicaments. À titre d’exemple, nous montrons comment exprimer l’ACE2 humain, un récepteur du SARS-Cov-2, responsable de la pandémie actuelle de Covid-19, dans les macrophages RAW264.7 en effectuant des expériences knock-in. De telles cellules knock-in génétiques peuvent être largement utilisées pour les études mécanistes.

Introduction

Les cellules immunitaires sont essentielles à la défense contre les agents pathogènes. L’immunité innée et adaptative est nécessaire pour l’élimination des infectieux et le maintien de l’homéostasie tissulaire1,2. Les modèles de lignées cellulaires sont des outils essentiels pour comprendre les fondements moléculaires du système immunitaire des mammifères; ils sont utilisés dans des tests fonctionnels in vitro, tels que ceux modélisant l’activation des lymphocytes T humains, et pour déterminer la fonction des facteurs génétiques dans l’activation ou l’amortissement des réponses immunitaires3,4. Il est important de noter que le système immunitaire des mammifères est extrêmement hétérogène et, tout aussi important, un grand nombre de molécules contrôlent la différenciation, la migration et la fonction d’une cellule donnée de type5,6.

Les outils d’édition du génome CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 permettent la manipulation génétique de types cellulaires spécifiques, ce qui facilite l’annotation fonctionnelle des gènes de manière précise7,8. Plusieurs protocoles publiés ont décrit l’administration de CRISPR/Cas9 sous la forme de complexes d’ARN guides Cas9 connus sous le nom de ribonucléoprotéines (RRP) dans les cellules HEK293, les lignées cellulaires Jurkat, les cellules T primaires9,10,les macrophages11,12,13,les cellules souches14et d’autres15,16. Dans ces protocoles, le marquage génique est généralement réalisé en fusionnant une étiquette fluorescente à des protéines endogènes17,18. Cependant, peu de tentatives ont été faites pour utiliser des rapporteurs fluorescents doubles, qui sont compatibles avec le tri des cellules uniques, pour faciliter les expériencesknock-in 19,20, en particulier dans les cellules immunitaires.

Les analyses mécanistes approfondies visant à comprendre les fonctions d’un nouveau facteur génétique dans les cellules immunitaires nécessitent généralement la délétion spécifique d’un gène par type cellulaire, des expériences de sauvetage génétique et, idéalement, l’identification de ses interacteurs. Même si des méthodes d’optimisation de la délétion génétique des gènes dans les cellules immunitaires ont été publiées9,15,21, beaucoup moins de méthodes ont été rapportées pour introduire des allèles knock-in avec des fonctions polyvalentes pour comprendre la réponse immunitaire. Par conséquent, dans ce protocole, nous visons à décrire en détail un protocole efficace et hautement reproductible pour exprimer une protéine d’intérêt (POI) au locus refuge Rosa26 dans les lignées cellulaires immunitaires humaines et murines. Nous avons conçu un système rapporteur bicolore pour enrichir les cellules transfectées avec des plasmides exprimant CRISPR/Cas9 (DsRed2) et un modèle d’ADN recombinant (EBFP2), qui peut être isolé par tri cellulaire. Suite à ce protocole, nous avons obtenu plusieurs lignées knock-in de la lignée de cellules T humaines Jurkat et du macrophage murin RAW264.7 pour des analyses fonctionnelles de protéines mal étudiées.

À titre d’exemple, nous montrons dans ce protocole comment obtenir des macrophages RAW264.7 knock-in exprimant de manière stable l’ACE2 humain (un récepteur du SARS-Cov-2)22. Parce que les cellules immunitaires innées sont impliquées dans la pathogenèse du Covid-1923,24 et que l’ACE2 humain est considéré comme un récepteur majeur nécessaire à l’entrée virale dans les cellules avant la réplication, les macrophages avec knock-in de l’ACE2 humain peuvent servir d’outil utile pour les études mécanistes de la multiplication virale à l’intérieur des macrophages. En parallèle, nous présentons également un exemple de knock-in d’un gène au locus humain ROSA26 pour exprimer la protéine RASGRP1, qui a été fusionnée à son extrémité aminée avec une affinité Twin-Strep-tag (OST). Les lymphocytes T sont des cellules cibles clés dans les thérapies immunitaires, et un nombre croissant d’études se sont concentrées sur la manipulation de leur réactivité au cancer25,26. Comme Rasgrp1 est connu pour être une molécule de signalisation clé en aval du récepteur des lymphocytes T et que ses interacteurs ne sont pas bien élucidés27,le modèle d’inserrage OST-RASGRP1 fournit la base pour identifier les interacteurs régulant la réponse des lymphocytes T aux tumeurs et aux infections. Pris ensemble, ces outils peuvent être utilisés pour les études Covid-19 et la découverte de nouvelles molécules interagissant avec Rasgrp1.

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Protocol

1. Conception et construction plasmidique de sgRNA ciblant rosa26 Locus

  1. Guide de conception des ARN autour du site d’insertion souhaité
    1. S’assurer que le site d’insertion des expériences de frappe de souris Rosa26 (ci-après dénommée mRosa26)est situé dans le premier intron de mRosa26; ce site a été utilisé dans des études antérieures28,29. Pour les expériences d’insertion dans des cellules humaines, assurez-vous que le site d’insertion réside dans le locus humain ROSA26 (ci-après dénommé hROSA26), qui a été identifié comme l’homologue humain de mRosa2630.
    2. Utilisez les séquences génomiques de souris et d’espèces humaines obtenues à partir de Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) et du navigateur de génome Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), respectivement. Copiez 50 paires de bases (pb) de la séquence génomique du locus mRosa26 ou hROSA26 de chaque côté flanquant le site d’insertion souhaité.
    3. Guide de conception ARN à l’aide de l’outil Web en ligne CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Collez les 100 bp de séquence d’entrée de la version 1.1.2. Sélectionnez deux ARN guides avec un score de spécificité élevé, un score d’efficacité élevé et une faible activité hors cible. De plus, choisissez des guides d’ARN avec des scores Doench plus élevés et évitez ceux étiquetés comme « inefficaces »32.
      REMARQUE: Les outils de conception CRISPR alternatifs sont également précieux et accessibles au public, par exemple l’outil de conception Benchling CRISPR (https://benchling.com/crispr). Pour augmenter la fréquence des cellules mutées médiées par CRISPR/Cas9, sélectionnez deux ARN guides proches du site d’insertion souhaité lorsque cela est possible33.
    4. Pour le locus mRosa26, utilisez deux ARN guides adjacents désignés comme mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') et mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (Figure 1A). Pour le locus hROSA26, utilisez deux ARN guides adjacents, à savoir hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') et hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Figure 1B).
      REMARQUE : Les activités d’édition du génome de mR26-sg1 et mR26-sg2 et celles de hR26-sg1 et hR26-sg2 ont été évaluées dans les cellules RAW264.7 et les cellules Jurkat, respectivement (voir fichier supplémentaire, figure S1).
  2. Clonage de vecteurs d’expression CRISPR contenant de l’ARNg ciblant le locus Rosa26
    1. Synthétiser des oligos avant et arrière pour un ARN guide (voir fichier supplémentaire).
      REMARQUE: Il est préférable d’ajouter un nucléotide « G » au début de la séquence guide, ce qui facilite l’expression pilotée par le promoteur U6. Par exemple, pour cloner le mR26-sg1 susmentionné, l’oligo avant est CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT et l’oligo inverse est AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Le G supplémentaire dans l’oligo avant et son complément dans l’oligo inverse sont indiqués en gras.
    2. Cloner des oligos synthétiques correspondant aux ARN guides dans le vecteur d’expression CRISPR tout-en-un pX458-DsRed2 généré dans notre travail précédent21 (Figure 1C) en utilisant le protocole général de clonage d’ARNg développé par le laboratoire de Zhang (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); cependant, sautez l’étape de purification du gel et purifiez le vecteur digéré à l’aide d’un kit de purification par PCR (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE: Dans les protocoles précédents, la purification en gel du vecteur digéré BbsI a été effectuée; cependant, cette étape prend beaucoup de temps. Dans le présent protocole, le produit digéré est purifié à l’aide d’un kit de purification par PCR et utilisé directement pour la réaction de ligature en aval, qui produit généralement des colonies positives avec une efficacité comparable.
    3. Transformer 10 μL du produit de ligature (étape 1.2.2) en 50 μL de cellulescompétentes Escherichia coli DH5α selon les instructions du fabricant. Choisissez au hasard trois colonies dans une plaque de gélose LB avec de l’ampicilline (100 μg / mL) et inoculez chacune dans 3 mL de milieu LB avec de l’ampicilline pour la culture pendant la nuit.
    4. Utilisez 1 mL de la culture bactérienne pendant la nuit pour le séquençage de Sanger et maintenez le reste à 4 °C jusqu’à ce que la construction soit confirmée comme ainsi : pDsR-mR26-sg1 et pDsR-mR26-sg2 pour le locus mRosa26 knock-in, et pDsR-hR26-sg1 et pDsR-hR26-sg2 pour le locus hROSA26.
    5. Préparer une concentration élevée d’ADN plasmidique (environ 2 μg/μL) avec un kit maxiprep pour la purification du plasmide de qualité transfection (voir Tableau des matériaux).

2. Conception et construction de vecteurs de ciblage en tant que modèles de recombinaison homologues

  1. Concevoir un modèle de réparation dirigé par homologie
    1. Concevoir un vecteur de ciblage pour exprimer de manière constitutive le POI à l’aide d’une cassette d’expression optimisée à partir d’une étude précédente29, qui comprend un promoteur hybride CAG, un site de restriction AscI permettant le clonage de l’ADNc du POI, un rapporteur IRES-EBFP2 et un signal de polyadénylation de l’hormone de croissance bovine (bGH-polyA)(Figure 1B et fichier supplémentaire).
    2. Concevoir des bras d’homologie (HAs) qui partagent l’homologie avec les séquences génomiques du locus mRosa26 ou hROSA26. Inclure ~1 kb du 5' HA correspondant à la séquence génomique en amont à partir du site d’insertion souhaité à gauche de la cassette d’expression. De même, inclure ~1 kb du 3' HA correspondant à la séquence génomique en aval du site d’insertion à droite de la cassette d’expression.
      REMARQUE : La cassette d’expression est insérée le plus près possible des sites de clivage CRISPR/Cas934. Pour éviter la recoupe de l’allèle ciblé par CRISPR/Cas9, incorporer des changements nucléotidiques dans la séquence de motifs adjacents au protospacer (PAM) (5'-NGG-3') dans le vecteur de ciblage34,35.
    3. Pour permettre la linéarisation du vecteur de ciblage, insérez un site EcoRI unique juste en amont du 5' HA et un site BamHI unique juste en aval du 3' HA.
    4. Demandez à un fournisseur commercial de synthétiser les vecteurs de ciblage et de les désigner comme pKR26-iBFP et pKhR26-iBFP pour mRosa26 et hROSA26 knock-in, respectivement.
  2. Construire un vecteur de ciblage en tant que modèle de réparation dirigé par homologie
    1. Pour exprimer le POI, obtenez la séquence d’ADNc (séquence codante) à partir du navigateur du génome d’Ensembl et choisissez la transcription possédant la séquence protéique la plus longue. Par exemple, l’ADNc du gène ACE2 humain est ACE2-202 ENST00000427411.2 et l’ADNc du gène RASGRP1 humain est RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Synthétiser l’ADNc du POI avec l’aide d’un fournisseur commercial. Il est également possible de cloner l’ADNc via l’amplification PCR (non décrite ici). Placez la séquence GGCGCGCCACC (5' - 3'), qui comprend un site de restriction AscI (italique et gras) et un site d’initiation de traduction consensuelle Kozak (souligné), immédiatement avant le codon d’initiation ATG de l’ADNc et un autre site de restriction AscI (5'- GGCGCGCC -3') après le codon d’arrêt de l’ADNc.
    3. Digérer la séquence synthétisée avec AscI et purifier à l’aide d’un kit de purification par PCR conçu pour purifier les fragments d’ADN après digestion de restriction, en suivant les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux).
    4. Ligaturez l’insert d’ADNc purifié dans le vecteur dorsal linéarisé AscI pKR26-iBFP ou pKhR26-iBFP à l’aide de la ligase d’ADN T4 en suivant les instructions du fabricant.
    5. Vérifiez le vecteur de ciblage final, pKR26-POI-iBFP ou pKhR26-POI-iBFP, par séquençage. Utilisez maxiprep pour purifier les constructions vérifiées selon le protocole du fabricant.
    6. Digérez le vecteur de ciblage à l’aide d’EcoRI ou de BamHI et purifiez le produit de digestion à l’aide d’un kit de purification par PCR conformément aux instructions du fabricant. Stocker le vecteur de ciblage linéarisé (~0,8 μg/μL) à -20 °C jusqu’à l’électroporation.

3. Électroporation des macrophages et des lignées cellulaires T

  1. Préparer des cultures cellulaires pour l’électroporation
    1. Préparez roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) comme milieu de croissance complet pour les cellules T de Jurkat. Préparez le DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco avec 10% de FBS pour la culture des macrophages RAW264.7. Compléter tous les milieux de croissance complets avec 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (pen/streptocoque) à l’exception des milieux utilisés pour l’incubation post-transfection avant le tri cellulaire.
    2. Effectuer la sous-culturation des cellules T RAW264.7 et Jurkat conformément aux instructions du fournisseur (voir tableau des matériaux). Lors de la sous-culation de cellules RAW264.7, utilisez une solution de trypsine-EDTA (0,25%) pour détacher les cellules. Utilisez FBS complété par 10% (v / v) de DMSO comme milieu de cryoconservation pour les cellules RAW264.7 et Jurkat.
    3. Prélever des cellules à 250 × g pendant 5 min pour les macrophages RAW264.7 et 90 × g pendant 8 min pour les lymphocytes T de Jurkat. Ensuite, laver avec 5-10 mL de 1× DPBS (sans ions Ca2+ ou Mg2+). Retirez le DPBS.
    4. Resuspendez la pastille de cellule en utilisant 2 mL de 1× DPBS. Utilisez 10 μL de cellules et mélangez avec un volume égal de 0,2 % de bleu de trypan pour estimer le nombre de cellules et la viabilité.
      REMARQUE: Assurez-vous que la culture cellulaire a une viabilité de >90% le jour de la transfection.
    5. Pour une seule expérience d’entraînement, effectuez une électroporation avec des pointes de nucléofection de 10 μL avec cinq répétitions. Calculer le volume nécessaire pour 2,0 × 106 cellules et arouiller les cellules par centrifugation. Lavez à nouveau la pastille de cellule avec 1× DPBS comme décrit à l’étape 3.1.3.
      REMARQUE: Lors de l’utilisation de pointes de nucléofection de 10 μL, 4,0 ×10 5 cellules sont nécessaires par électroporation. En conséquence, préparez au moins 2,0 × 106 cellules pour une expérience knock-in.
    6. Préparer une plaque de 24 puits avec 0,5 mL de milieu de croissance complet (préparé à l’étape 3.1.1) par puits sans stylo/streptocoque et prépuce dans un incubateur à 37 °C.
  2. Électroporation des composants CRISPR/Cas9 et du vecteur de ciblage
    1. Allumez le système d’électroporation. Utiliser des paramètres d’électroporation optimisés dans une étude précédente21: 1 400 V/20 ms/2 impulsions pour les macrophages RAW264,7 et 1350 V/20 ms/2 impulsions pour les lymphocytes T Jurkat.
    2. En tenant compte de la perte d’échantillon due au pipetage, préparez un mélange d’électroporation de 55 μL dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL contenant 2,5 μg de chaque vecteur CRISPR/Cas9, 2,4 μg du vecteur de ciblage linéarisé et le tampon de remise en pension R.
      REMARQUE: Pour gagner du temps, le mélange d’électroporation peut être préparé pendant la centrifugation (étape 3.1.5).
    3. Remise en × 2.0 de 106 cellules (préparées à l’étape 3.1.5) dans le mélange d’électroporation de 55 μL de l’étape 3.2.2.
    4. Aspirer le mélange cellule/électroporation de l’étape 3.2.3 à l’aide d’une pointe de nucléofection de 10 μL avec une pipette.
      REMARQUE: Pendant le pipetage, évitez d’introduire des bulles d’air, ce qui peut provoquer une défaillance de l’électroporation.
    5. Ajouter l’échantillon dans un tube rempli de 3 mL de buffer E du kit d’électroporation.
    6. Appliquez les paramètres d’électroporation pour les deux types de cellules comme décrit à l’étape 3.2.1.
    7. Transférer l’échantillon dans un puits de la plaque de 24 puits avec un milieu préchavenu à partir de l’étape 3.1.6.
    8. Répétez les étapes 3.2.4 à 3.2.7 pour les quatre autres répétitions ainsi que pour les contrôles du vecteur de ciblage uniquement et du vecteur d’expression CRISPR uniquement.
      REMARQUE: Changez la pointe de nucléofection et le tube lors du passage à un autre type de cellule / ADN plasmidique.
    9. Culture des cellules transfectées pendant 48 à 72 h pour permettre la récupération après électroporation et expression des composants CRISPR/Cas9 avant l’analyse de cytométrie en flux ou le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Examiner l’expression de DsRed2 à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un canal rouge 24 h après la transfection.
      REMARQUE: Un avantage de la surveillance des cellules fluorescentes DsRed2 est que l’efficacité de l’électroporation peut être estimée et que l’aptitude à un tri ultérieur des cellules peut être prédite.

4. Tri des cellules pour isoler les cellules knock-in putatives

  1. Avant le tri FACS, lavez les cellules transfectées une fois avec un milieu de croissance complet. Cellules à granulés par centrifugation comme décrit à l’étape 3.1.3 et remise enssusser les granulés dans 500 μL de milieu frais.
  2. Réglez le trieur de cellules (situé dans une armoire de biosécurité) avec une buse de 85 μm et un faible débit. Sélectionnez le mode « cellule unique » pour le tri et testez l’efficacité et la précision du tri à cellule unique en triant 20 à 30 cellules sur le couvercle d’une microplaque de 96 puits. Une gouttelette localisée au centre de chaque puits indique la bonne configuration de l’instrument.
  3. Transférer la suspension cellulaire de l’étape 4.1 dans des tubes FACS stériles et ajouter SYTOX Red Dead Cell Stain à une concentration finale de 1 nM.
  4. Analysez les échantillons sur le trieur de cellules. SYTOX Red et EBFP2 sont excités par un laser de 405 nm et détectés par les canaux V450/BV421 et APC, respectivement. DsRed2 est excité par un laser de 488 nm et détecté par le canal PE. Utilisez des cellules non transfectées et des cellules positives uniques EBFP2 et DsRed2 comme témoins de la compensation spectrale.
  5. Trier 10 cellules individuelles dans chaque puits d’une microplaque de 96 puits contenant 150 μL par puits de milieu de croissance complet préchauffé. Utilisez des microplaques à fond rond pour cultiver des lignées cellulaires de suspension telles que les cellules T Jurkat et des microplaques à fond plat pour les macrophages RAW264.7 adhérents.
    REMARQUE: Le tri de 10 cellules par puits est une stratégie optimisée pour améliorer la survie cellulaire et minimiser le nombre de microplaques de 96 puits qui doivent être ensemencées et le nombre d’échantillons qui doivent être examinés par cytométrie en flux et génotypage; si vous ne triez qu’une seule cellule par puits, l’ensemencement de plus de microplaques est nécessaire pour augmenter les chances d’obtenir des cellules correctement modifiées.

5. Dépistage et validation des cellules knock-in positives

  1. Dépistage des cellules knock-in candidates par cytométrie en flux
    1. Incuber les cellules à partir de l’étape 4.5 pendant 10-15 jours et ajouter un milieu de croissance complet tous les 3 jours pour remplacer le liquide perdu par évaporation. Pour les lymphocytes T de Jurkat, transférez les cellules cultivées dans la plaque de 96 puits à fond rond vers une plaque à fond plat pour optimiser la prolifération cellulaire.
    2. Transférez les cellules triées expansées dans des plaques de 48 puits pour une expansion ultérieure.
    3. Lorsque les cellules sont proches de la confluence, utilisez la moitié de la culture pour dépister l’expression d’EBFP2 par cytométrie en flux (Figure 3). Normalement, la moitié de la culture dans une plaque de 48 puits après une croissance confluente équivaut à 0,5-1,0 × 105 cellules, ce qui est suffisant pour l’analyse d’un échantillon par cytométrie en flux.
    4. Transférer les cellules restantes dans des plaques de 24 puits pour une prolifération ultérieure.
    5. Conserver les populations de cellules candidates possédant un pourcentage élevé de cellules EBFP2 positives pour d’autres expériences de génotypage.
      REMARQUE: Étant donné que 10 cellules sont triées dans chaque puits de la microplaque de 96 puits, il est possible que les cellules knock-in se développent avec des cellules qui n’expriment pas le gène knock-in. Par conséquent, il est normal d’effectuer un cycle supplémentaire de tri cellulaire pour séparer les cellules POSITIVES EBFP2 des cellules négatives.
  2. Dépistage des cellules knock-in candidates par PCR et séquençage
    1. Prélever 2 × 105 cellules candidates. Extraire l’ADN génomique à l’aide d’un kit de préparation de l’ADN (voir tableau des matériaux).
    2. Pour vérifier que la réparation précise dirigée par homologie (HDR) s’est produite au locus mRosa26 plutôt qu’à des sites aléatoires dans le génome des cellules knock-in candidates, effectuez une PCR avec des amorces couvrant chaque côté des HAs (Figure 4). Choisissez une amorce située dans la région génomique à l’extérieur du vecteur de ciblage (oligo externe) et une autre amorce située à l’intérieur du vecteur de ciblage (oligo interne).
      REMARQUE: Une conception similaire est utilisée pour vérifier HDR au locus hROSA26. Les amorces PCR peuvent également être facilement conçues pour détecter l’insertion de la séquence POI. De plus, les génotypes des allèles de type sauvage et des génotypes knock-in peuvent être détectés simultanément à l’aide de la PCR à trois amorces (voir fichier supplémentaire, figure S2).
    3. Clonez les produits PCR positifs à l’aide d’un kit de clonage rapide (voir Tableau des matériaux). Transformer le mélange réactionnel en cellules compétentes DH5α.
    4. Choisissez au hasard 8 à 10 colonies bactériennes individuelles par transformation et séquencez les produits de PCR à partir de l’étape 5.2.3 par séquençage de Sanger.
  3. Validation des cellules knock-in positives par analyse immunoblot et purification d’affinité
    NOTE: Les cellules candidates sont soumises à une analyse immunoblot pour la validation de l’insertion du POI, ou purification d’affinité (AP) pour les études d’interaction protéine-protéine.
    1. Effectuer une analyse immunoblot conformément aux instructions du fabricant de l’anticorps. Voir le tableau des matériaux pour plus d’informations sur l’utilisation des anticorps primaires et des anticorps secondaires.
    2. Soumettre les lysates des cellules knock-in exprimant le POI marqué OST à l’AP à l’aide de billes de streptocoque-tactine sépharose en suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux).
    3. Détectez la chimiluminescence à l’aide d’un imageur.

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Representative Results

Suivant le protocole décrit ci-dessus pour effectuer des expériences knock-in au locus mRosa26 en utilisant des macrophages murins RAW264.7, nous avons conçu un vecteur de ciblage pour exprimer l’ACE2 humain, un récepteur du virus SARS-Cov-2(Figure 2A). En utilisant une conception similaire, nous avons généré des cellules T Jurkat humaines avec l’apport de la protéine de fusion RASGRP1 marquée OST (Figure 2C). Après la transfection de trois plasmides, dont deux ont été utilisés pour l’expression de CRISPR/Cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 et pDsR-mR26-sg2 pour mRosa26 knock-in; pDsR-hR26-sg1 et pDsR-hR26-sg2 pour le knock-in hROSA26) et un autre utilisé comme modèle d’ADN pour la recombinaison homologue (EBFP2), des cellules doubles positives exprimant deux rapporteurs fluorescents ont été triées dans une plaque de 96 puits. Parmi les cellules RAW264.7 triées à l’aide du mode de tri à cellule unique, 0,91 % étaient DsRed2+ EBFP2+,mais 10 cellules ont été collectées dans chaque puits(Figure 2B). Les lymphocytes T de Jurkat avaient une efficacité de transfection plus élevée, et le pourcentage de cellules doubles positives était de 7,91% dans cette expérience représentative, démontrant un knock-in réussi de la protéine de fusion OST-RASGRP1(Figure 2D).

Dans l’étape suivante, la cytométrie en flux a été utilisée pour dépister les puits candidats avec des cellules EBFP2 positives. Des histogrammes représentatifs ont montré qu’il y avait des populations positives à l’EBFP2 évidentes(Figure 3). Il est à noter que les cellules knock-in n’ont pas exprimé DsRed2 lorsque la cytométrie en flux a été effectuée deux semaines après le tri cellulaire.

Pour la discrimination des knock-ins précis et des insertions aléatoires, l’ADN génomique des cellules EBFP2 positives a ensuite été testé en effectuant une PCR avec des amorces reconnaissant la séquence génomique externe aux HA du vecteur cible et de la région spécifique à l’intérieur de la cassette d’expression(Figure 4A et 4B). L’analyse séquentielle de ces produits pcR a confirmé l’apparition de HDR sur le site cible de mRosa26 (Figure 4C). La même stratégie de génotypage peut être appliquée pour valider l’insertion précise de la cassette d’expression dans le locushROSA26 des lymphocytes T de Jurkat.

Pour obtenir une population pure de cellules RAW264.7 exprimant hACE2, nous avons ensuite trié les cellules et validé la présence des rapporteurs fluorescents après expansion en utilisant des cellules de type sauvage comme témoins(Figure 5A). Les cellules expansées étaient POSITIVES à l’EBFP2 et la protéine hACE2 était facilement détectable dans les macrophages murins RAW264.7(Figure 5B et 5C). De même, nous avons validé l’expression des rapporteurs fluorescents et de la protéine OST-RASGRP1 dans les lymphocytes T Jurkat humains après un criblage et un deuxième cycle de tri cellulaire(Figure 6A et 6B). De plus, la purification d’affinité de la protéine OST-RASGRP1 a été réalisée à l’aide de billes disponibles dans le commerce. Nous avons trouvé une plus grande quantité de protéine RASGRP1 dans les lysates cellulaires totaux des cellules Jurkat knock-in que dans celles des cellules de type sauvage; Les cellules Jurkat knockout RASGRP1 ont été utilisées comme témoins(Figure 6C). Après purification à l’aide de l’étiquette OST, seuls les échantillons knock-in avaient RASGRP1 détectable(Figure 6D).

Figure 1
Graphique 1. Stratégie de ciblage génique pour générer des lignées cellulaires knock-in mRosa26/hROSA26 surexprimant une protéine d’intérêt. (A) Les séquences de ciblage d’ARN guide spécifiques à mRosa26et les motifs adjacents (PAM) du protospacer dans le site d’insertion souhaité sont indiqués en lettres bleues et rouges, respectivement. Cas9 se fend normalement de 3 à 4 pb en amont de la séquence PAM, ce qui est indiqué par des flèches vertes. Le vecteur de ciblage est utilisé comme modèle pour la réparation dirigée par homologie (HDR) conduisant à l’insertion précise de la cassette d’expression dans le génome de la souris ou de l’homme. Chacune des séquences de 1 kb en amont et en aval du site cible souhaité est utilisée comme bras d’homologie (HA) de 5' et 3' dans le vecteur de ciblage. Les HAs sont séparés par une cassette d’expression composée d’un promoteur CAG, de la séquence d’ADNc de la protéine d’intérêt (POI) avec une étiquette OST, un rapporteur IRES-EBFP2 et un signal bGH-polyA (pA). Le site de restriction AscI est utilisé pour le clonage du POI, et EcoRI et BamHI sont utilisés pour la linéarisation du vecteur de ciblage. La stratégie pour le knock-in médié par CRISPR/Cas9 au locus hROSA26 est similaire. (B) Diagramme du locus ROSA26 humain. Les séquences de ciblage hR26-sg1 et hR26-sg2 sont indiquées en lettres bleues et les séquences PAM correspondantes en rouge. (C) Schéma du vecteur d’expression CRISPR tout-en-un pX458-DsRed2, qui contient une cassette d’expression sgRNA pilotée par U6 humain et une cassette rapporteur fluorescente Cas9-T2A-DsRed2. Deux sites de restriction BbsI permettent le clonage de l’ARN guide. U6, promoteur humain de l’ARN polymérase III de l’U6; sgRNA, un ARN chimérique monoguide; CBh, un promoteur hybride de poulet β-actine; NLS, signal de localisation nucléaire; T2A, peptide auto-épissant du virus Thosea asigna 2A; bGH-pA, signal de polyadénylation de l’hormone de croissance bovine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Tri unicellulaire des cellules RAW264.7 et Jurkat transfectées avec des vecteurs CRISPR/Cas9 et des vecteurs de ciblage pour une recombinaison homologue. Vecteurs de ciblage utilisés pour l’expression stable des gènes dans les cellules RAW264.7 (A) et Jurkat (C).  Diagrammes cytométriques en flux représentatifs des macrophages RAW264.7 (B) de souris et des lymphocytes T Jurkat humains (D) transfectés avec des vecteurs CRISPR/Cas9 exprimant le rapporteur DsRed2 et le vecteur cible exprimant le rapporteur EBFP2. Les cellules co-exprimant DsRed2 et EBFP2 ont été soumises à un tri cellulaire et cultivées pour l’expansion; les nombres adjacents aux zones délimitées indiquent le pourcentage de cellules dans chaque porte, et les cellules non transfectées ont été utilisées comme témoin négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Dépistage des cellules knock-in par détection de l’expression EBFP2. Analyse cytométrique en flux des macrophages EBFP2+ et DsRed2+ RAW264.7 (A) et des lymphocytes T de Jurkat (B) 14 jours après l’électroporation. Dans les histogrammes, l’intensité de fluorescence (FI) des cellules EBFP2+ ou DsRed2+ est affichée sur l’axe X et le nombre d’événements dans chaque canal de fluorescence est affiché sur l’axe Y. (A) L’expression d’EBFP2 et de hACE2 a été entraînée par le même promoteur au locus Rosa26 dans les macrophages murins RAW264.7. (B) Dans les cellules de Jurkat, l’expression d’OST-RASGRP1 est liée à l’expression d’EBFP2 au locus HUMAIN ROSA26. 14 jours après l’électroporation, l’analyse cytométrique en flux a révélé presque aucune cellule DsRed2+ parmi les cellules triées. Les cellules de type sauvage (WT) ont été utilisées comme témoin négatif, et KI signifie cellules knock-in. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Dépistage des cellules knock-in candidates par PCR et séquençage. (A) Stratégie de génération de cellules knock-in hACE2. Les positions des amorces PCR utilisées pour distinguer le HDR précis et l’insertion aléatoire sont indiquées par des flèches vertes. (B) Le génotypage par PCR de cinq cellules candidates (#4, #15, #22, #25 et #43) qui ont été identifiées par cytométrie en flux pour l’expression de l’EBFP2 comme illustré à la figure 3, a montré que la jonction 5' (1472 pb) et la jonction 3' (1472 pb) couvrant les bras d’homologie étaient correctes. M, échelle d’ADN; WT, le contrôle RAW264.7 de type sauvage; H2O, contrôle négatif. (C) Le séquençage Sanger des produits PCR à partir de B a révélé un knock-in réussi de la cassette d’expression hACE2 dans le locus mRosa26 sans mutations. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Graphique 5. Validation de l’entrée réussie de la cassette d’expression hACE2 dans le locus mRosa26 dans les macrophages RAW264.7. (A) Wt RAW264.7 macrophages ont été utilisés comme témoin négatif pour l’analyse cytométrique en flux. (B) Pour séparer les cellules EBFP2 positives des cellules négatives, une série supplémentaire de tri cellulaire a été effectuée pour obtenir une population composée de près de 100% de cellules knock-in EBFP2+, désignées comme cellules hACE2 KI. L’expression de DsRed2 a également été examinée pour s’assurer que le plasmide CRISPR/Cas9 n’était pas intégré dans le génome des macrophages RAW264.7. Dans les histogrammes, l’intensité de fluorescence (FI) des cellules EBFP2+ ou DsRed2+ est affichée sur l’axe X et le nombre d’événements dans chaque canal de fluorescence est affiché sur l’axe Y. (C) Détection de l’expression de hACE2 par analyse immunoblot à l’aide d’anticorps monoclonaux ACE2 anti-humains de lapin. L’expression de hACE2 a été observée dans des cellules provenant de plusieurs puits (#4, #15, #22, #25 et #43). Les macrophages WT RAW264.7 ont été utilisés comme témoin négatif et GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Graphique 6. Validation de l’introduction réussie de la cassette d’expression OST-RASGRP1 dans le locus hROSA26 dans les lymphocytes T de Jurkat. (A) Les lymphocytes T wt Jurkat ont été utilisés comme témoin négatif pour l’analyse cytométrique en flux. B) EBPF2+ sous-populations de cellules de Jurkat ont été enrichies par des cycles supplémentaires de tri cellulaire et élargies; ces cellules ont été désignées comme cellules OST-RASGRP1 KI. Les cellules knock-in ont été analysées par cytométrie en flux et n’ont pas conservé le vecteur exprimant DsRed2. Dans les histogrammes, l’intensité de fluorescence (FI) des cellules EBFP2+ ou DsRed2+ est affichée sur l’axe X et le nombre d’événements dans chaque canal de fluorescence est affiché sur l’axe Y. (C) Détection de l’expression d’OST-RASGRP1 dans deux cellules knock-in indépendantes (#1 et #2) par analyse immunoblot à l’aide d’anticorps anti-RASGRP1. Les cellules WT Jurkat et RASGRP1-knockout Jurkat ont été utilisées comme témoins et β-actine a été utilisée comme contrôle de charge. (D) La purification d’affinité médiée par OST a été utilisée pour valider l’expression d’OST-RASGRP1 en utilisant des cellules knockout RASGRP1 comme témoin négatif. Analyse immunoblot de quantités égales de protéines provenant de lysates cellulaires qui ont été soumises à une purification d’affinité sur des billes de streptoco-tactine sépharose (purification d’affinité) ou directement analysées (lysates totaux) et sondées avec des anticorps RASGRP1 ou GAPDH (contrôle de la charge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire : Figures, tableau et séquences à l’appui Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Dans nos expériences, nous avons démontré comment effectuer l’édition knock-in dans les cellules immunitaires, de la conception de la construction au criblage et à la validation des cellules knock-in, en utilisant les cellules T Jurkat humaines et les macrophages murins RAW264.7 à titre d’exemples. Les lignées cellulaires de lymphocytes T et de macrophages sont résistantes à la transfection36,37; cependant, le problème de la faible efficacité de la livraison CRISPR/Cas9 peut être surmonté à l’aide de rapporteurs fluorescents couplés au tri cellulaire. Ce protocole convient aux expériences de sauvetage de gènes et aux expériences d’interaction protéine-protéine, mais il ne peut pas être appliqué à l’étude de séquences d’ADN régulatrices telles que les sites de liaison des facteurs de transcription, car le protocole a été développé pour la modification knock-in du locus Rosa26.

Deux reporters fluorescents ont aidé CRISPR / Cas9 knock-in editing
Nous avons appliqué avec succès un système de rapporteur fluorescent double pour exprimer transitoirement des ensembles indépendants de vecteurs CRISPR/Cas9 dans les cellules immunitaires, ce qui a entraîné la suppression de gros fragments d’ADN dans des études antérieures21. Nous avons conçu un outil de ciblage CRISPR/Cas9 utilisant la protéine fluorescente DsRed2 comme rapporteur et une protéine fluorescente spectralement distincte supplémentaire pour suivre la livraison du modèle d’ADN pour la modification knock-in. Pour rendre possible la modification des allèles knock-in, nous avons utilisé le rapporteur de protéine fluorescente EBFP2, qui n’a pas de débordement spectral avec l’appel d’offres (DsRed2 dans notre cas), pour surveiller la transfection de l’ADN du donneur servant de modèle lors de la recombinaison homologue. Pour optimiser la cassette exprimant le POI et le rapporteur fluorescent, une séquence IRES a été introduite pour obtenir des protéines indépendantes. Dans notre étude précédente, nous avons noté que les acides aminés résiduels de l’agent de liaison P2A ou T2A restant après le clivage post-transcriptionnel affectaient la localisation des protéines à la surface de la cellule. La séquence IRES ne laisse pas de tels acides aminés résiduels. Comme décrit dans une étude précédente, l’IRES a donné lieu à des niveaux plus élevés du rapporteur fluorescent, suite à l’expression de la protéine Cas9 entraînée par le promoteur CAG38.

Plasmide CRISPR/Cas9 tout-en-un
Divers formats et combinaisons du système CRISPR/Cas9 ont été décrits dans des études antérieures, tels que la transfection Cas9 en tant qu’ARNm ou protéine avec des ARNg synthétisés chimiquement39. Les complexes CRISPR/Cas9 RNP ont également été livrés dans des cellules de mammifères; cette stratégie offre les avantages d’un début plus précoce de l’activité nucléase et d’une demi-vie plus courte; cependant, l’étiquetage des RNI est moins rentable que la construction de plasmides tout-en-un. Dans nos études précédentes, nous avons constaté que l’utilisation du tri unicellulaire pour isoler les cellules rares exprimant CRISPR / Cas9 (DsRed2 positif) et la protéine knock-in (EBFP2 positive) est beaucoup moins compliquée que l’utilisation de l’administration de RNP, et il est facile de préparer les plasmides. Il est vrai que ce protocole repose sur le tri d’une seule cellule. Mais notre protocole est facile à exécuter et permet des modifications d’entraînement réussies avec une reproductibilité élevée.

Expression d’un POI à partir du locus Rosa26
Il existe plusieurs rapports dans la littérature décrivant des méthodes de marquage des protéines endogènes avec des rapporteurs fluorescents utilisant l’édition CRISPR / Cas940,41,42. Les avantages du marquage endogène sont qu’il est possible de déterminer la localisation subcellulaire et d’effectuer un suivi in vivo de la protéine endogène. Cependant, des problèmes peuvent être rencontrés s’il n’est pas possible de concevoir un ARN guide CRIPSR approprié au locus endogène. Ici, nous avons développé une méthode alternative d’ingestion en incorporant POI-IRES-EBFP2 dans le locus de la sphère de sécurité génomique Rosa26, qui surmonte les limites de la recherche de guides appropriés pour le positionnement des étiquettes endogènes.

Nous résumons quelques points clés qui doivent être pris en compte au cours des expériences pour assurer la reproductibilité technique. Tout d’abord, le trieur de cellules doit avoir un laser violet de 405 nm pour l’excitation de l’EBFP2 et un laser bleu de 488 nm ou un laser jaune de 561 nm pour l’excitation de DsRed2. Avec de telles configurations, EBFP2 et DsRed2 peuvent être détectés sans débordement spectral, ce qui peut conduire à des résultats faussement positifs. Dans nos expériences, la proportion de cellules DsRed2+ EBFP2+ double positif était aussi faible que 0,9%; par conséquent, la recherche de la population appropriée était essentielle au succès des expériences. Un deuxième cycle de tri a été effectué pour griller les cellules POSITIVES EBFP2+, suivi de la validation par PCR. De plus, pour la détection des protéines knock-in, il est préférable d’introduire une étiquette protéique telle que OST ou un autre type de balise. L’élimination du gène avant les expériences de knock-in du locus Rosa26 offre une bonne occasion d’évaluer si l’anticorps a une spécificité souhaitable. Lorsque la spécificité de l’anticorps n’est pas suffisante, la détection de la protéine knock-in doit être effectuée après le retrait via l’étiquette protéique. Enfin, lors du criblage FACS des cellules exprimant l’allèle knock-in, l’intensité de l’EBFP2 peut être utilisée pour évaluer si deux copies ou une copie de l’allèle knock-in est présente.

Applications
Dans ce protocole, nous avons décrit la modification knock-in de RASGRP1, une molécule clé impliquée dans l’activation des lymphocytes T27. Nous avons d’abord obtenu des cellules Jurkat RASGRP1-knockout qui peuvent être utilisées pour des études de perte de fonction, et nous avons généré des cellules Jurkat supplémentaires exprimant OST-RASGRP1 au locus hROSA26. Les cellules de Jurkat sont la lignée cellulaire humaine la plus utilisée pour étudier la biologie des cellules T43. En raison du succès de l’immunothérapie dans la prévention de l’épuisement des lymphocytes T chez les patients cancéreux, les immunologistes et les biologistes du cancer ont un grand intérêt à modifier les cellules de Jurkat pour les études fonctionnelles des molécules candidates. Il convient également de noter que la lignée cellulaire Jurkat T est couramment utilisée pour la dissection des voies de signalisation, mais il existe des limites à l’utilisation de cette lignée cellulaire, car les cellules Jurkat sont de mauvais producteurs de γ d’IFN lors de la stimulation44. Des études antérieures ont utilisé à la fois la modification endogène du locus45 et le génie génétique au locus46 hROSA26 pour effectuer des expériences knock-in dans des cellules Jurkat humaines. Les deux stratégies ont leurs propres avantages; en modifiant le locus endogène, la protéine est vraisemblablement exprimée à un niveau « physiologique ». La modification par cognement au locus hROSA26 produit des résultats prévisibles car l’épissage alternatif de l’ARNm est évité et l’abondance de la protéine modifiée est également facilement détectable. D’autres refuges génomiques, tels que le site du virus adéno-associé 1(AAVS1)et le récepteur 5 de la chimiokine (motif CC)(CCR5),47,48 méritent d’être explorés plus en détail.

Dans notre étude précédente, lorsque Vav1-OST a été exprimé à des niveaux plus élevés au locus Rosa26 de souris dans les cellules RAW264.7, qui sont des cellules macrophages très fréquemment utilisées, nous avons pu détecter son interaction avec des molécules Vav3 faiblement exprimées en raison des niveaux élevés de protéines d’appât et de la haute efficacité de la purification par affinité OST13. Nous avons également décrit des expériences knock-in pour établir une lignée cellulaire de macrophages exprimant de manière stable hACE2, un récepteur du SARS-CoV-2, dans laquelle une expression abondante est garantie. Dans la base de données de séquençage de l’ARN unicellulaire, l’Ace2 murin est exprimé dans les macrophages pulmonaires, et le modèle cellulaire génétique exprimant hACE2 que nous avons développé pourrait être utile pour les études des macrophages au cours de l’infection par le SRAS-CoV-2.

Autres considérations
Ce protocole est conçu pour identifier les cellules knock-in qui expriment un POI à l’aide d’analyses cytométriques en flux d’un rapporteur fluorescent, dans notre cas le rapporteur EBFP2. Cependant, lorsque des anticorps de marque de surface détectables par FACS sont disponibles pour une protéine de surface49,il n’est pas nécessaire d’utiliser le système rapporteur50. Les lignées cellulaires de lymphocytes T et de macrophages, ainsi que les exemples de protéines marquées OST utilisées pour les études sur les interactomes, sont principalement utilisés pour les études de signalisation, et la majorité de ces molécules de signalisation sont localisées dans le cytosol ou les noyaux des cellules. Ainsi, un rapporteur fluorescent peut être nécessaire pour l’identification des cellules knock-in souhaitables.

Il est important de souligner que ce protocole a été développé pour les lignées cellulaires, et l’application aux cellules immunitaires primaires telles que les cellules T, les monocytes / macrophages n’a pas été validée. En raison de la capacité limitée des cellules à proliférer, nous ne recommandons pas ce protocole pour une utilisation avec les cellules immunitaires primaires. Comme le rapporteur fluorescent EBFP2 a été exprimé sous le même promoteur que le gène knock-in ou POI à l’aide d’un élément IRES, nous n’avons pas observé de cellules qui exprimaient le rapporteur fluorescent en l’absence du gène knock-in. Nous soupçonnons que la récupération des cellules exprimant les protéines fluorescentes dépend fortement du succès de la recombinaison homologue. Comme indiqué dans une étude précédente, il est fastidieux de trier, d’étendre et d’identifier les cellules knock-in correctes par tri de cellule unique lorsque l’efficacité d’entrée est très faible42, ce qui explique également pourquoi nous avons dû trier les cellules en vrac pour améliorer le taux de réussite.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions l’installation centrale de cytométrie en flux de l’Université médicale de Xinxiang. Le développement de cette technologie a été soutenu par des subventions de la NSFC 81601360 à LZ, 81471595 et 32070898 à YL. Le travail est également soutenu par la Fondation du Comité éducatif du Henan n ° 21IRTSTHN030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

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Immunologie et infection numéro 177 knock-in CRISPR/Cas9 Rosa26 macrophage lymphocytes T hACE2
Knock-in de gènes par CRISPR/Cas9 et tri cellulaire dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T
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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

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