Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Gene Knock-in door CRISPR/Cas9 en celsortering in macrofaag- en T-cellijnen

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende reporters en celsortering om knock-in experimenten in macrofaag- en T-cellijnen te vereenvoudigen. Twee plasmiden worden gebruikt voor deze vereenvoudigde knock-in experimenten, namelijk een CRISPR/Cas9- en DsRed2-tot expressie brengend plasmide en een homoloog recombinatiedonorplasmide dat EBFP2 tot expressie brengt, dat permanent is geïntegreerd op de Rosa26-locus in immuuncellen.

Abstract

Functionele genomics studies van het immuunsysteem vereisen genetische manipulaties die zowel deletie van doelgenen als toevoeging van elementen aan eiwitten van belang omvatten. Identificatie van genfuncties in cellijnmodellen is belangrijk voor genontdekking en verkenning van celintrinsieke mechanismen. Genetische manipulaties van immuuncellen zoals T-cellen en macrofaagcellijnen met behulp van CRISPR / Cas9-gemedieerde knock-in zijn echter moeilijk vanwege de lage transfectie-efficiëntie van deze cellen, vooral in een rustige toestand. Om genen in immuuncellen te modificeren, worden medicijnresistentieselectie en virale vectoren meestal gebruikt om te verrijken voor cellen die het CRIPSR / Cas9-systeem tot expressie brengen, wat onvermijdelijk resulteert in ongewenste interventie van de cellen. In een eerdere studie ontwierpen we dubbele fluorescerende reporters gekoppeld aan CRISPR / Cas9 die tijdelijk tot expressie kwamen na elektroporatie. Deze technische oplossing leidt tot snelle gendeletie in immuuncellen; gen knock-in in immuuncellen zoals T-cellen en macrofagen zonder het gebruik van medicijnresistentieselectie of virale vectoren is echter nog uitdagender. In dit artikel laten we zien dat door celsortering te gebruiken om de selectie te ondersteunen van cellen die tijdelijk CRISPR / Cas9-constructies tot expressie brengen die gericht zijn op de Rosa26-locus in combinatie met een donorplasmide, gen-knock-in kan worden bereikt in zowel T-cellen als macrofagen zonder verrijking van medicijnresistentie. Als voorbeeld laten we zien hoe menselijke ACE2, een receptor van SARS-Cov-2, die verantwoordelijk is voor de huidige Covid-19-pandemie, tot expressie kan worden brengen in RAW264.7-macrofagen door knock-in-experimenten uit te voeren. Dergelijke gen knock-in cellen kunnen op grote schaal worden gebruikt voor mechanistische studies.

Introduction

Immuuncellen zijn van cruciaal belang voor de verdediging tegen ziekteverwekkers. Zowel aangeboren als adaptieve immuniteit zijn vereist voor de klaring van infectanten en het behoud van weefselhomeostase1,2. Cellijnmodellen zijn essentiële hulpmiddelen voor het begrijpen van de moleculaire fundamenten van het immuunsysteem van zoogdieren; ze worden gebruikt in in vitro functionele assays, zoals die welke menselijke T-celactivatie modelleren, en bij het bepalen van de functie van genetische factoren bij het activeren of dempen van immuunresponsen3,4. Het is belangrijk op te merken dat het immuunsysteem van zoogdieren enorm heterogeen is en, even belangrijk, een groot aantal moleculen de differentiatie, migratie en functie van een bepaald celtyperegelen 5,6.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genome editing tools maken genetische manipulatie van specifieke celtypen mogelijk, wat functionele annotatie van genen op een precieze maniervergemakkelijkt 7,8. Verschillende gepubliceerde protocollen hebben de levering van CRISPR / Cas9 beschreven in de vorm van Cas9-gids RNA-complexen die bekend staan als ribonucleoproteïnen (RSP's) in HEK293-cellen, Jurkat-cellijnen, primaire T-cellen9,10,macrofagen11,12,13,stamcellen14en anderen15,16. In deze protocollen wordt gentagging meestal bereikt door een fluorescerende tag te fuseren met endogene eiwitten17,18. Er zijn echter weinig pogingen gedaan om dubbele fluorescerende reporters te gebruiken, die compatibel zijn met het sorteren van eencellige cellen, om knock-in experimenten19,20, met name in immuuncellen te vergemakkelijken.

Diepgaande mechanistische analyses gericht op het begrijpen van de functies van een nieuwe genetische factor in immuuncellen vereisen over het algemeen celtype specifieke deletie van een gen, genetische reddingsexperimenten en idealiter identificatie van de interactoren. Hoewel methoden voor optimalisatie van genetische deletie van genen in immuuncellen zijn gepubliceerd9,15,21,zijn er veel minder methoden gemeld voor het introduceren van knock-in allelen met veelzijdige functies om de immuunrespons te begrijpen. Daarom willen we in dit protocol in detail een efficiënt en zeer reproduceerbaar protocol beschrijven om een eiwit van belang (POI) tot expressie te brengen op de veiligehaven locus Rosa26 in zowel menselijke als muriene immuuncellijnen. We hebben een tweekleurig reportersysteem ontworpen om te verrijken voor cellen die zijn getransfecteerd met plasmiden die CRISPR / Cas9 (DsRed2) tot expressie brengen en een recombinant DNA-sjabloon (EBFP2), die kan worden geïsoleerd door celsortering. Volgens dit protocol verkregen we meerdere knock-in lijnen van de menselijke T-cellijn Jurkat en murine macrofaag RAW264.7 voor functionele analyses van slecht bestudeerde eiwitten.

Als voorbeeld laten we in dit protocol zien hoe je knock-in RAW264.7 macrofagen kunt verkrijgen die stabiel menselijke ACE2 (een receptor van SARS-Cov-2) tot expressie brengen22. Omdat aangeboren immuuncellen betrokken zijn bij de pathogenese van Covid-1923,24 en menselijk ACE2 wordt beschouwd als een belangrijke receptor die nodig is voor virale binnenkomst in cellen vóór replicatie, kunnen macrofagen met knock-in van humaan ACE2 dienen als een nuttig hulpmiddel voor mechanistische studies van virale vermenigvuldiging in macrofagen. Tegelijkertijd presenteren we ook een voorbeeld van knock-in van een gen op de menselijke ROSA26-locus om het RASGRP1-eiwit tot expressie te brengen, dat aan zijn amino-eindpunt was gefuseerd met een affiniteit Twin-Strep-tag (OST). T-cellen zijn belangrijke doelcellen in immuuntherapieën en een toenemend aantal studies heeft zich gericht op manipulatie van hun reactievermogen op kanker25,26. Aangezien Rasgrp1 bekend staat als een belangrijk signaalmolecuul stroomafwaarts van de T-celreceptor en de interactoren niet goed worden opgehelderd27, biedt het OST-RASGRP1 knock-in model de basis voor het identificeren van interactoren die de reactie van T-cellen op tumoren en infecties reguleren. Samen kunnen deze tools worden gebruikt voor Covid-19-studies en de ontdekking van nieuwe moleculen die interageren met Rasgrp1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ontwerp en plasmideconstructie van sgRNA's gericht op Rosa26 Locus

  1. Ontwerpgids RNA's rond de gewenste invoegplaats
    1. Ervoor zorgen dat de inbrengplaats voor muis Rosa26 (hierna aangeduid als mRosa26)knock-in experimenten zich in het eerste intron van mRosa26bevindt; deze site is gebruikt in eerdere studies28,29. Voor knock-in experimenten in menselijke cellen, zorg ervoor dat de insertieplaats zich bevindt in de menselijke ROSA26-locus (hierna hROSA26genoemd), die is geïdentificeerd als de menselijke homoloog van mRosa2630.
    2. Gebruik de genomische sequenties van muis- en menselijke soorten die zijn verkregen uit respectievelijk Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) en Ensembl genome browser (http://www.ensembl.org/index.html). Kopieer 50 basenparen (bp) van de genomische sequentie van de mRosa26- of hROSA26-locus aan elke zijde die de gewenste insertieplaats flankeert.
    3. Ontwerpgids RNA's met behulp van de online webtool CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Plak de 100 bp van de invoervolgorde van 1.1.2. Selecteer twee gids-RNA's met een hoge specificiteitsscore, een hoge efficiëntiescore en een lage off-target activiteit. Kies bovendien RNA-gidsen met hogere Doench-scores en vermijd die met het label "Inefficiënt"32.
      OPMERKING: Alternatieve CRISPR-ontwerptools zijn ook waardevol en openbaar beschikbaar, bijvoorbeeld de Benchling CRISPR-ontwerptool (https://benchling.com/crispr). Om de frequentie van CRISPR/Cas9-gemedieerde knock-in gemuteerde cellen te verhogen, selecteert u indien mogelijk twee geleide RNA's dicht bij de gewenste inbrengplaats33.
    4. Gebruik voor de mRosa26-locus twee aangrenzende geleidings-RNA's die zijn aangewezen als mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') en mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (Figuur 1A). Gebruik voor de hROSA26-locus twee aangrenzende geleidings-RNA's, namelijk hR26-sg1 (5'- GGCGATGAGACGAGATCACGCG -3') en hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Figuur 1B).
      OPMERKING: Genoombewerkingsactiviteiten van mR26-sg1 en mR26-sg2 en die van hR26-sg1 en hR26-sg2 werden geëvalueerd in respectievelijk RAW264.7-cellen en Jurkat-cellen (zie aanvullend bestand, figuur S1).
  2. Klonen van CRISPR-expressievectoren die sgRNA bevatten en gericht zijn op de Rosa26 Locus
    1. Synthetiseer voorwaartse en omgekeerde oligo's voor één gids-RNA (zie aanvullend bestand).
      OPMERKING: Het verdient de voorkeur om een 'G'-nucleotide toe te voegen aan het begin van de gidssequentie, wat helpt bij de expressie aangestuurd door de U6-promotor. Om bijvoorbeeld de bovengenoemde mR26-sg1 te klonen, is het voorwaartse oligo CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT en het omgekeerde oligo is AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. De extra G in het voorwaartse oligo en het complement ervan in het omgekeerde oligo worden vetgedrukt aangegeven.
    2. Kloon synthetische oligo's die overeenkomen met de gids RNA's in de alles-in-één CRISPR-expressievector pX458-DsRed2 gegenereerd in ons vorige werk21 (Figuur 1C) met behulp van het algemene protocol voor gRNA-klonen ontwikkeld door Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); sla echter de gelzuiveringsstap over en zuiver de verteerde vector met behulp van een PCR-zuiveringskit (zie Tabel met materialen).
      OPMERKING: In eerdere protocollen werd gelzuivering van de BbsI-verteerde vector uitgevoerd; deze stap is echter tijdrovend. In het huidige protocol wordt het verteerde product gezuiverd met behulp van een PCR-zuiveringskit en direct gebruikt voor de stroomafwaartse ligatiereactie, die over het algemeen positieve kolonies met vergelijkbare efficiëntie produceert.
    3. Transformeer 10 μL van het ligatieproduct (stap 1.2.2) in 50 μLEscherichia coli DH5α competente cellen volgens de instructies van de fabrikant. Kies willekeurig drie kolonies uit een LB-agarplaat met ampicilline (100 μg / ml) en en ent elk in 3 ml LB-medium met ampicilline om 's nachts te kweken.
    4. Gebruik 1 ml van de nachtelijke bacteriekweek voor Sanger-sequencing en houd de rest op 4 °C totdat is bevestigd dat de constructie correct is: pDsR-mR26-sg1 en pDsR-mR26-sg2 voor mRosa26 locus knock-in, en pDsR-hR26-sg1 en pDsR-hR26-sg2 voor de hROSA26 locus.
    5. Bereid een hoge concentratie plasmide-DNA (ongeveer 2 μg/μL) voor met een maxiprep-kit voor de zuivering van plasmide van transfectiekwaliteit (zie Materiaaltabel).

2. Ontwerp en constructie van targetingvectoren als homologe recombinatiesjablonen

  1. Een op homologie gerichte reparatiesjabloon ontwerpen
    1. Ontwerp een targetingvector om de POI constitutief uit te drukken met behulp van een expressiecassette die is geoptimaliseerd uit een eerdere studie29, die een CAG-hybride promotor, een AscI-beperkingslocatie voor het klonen van het cDNA van de POI, een IRES-EBFP2-reporter en een bovine growth hormone polyadenylation (bGH-polyA) -signaal(Figuur 1B en aanvullend bestand)omvat.
    2. Ontwerp homologiearmen (HAs) die homologie delen met de genomische sequenties van de mRosa26- of hROSA26-locus. Neem ~1 kb van de 5' HA op die overeenkomt met de stroomopwaartse genomische sequentie van de gewenste invoegplaats links van de expressiecassette. Neem op dezelfde manier ~1 kb van de 3' HA op die overeenkomt met de stroomafwaartse genomische sequentie van de invoegplaats rechts van de expressiecassette.
      OPMERKING: De expressiecassette wordt zo dicht mogelijk bij de CRISPR/Cas9-splitsingsplaatsengeplaatst 34. Om te voorkomen dat het beoogde allel opnieuw wordt gesneden door CRISPR/Cas9, neemt u nucleotideveranderingen op in de protospacer-aangrenzende motief (PAM) -reeks (5'-NGG-3') in de targetingvector34,35.
    3. Om linearisatie van de targetingvector mogelijk te maken, voegt u een unieke EcoRI-site in net stroomopwaarts van de 5 ' HA en een unieke BamHI-site net stroomafwaarts van de 3 ' HA.
    4. Laat een commerciële leverancier de targetingvectoren synthetiseren en ze aanwijzen als pKR26-iBFP en pKhR26-iBFP voor respectievelijk mRosa26 en hROSA26 knock-in.
  2. Een targetingvector maken als een op homologie gerichte reparatiesjabloon
    1. Om de POI tot uitdrukking te brengen, verkrijgt u de cDNA-sequentie (coderingssequentie) van de Ensembl-genoombrowser en kiest u het transcript met de langste eiwitsequentie. Het cDNA van het menselijke ACE2-gen is bijvoorbeeld ACE2-202 ENST00000427411.2 en het cDNA van het menselijke RASGRP1-gen is RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Synthetiseer de cDNA van de POI met de hulp van een commerciële leverancier. Het is ook mogelijk om het cDNA te klonen via PCR-versterking (hier niet beschreven). Plaats de reeks GGCGCGCCACC (5' - 3'), die een AscI-restrictiesite (cursief en vetgedrukt) en Kozak consensusvertalingsinitiatie-initiatieplaats (onderstreept) bevat, vlak voor het ATG-initiatiecodon van het cDNA en een andere AscI-restrictieplaats (5'- GGCGCGCC -3') na het stopcodon van het cDNA.
    3. Verteer de gesynthetiseerde sequentie met AscI en zuiver met behulp van een PCR-zuiveringskit die is ontworpen voor het zuiveren van DNA-fragmenten na beperkingsvertering, volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
    4. Ligate de gezuiverde cDNA-insert in de AscI-lineaire backbonevector pKR26-iBFP of pKhR26-iBFP met behulp van T4 DNA-ligase volgens de instructies van de fabrikant.
    5. Controleer de uiteindelijke targetingvector, pKR26-POI-iBFP of pKhR26-POI-iBFP, door middel van sequencing. Gebruik maxiprep om de geverifieerde constructies te zuiveren volgens het protocol van de fabrikant.
    6. Verteer de targetingvector met EcoRI of BamHI en zuiver het verteringsproduct met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar de gelineariseerde richtvector (~0,8 μg/μL) bij -20 °C tot elektroporatie.

3. Elektroporatie van macrofaag- en T-cellijnen

  1. Celculturen voorbereiden op elektroporatie
    1. Bereid Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 voor, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) als volledig groeimedium voor Jurkat T-cellen. Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) voor met 10% FBS voor het kweken van RAW264.7 macrofagen. Vul alle complete groeimedia aan met 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine (Pen/Strep), behalve voor media die worden gebruikt voor posttransfectie-incubatie vóór celsortering.
    2. Voer subculturing van RAW264.7- en Jurkat T-cellen uit volgens de instructies van de leverancier (zie materiaaltabel). Gebruik bij het subcultureren van RAW264.7-cellen trypsine-EDTA-oplossing (0,25%) om cellen los te maken. Gebruik FBS aangevuld met 10% (v/v) DMSO als cryopreservatiemedium voor RAW264.7 en Jurkat cellen.
    3. Verzamel cellen bij 250 × g gedurende 5 minuten voor RAW264.7 macrofagen en 90 × g gedurende 8 minuten voor Jurkat T-cellen. Was vervolgens met 5-10 ml 1× DPBS (zonder Ca2+ of Mg2+ ionen). Verwijder de DPBS.
    4. Resuspend de celkorrel met behulp van 2 ml 1× DPBS. Gebruik 10 μL cellen en meng met een gelijk volume van 0,2% trypan blauw om het celgetal en de levensvatbaarheid te schatten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de celkweek >90% levensvatbaar is op de dag van transfectie.
    5. Voor een enkel knock-in experiment voert u elektroporatie uit met 10 μL nucleofection tips met vijf herhalingen. Bereken het volume dat nodig is voor 2,0 × 106 cellen en pellet de cellen door centrifugeren. Was de celkorrel opnieuw met 1× DPBS zoals beschreven in stap 3.1.3.
      OPMERKING: Bij gebruik van 10 μL nucleofection tips zijn 4,0 × 105 cellen nodig per elektroporatie. Bereid daarom ten minste 2,0 × 106 cellen voor op één knock-in-experiment.
    6. Bereid een 24-well plaat met 0,5 ml volledig groeimedium (bereid in stap 3.1.1) per put zonder Pen/Strep en bereid voor in een incubator van 37 °C.
  2. Elektroporatie van CRISPR/Cas9-componenten en de targetingvector
    1. Schakel het elektroporatiesysteem in. Gebruik elektroporatieparameters die in een eerdere studie zijn geoptimaliseerd21:1.400 V/20 ms/2 pulsen voor RAW264.7 macrofagen en 1350 V/20 ms/2 pulsen voor Jurkat T-cellen.
    2. Rekening houdend met monsterverlies als gevolg van pipetteren, bereidt u een elektroporatiemengsel van 55 μL voor in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml met 2,5 μg van elke CRISPR / Cas9-vector, 2,4 μg van de gelineariseerde targetingvector en de Resuspension Buffer R.
      OPMERKING: Om tijd te besparen, kan het elektroporatiemengsel worden bereid tijdens het centrifugeren (stap 3.1.5).
    3. Resuspend 2.0 × 106 cellen (bereid in stap 3.1.5) in het elektroporatiemengsel van 55 μL uit stap 3.2.2.
    4. Spirateer het cel/elektroporatiemengsel uit stap 3.2.3 met behulp van een nucleofectiontip van 10 μL met een pipet.
      OPMERKING: Vermijd tijdens het pipetteren het introduceren van luchtbellen, die elektroporatiefouten kunnen veroorzaken.
    5. Voeg het monster toe aan een buis gevuld met 3 ml buffer E uit de elektroporatiekit.
    6. Pas de elektroporatieparameters toe voor de twee celtypen zoals beschreven in stap 3.2.1.
    7. Breng het monster over in één put van de 24-putplaat met voorgewarmd medium uit stap 3.1.6.
    8. Herhaal stap 3.2.4-3.2.7 voor de andere vier herhalingen en voor de besturingselementen alleen voor de targetingvector en alleen CRISPR-expressievector.
      OPMERKING: Verander de nucleofection tip en buis bij het overschakelen naar een ander celtype / plasmide DNA.
    9. Kweek de getransfecteerde cellen gedurende 48-72 uur om herstel mogelijk te maken na elektroporatie en expressie van CRISPR / Cas9-componenten voorafgaand aan flowcytometrieanalyse of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Onderzoek de expressie van DsRed2 met behulp van een fluorescerende microscoop uitgerust met een rood kanaal 24 uur na transfectie.
      OPMERKING: Een voordeel van het monitoren van DsRed2 fluorescerende cellen is dat de efficiëntie van elektroporatie kan worden geschat en de geschiktheid voor verdere celsortering kan worden voorspeld.

4. Celsortering om vermeende knock-in cellen te isoleren

  1. Was de getransfecteerde cellen vóór het sorteren van FACS eenmaal met volledig groeimedium. Pelletcellen door centrifugeren zoals beschreven in stap 3.1.3 en resuspenderen van de pellet in 500 μL vers medium.
  2. Stel de celsorteerder (in een bioveiligheidskast) in met een mondstuk van 85 μm en een laag debiet. Selecteer de "single cell" -modus voor het sorteren en test de sorteerefficiëntie en precisie van één cel door 20-30 cellen te sorteren op het deksel van 96-well microplaat. Eén druppel gelokaliseerd in het midden van elke put geeft de juiste opstelling van het instrument aan.
  3. Breng de celsuspensie van stap 4.1 over in steriele FACS-buizen en voeg SYTOX Red Dead Cell Stain toe tot een eindconcentratie van 1 nM.
  4. Analyseer monsters op de celsorteerder. SYTOX Red en EBFP2 worden opgewonden door een 405 nm laser en gedetecteerd door respectievelijk de V450/BV421- en APC-kanalen. DsRed2 wordt aangeslagen door een 488 nm laser en gedetecteerd door het PE-kanaal. Gebruik niet-getransfecteerde cellen en EBFP2- en DsRed2-enkele positieve cellen als controles voor spectrale compensatie.
  5. Sorteer 10 afzonderlijke cellen in elke put van een microplaat met 96 putten met 150 μL per put voorverwarmd volledig groeimedium. Gebruik microplaten met ronde bodem voor het kweken van suspensiecellijnen zoals Jurkat T-cellen en microplaten met platte bodem voor aanhangende RAW264.7-macrofagen.
    OPMERKING: Het sorteren van 10 cellen per put is een geoptimaliseerde strategie voor het verbeteren van de celoverleving en het minimaliseren van het aantal 96-well microplaten die moeten worden gezaaid en het aantal monsters dat moet worden gescreend door flowcytometrie en genotypering; als er slechts één cel per put wordt gesorteerd, is het zaaien van meer microplaten vereist om de kans op het verkrijgen van correct bewerkte cellen te vergroten.

5. Screening en validatie van positieve knock-in cellen

  1. Screening op kandidaat knock-in cellen door flowcytometrie
    1. Incubeer de cellen vanaf stap 4.5 gedurende 10-15 dagen en voeg elke 3 dagen een volledig groeimedium toe om vloeistof te vervangen die verloren is gegaan door verdamping. Voor Jurkat T-cellen, breng cellen gekweekt in de ronde onderste 96-well plaat naar een platte bodemplaat om celproliferatie te optimaliseren.
    2. Breng de geëxpandeerde gesorteerde cellen over naar platen met 48 putten voor verdere uitbreiding.
    3. Wanneer cellen dicht bij samenvloeiing zijn, gebruik dan de helft van de cultuur om te screenen op EBFP2-expressie door flowcytometrie(figuur 3). Normaal gesproken komt de helft van de cultuur in een 48-putplaat na confluentgroei overeen met 0,5-1,0 × 105 cellen, wat voldoende is voor analyse van één monster door flowcytometrie.
    4. Breng de resterende cellen over naar 24-well platen voor verdere proliferatie.
    5. Houd de kandidaat-celpopulaties in het bezit van een hoog percentage EBFP2-positieve cellen voor verdere genotyperingsexperimenten.
      OPMERKING: Omdat 10 cellen in elke put van de 96-well microplaat worden gesorteerd, is het mogelijk dat de knock-in cellen groeien met cellen die het knock-in gen niet tot expressie brengen. Daarom is het normaal om een extra ronde celsortering uit te voeren om de EBFP2-positieve cellen van de negatieve cellen te scheiden.
  2. Screening op kandidaat knock-in cellen door PCR en sequencing
    1. Verzamel 2 × 105 kandidaatcellen. Extraheer het genomische DNA met behulp van een DNA-voorbereidingskit (zie tabel met materialen).
    2. Om te verifiëren dat nauwkeurige homologie-gerichte reparatie (HDR) heeft plaatsgevonden op de mRosa26-locus in plaats van op willekeurige locaties in het genoom van de kandidaat-knock-in-cellen, voert u PCR uit met primers die zich over elke kant van de HAs uitspannen(figuur 4). Kies een primer in het genomische gebied buiten de targetingvector (extern oligo) en een andere primer in de targetingvector (intern oligo).
      OPMERKING: Een vergelijkbaar ontwerp wordt gebruikt om HDR te verifiëren op de hROSA26-locatie. PCR-primers kunnen ook eenvoudig worden ontworpen voor het detecteren van het invoegen van de POI-reeks. Bovendien kunnen de wild-type en knock-in allel genotypen tegelijkertijd worden gedetecteerd met behulp van pcr met drie primer (zie aanvullend bestand, figuur S2).
    3. Kloon de positieve PCR-producten met behulp van een snelkloonkit (zie Materialentabel). Transformeer het reactiemengsel in DH5α competente cellen.
    4. Kies willekeurig 8-10 individuele bacteriekolonies per transformatie en sequentieer de PCR-producten uit stap 5.2.3 door Sanger-sequencing.
  3. Validatie van positieve knock-in cellen door immunoblotanalyse en affiniteitszuivering
    OPMERKING: Kandidaat-cellen worden onderworpen aan immunoblotanalyse voor validatie van het inbrengen van de POI, of affiniteitszuivering (AP) voor studies naar eiwit-eiwitinteractie.
    1. Voer immunoblotanalyse uit volgens de instructies van de antilichaamfabrikant. Zie tabel met materialen voor informatie over het gebruik van primaire antilichamen en secundaire antilichamen.
    2. Onderwerp de lysaten van de knock-in cellen die de OST-gelabelde POI uitdrukken aan AP met behulp van Strep-Tactin Sepharose-kralen volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
    3. Detecteer chemiluminescentie met behulp van een imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Volgens het hierboven beschreven protocol om knock-in experimenten uit te voeren op de mRosa26-locus met behulp van murine RAW264.7 macrofagen, hebben we een targetingvector ontworpen om menselijke ACE2 tot expressie te brengen, een receptor voor het SARS-Cov-2-virus (Figuur 2A). Met behulp van een vergelijkbaar ontwerp genereerden we menselijke Jurkat T-cellen met knock-in van het OST-gelabelde RASGRP1-fusie-eiwit(Figuur 2C). Na transfectie van drie plasmiden, waarvan er twee werden gebruikt voor de expressie van CRISPR/Cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 en pDsR-mR26-sg2 voor mRosa26 knock-in; pDsR-hR26-sg1 en pDsR-hR26-sg2 voor de hROSA26 knock-in) en een andere gebruikt als DNA-sjabloon voor homologe recombinatie (EBFP2), werden dubbele positieve cellen die twee fluorescerende reporters tot expressie brengen gesorteerd in een 96-well plaat. Van de RAW264.7-cellen gesorteerd met behulp van de sorteermodus met één cel, was 0,91% DsRed2+ EBFP2+,maar 10 cellen werden verzameld in elke put(Figuur 2B). De Jurkat T-cellen hadden een hogere transfectie-efficiëntie en het percentage dubbelpositieve cellen was 7,91% in dit representatieve experiment, wat een succesvolle knock-in van het OST-RASGRP1-fusie-eiwit aantoont(figuur 2D).

In de volgende stap werd flowcytometrie gebruikt om te screenen op de kandidaat-putten met EBFP2-positieve cellen. Representatieve histogrammen toonden aan dat er duidelijke EBFP2-positieve populaties waren(figuur 3). Het is opmerkelijk dat de knock-in cellen geen DsRed2 tot expressie brachten toen flowcytometrie twee weken na celsortering werd uitgevoerd.

Voor discriminatie van precieze knock-ins en willekeurige inserties werd genomisch DNA van de EBFP2-positieve cellen verder getest door PCR uit te voeren met primers die genomische sequentie buiten de HAs van de targetingvector en het specifieke gebied in de expressiecassette herkennen(Figuur 4A en 4B). Sequentieanalyse van deze PCR-producten bevestigde het optreden van HDR op de mRosa26-doellocatie (figuur 4C). Dezelfde genotyperingsstrategie kan worden toegepast om de precieze invoeging van de expressiecassette inde hROSA26-locus van Jurkat T-cellen te valideren.

Om een zuivere populatie van hACE2-tot expressie brengende RAW264.7-cellen te verkrijgen, hebben we de cellen verder gesorteerd en de aanwezigheid van de fluorescerende reporters gevalideerd na expansie met behulp van wild-type cellen als controles (Figuur 5A). De geëxpandeerde cellen waren EBFP2-positief en het hACE2-eiwit was gemakkelijk detecteerbaar in muriene RAW264.7 macrofagen(figuur 5B en 5C). Evenzo hebben we de expressie van fluorescerende verslaggevers en het OST-RASGRP1-eiwit in menselijke Jurkat T-cellen gevalideerd na screening en een tweede ronde van celsortering(figuur 6A en 6B). Bovendien werd affiniteitszuivering van het OST-RASGRP1-eiwit uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare kralen. We vonden een hogere hoeveelheid RASGRP1-eiwit in de totale cellysaten van knock-in Jurkat-cellen dan in die van wild-type cellen; RASGRP1 knockout Jurkat cellen werden gebruikt als controles (Figuur 6C). Na zuivering met behulp van de OST-tag hadden alleen de knock-in monsters detecteerbare RASGRP1(Figuur 6D).

Figure 1
Figuur 1. Gen targeting strategie voor het genereren van mRosa26/hROSA26 knock-in cellijnen die een eiwit van belang overexpressie geven. (A) mRosa26-specifieke gids RNA targeting sequenties en de protospacer aangrenzende motieven (PAMs) in de gewenste insertieplaats zijn respectievelijk in blauwe en rode letters aangegeven. Cas9 splitst normaal gesproken 3-4 bp stroomopwaarts van de PAM-sequentie, die wordt aangegeven door groene pijlen. De targetingvector wordt gebruikt als een sjabloon voor homologie-gerichte reparatie (HDR) die leidt tot de precieze invoeging van de expressiecassette in het muis- of menselijk genoom. Elk van de 1 kb-sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de gewenste doellocatie wordt gebruikt als 5'- en 3'-homologiearmen (HAs) in de targetingvector. De HAs worden gescheiden door een expressiecassette bestaande uit een CAG-promotor, de cDNA-sequentie van het eiwit van belang (POI) met een OST-tag, een IRES-EBFP2-reporter en een bGH-polyA-signaal (pA). De restrictiesite AscI wordt gebruikt voor het klonen van de POI en EcoRI en BamHI worden gebruikt voor linearisatie van de targetingvector. De strategie voor CRISPR/Cas9-gemedieerde knock-in op de hROSA26-locus is vergelijkbaar. (B) Diagram van de menselijke ROSA26 locus. De doelsequenties hR26-sg1 en hR26-sg2 worden aangegeven in blauwe letters en de bijbehorende PAM-sequenties in rood. (C) Schema voor de alles-in-één CRISPR-expressievector pX458-DsRed2, die een menselijke U6-gestuurde sgRNA-expressiecassette en Cas9-T2A-DsRed2 fluorescerende reportercassette bevat. Twee BbsI-restrictieplaatsen maken het klonen van het gids-RNA mogelijk. U6, humane U6 RNA polymerase III promotor; sgRNA, een chimere single-guide RNA; CBh, een kip β-actine hybride promotor; NLS, nucleair lokalisatiesignaal; T2A, Thosea asigna virus 2A zelfsplitsende peptide; bGH-pA, bovine groeihormoon polyadenylation signaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Eencellige sortering van RAW264.7- en Jurkat-cellen getransfecteerd met CRISPR/Cas9-vectoren en targetingvectoren voor homologe recombinatie. Targetingvectoren die worden gebruikt voor stabiele genexpressie in RAW264.7 (A) en Jurkat (C) cellen. Representatieve flowcytometrische plots van muis RAW264.7 macrofagen (B) en menselijke Jurkat T-cellen (D) getransfecteerd met CRISPR/Cas9-vectoren die de DsRed2-reporter en de targetingvector uitdrukken die de EBFP2-reporter uitdrukken. Cellen die DsRed2 en EBFP2 co-expresseerden, werden onderworpen aan celsortering en gekweekt voor expansie; getallen grenzend aan geschetste gebieden geven het percentage cellen in elke poort aan, en niet-getransfecteerde cellen werden gebruikt als een negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Screening van knock-in cellen door detectie van EBFP2-expressie. Flowcytometrische analyse van EBFP2+ en DsRed2+ RAW264.7 macrofagen (A) en Jurkat T-cellen (B) 14 dagen na elektroporatie. In de histogrammen wordt de fluorescentie-intensiteit (FI) van EBFP2+ of DsRed2+ cellen weergegeven op de X-as en het aantal gebeurtenissen in elk fluorescentiekanaal wordt weergegeven op de Y-as. (A) De expressie van EBFP2 en hACE2 werd aangestuurd door dezelfde promotor op de Rosa26-locus in RAW264.7 murine macrofagen. (B) In Jurkat-cellen is OST-RASGRP1-expressie gekoppeld aan EBFP2-expressie op de menselijke ROSA26-locus. Na 14 dagen na de elektroporatie onthulde flowcytometrische analyse bijna nul DsRed2+ -cellen onder de gesorteerde cellen. Wild-type (WT) cellen werden gebruikt als een negatieve controle, en KI staat voor knock-in cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. Screening op kandidaat knock-in cellen door PCR en sequencing. (A) Strategie voor het genereren van hACE2 knock-in cellen. De posities van PCR-primers die worden gebruikt om nauwkeurige HDR en willekeurige insertie te onderscheiden, worden aangegeven met groene pijlen. (B) PCR-genotypering van vijf kandidaatcellen (#4, #15, #22, #25 en #43) die werden geïdentificeerd door flowcytometriescreening voor EBFP2-expressie zoals geïllustreerd in figuur 3, toonde aan dat zowel de 5'-junctie (1472 bp) als de 3'-junctie (1472 bp) over de homologiearmen correct waren. M, DNA-ladder; WT, de wild-type RAW264.7 besturing; H2O, negatieve controle. (C) Sanger-sequencing van de PCR-producten van B onthulde een succesvolle knock-in van de hACE2-expressiecassette in de mRosa26-locus zonder mutaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5. Validatie van succesvolle knock-in van de hACE2 expressiecassette in de mRosa26 locus in RAW264.7 macrofagen. (A) WT RAW264.7 macrofagen werden gebruikt als negatieve controle voor flowcytometrische analyse. (B) Om de EBFP2-positieve cellen van de negatieve cellen te scheiden, werd een extra ronde celsortering uitgevoerd om een populatie te verkrijgen die bestaat uit bijna 100% EBFP2+ knock-in cellen, aangeduid als hACE2 KI-cellen. DsRed2-expressie werd ook onderzocht om ervoor te zorgen dat het CRISPR/Cas9-plasmide niet werd geïntegreerd in het genoom van RAW264.7-macrofagen. In de histogrammen wordt de fluorescentie-intensiteit (FI) van EBFP2+ of DsRed2+ cellen weergegeven op de X-as en het aantal gebeurtenissen in elk fluorescentiekanaal wordt weergegeven op de Y-as. (C) Detectie van hACE2-expressie door immunoblotanalyse met behulp van konijn anti-humaan ACE2 monoklonaal antilichaam. Expressie van hACE2 werd waargenomen in cellen uit meerdere putten (#4, #15, #22, #25 en #43). WT RAW264.7 macrofagen werden gebruikt als negatieve controle en GAPDH werd gebruikt als belastingsregeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6. Validatie van succesvolle knock-in van de OST-RASGRP1 expressiecassette in de hROSA26 locus in Jurkat T cellen. (A) WT Jurkat T cellen werden gebruikt als negatieve controle voor flow cytometrische analyse. (B) EBPF2+ subpopulaties van Jurkat-cellen werden verrijkt met extra celsorteringsrondes en uitgebreid; deze cellen werden aangeduid als OST-RASGRP1 KI-cellen. De knock-in cellen werden geanalyseerd door flowcytometrie en hielden de DsRed2-expresserende vector niet. In de histogrammen wordt de fluorescentie-intensiteit (FI) van EBFP2+ of DsRed2+ cellen weergegeven op de X-as en het aantal gebeurtenissen in elk fluorescentiekanaal wordt weergegeven op de Y-as. (C) Detectie van OST-RASGRP1-expressie in twee onafhankelijke knock-in cellen (#1 en #2) door immunoblotanalyse met behulp van anti-RASGRP1-antilichaam. WT Jurkat en RASGRP1-knockout Jurkat cellen werden gebruikt als controles en β-actine werd gebruikt als de belastingscontrole. (D) OST-gemedieerde affiniteitszuivering werd gebruikt om de expressie van OST-RASGRP1 te valideren met behulp van RASGRP1 knock-outcellen als een negatieve controle. Immunoblot-analyse van gelijke hoeveelheden eiwitten uit cellysaten die ofwel werden onderworpen aan affiniteitszuivering op Strep-Tactin Sepharose-kralen (Affiniteitszuivering) of direct werden geanalyseerd (Totaal lysaten) en onderzocht met RASGRP1- of GAPDH-antilichamen (belastingscontrole). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand: ondersteunende figuren, tabel en reeksen Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In onze experimenten hebben we aangetoond hoe we knock-in-bewerkingen in immuuncellen kunnen uitvoeren, van constructontwerp tot knock-in celscreening en validatie met behulp van menselijke Jurkat T-cellen en murine RAW264.7 macrofagen als voorbeelden. Zowel T-cel- als macrofaagcellijnen zijn bestand tegen transfectie36,37; het probleem van de lage efficiëntie van CRISPR / Cas9-levering kan echter worden opgelost met behulp van fluorescerende verslaggevers in combinatie met celsortering. Dit protocol is geschikt voor genreddingsexperimenten en eiwit-eiwitinteractie-experimenten, maar het kan niet worden toegepast op de studie van regulerende DNA-sequenties zoals bindingsplaatsen van transcriptiefactoren omdat het protocol is ontwikkeld voor knock-in modificatie van de Rosa26-locus.

Dubbele fluorescerende verslaggevers hielpen CRISPR / Cas9 knock-in-bewerking
We hebben met succes een dubbel fluorescerend reportersysteem toegepast om onafhankelijke sets CRISPR / Cas9-vectoren in immuuncellen tijdelijk tot expressie te brengen, wat resulteerde in deletie van grote fragmenten van DNA in eerdere studies21. We hebben een CRISPR/Cas9-targetingtool ontworpen met behulp van het DsRed2 fluorescerende eiwit als reporter en een extra spectraal verschillend fluorescerend eiwit om de levering van de DNA-sjabloon voor knock-in modificatie te volgen. Om knock-in allelmodificatie mogelijk te maken, gebruikten we de EBFP2 fluorescerende eiwitreporter, die geen spectrale spillover heeft met de RFP (DsRed2 in ons geval), om transfectie van het donor-DNA te controleren dat als sjabloon dient tijdens homologe recombinatie. Om de cassette die de POI en fluorescerende reporter tot expressie geeft te optimaliseren, werd een IRES-sequentie geïntroduceerd om onafhankelijke eiwitten te verkrijgen. In onze vorige studie merkten we op dat de resterende aminozuren van de P2A- of T2A-linker die overbleven na post-transcriptionele splitsing de eiwitlokalisatie op het celoppervlak beïnvloedden. De IRES-sequentie laat dergelijke resterende aminozuren niet achter. Zoals beschreven in een eerdere studie, gaf de IRES aanleiding tot hogere niveaus van de fluorescerende reporter, na expressie van het Cas9-eiwit aangedreven door CAG-promotor38.

Alles-in-één CRISPR/Cas9 plasmide
Verschillende formaten en combinaties van het CRISPR/Cas9-systeem zijn beschreven in eerdere studies, zoals Cas9-transfectie als een mRNA of eiwit samen met chemisch gesynthetiseerde sgRNA's39. CRISPR/Cas9 RNP-complexen zijn ook afgeleverd in zoogdiercellen; deze strategie biedt de voordelen van een eerder begin van nuclease-activiteit en een kortere halfwaardetijd; het labelen van de RFP's is echter minder kosteneffectief in vergelijking met het bouwen van alles-in-één plasmide. In onze eerdere studies ontdekten we dat het gebruik van eencellige sortering om die zeldzame cellen te isoleren die CRISPR / Cas9 (DsRed2-positief) en het knock-in-eiwit (EBFP2-positief) tot expressie brengen, veel minder gecompliceerd is dan het gebruik van RNP-afgifte, en het is gemakkelijk om de plasmiden te bereiden. Het is waar dat dit protocol afhankelijk is van het sorteren van een enkele cel. Maar ons protocol is eenvoudig uit te voeren en levert succesvolle knock-in modificaties met een hoge reproduceerbaarheid op.

Expressie van een POI van de Rosa26 locus
Er zijn meerdere rapporten in de literatuur die methoden beschrijven voor het taggen van endogene eiwitten met fluorescerende verslaggevers met behulp van CRISPR / Cas9-bewerking40,41,42. De voordelen van endogene tagging zijn dat het mogelijk is om subcellulaire lokalisatie te bepalen en in vivo tracking van het endogene eiwit uit te voeren. Er kunnen echter problemen optreden als het niet mogelijk is om een geschikt CRIPSR-geleidings-RNA op de endogene locus te ontwerpen. Hier hebben we een alternatieve knock-in methode ontwikkeld door POI-IRES-EBFP2 op te nemen in de genomische veiligehaven locus Rosa26, die de beperkingen van het vinden van geschikte gidsen voor het positioneren van endogene tags overwint.

We vatten een paar belangrijke punten samen die tijdens de experimenten moeten worden overwogen om de technische reproduceerbaarheid te waarborgen. Ten eerste moet de celsorteerder een 405 nm violette laser hebben voor excitatie van EBFP2 en een 488 nm blauwe laser of als alternatief een 561 nm gele laser voor excitatie van DsRed2. Met dergelijke configuraties kunnen EBFP2 en DsRed2 worden gedetecteerd zonder spectrale spillover, wat kan leiden tot vals-positieve resultaten. In onze experimenten was het aandeel DsRed2+ EBFP2+ dubbel positieve cellen zo laag als 0,9%; daarom was het insm van de juiste populatie essentieel voor het succes van de experimenten. Een tweede sorteerronde werd uitgevoerd om de EBFP2+ positieve cellen te gaten, gevolgd door PCR-validatie. Bovendien heeft het voor knock-in eiwitdetectie de voorkeur om een eiwittag zoals OST of een ander type tag te introduceren. Knock-out van het gen voorafgaand aan Rosa26 locus knock-in experimenten biedt een goede gelegenheid om te beoordelen of het antilichaam de gewenste specificiteit heeft. Wanneer de antilichaamspecificiteit niet voldoende is, moet detectie van het knock-in-eiwit worden uitgevoerd na pulldown via het eiwitlabel. Ten slotte kan tijdens FACS-screening van de cellen die het knock-in-allel tot expressie brengen, de intensiteit van EBFP2 worden gebruikt om te beoordelen of er twee kopieën of één kopie van het knock-in-allel aanwezig is.

Toepassingen
In dit protocol beschreven we de knock-in modificatie van RASGRP1, een sleutelmolecuul dat betrokken is bij T-celactivering27. We verkregen eerst RASGRP1-knock-out Jurkat-cellen die kunnen worden gebruikt voor functieverliesstudies, en we genereerden extra Jurkat-cellen die OST-RASGRP1 tot expressie brengen op de hROSA26-locus. Jurkat cellen zijn de meest gebruikte menselijke cellijn voor het bestuderen van T-celbiologie43. Vanwege het succes van immunotherapie bij het voorkomen van T-celuitputting bij kankerpatiënten, hebben immunologen en kankerbiologen grote interesse in het modificeren van Jurkat-cellen voor functionele studies van kandidaat-moleculen. Het is ook opmerkelijk dat de Jurkat T-cellijn vaak wordt gebruikt voor dissectie van signaalroutes, maar er zijn beperkingen aan het gebruik van deze cellijn, omdat Jurkat-cellen slechte producenten zijn van IFN-γ bijstimulatie 44. Eerdere studies gebruikten zowel endogene locusmodificatie45 als genetische manipulatie op de hROSA26 locus46 om knock-in experimenten uit te voeren in menselijke Jurkat-cellen. Beide strategieën hebben hun eigen voordelen; door het modificeren van de endogene locus wordt het eiwit vermoedelijk tot expressie gebracht op een "fysiologisch" niveau. Knock-in modificatie op de hROSA26-locus levert voorspelbare resultaten op omdat alternatieve splicing van mRNA wordt vermeden en de overvloed van het gemodificeerde eiwit ook gemakkelijk detecteerbaar is. Andere genomische veilige havens, zoals de adeno-geassocieerde virussite 1 (AAVS1) en chemokine (CC-motief) receptor 5 (CCR5)47,48 verdienen meer onderzoek.

In onze vorige studie, toen Vav1-OST op hogere niveaus werd uitgedrukt bij de rosa26-sprinkhaan van de muis in RAW264.7-cellen, die zeer vaak worden gebruikt macrofaagcellen, waren we in staat om de interactie met laag tot expressie gebrachte Vav3-moleculen te detecteren vanwege de hoge niveaus van aaseiwit en hoge efficiëntie van OST-affiniteitszuivering13. We beschreven ook knock-in experimenten om een macrofaagcellijn vast te stellen die stabiel hACE2 tot expressie brengen, een receptor voor SARS-CoV-2, waarin overvloedige expressie is gegarandeerd. In de single cell RNA sequencing database wordt murine Ace2 uitgedrukt in long macrofagen, en het genetisch cellulaire model dat hACE2 tot expressie we heeft ontwikkeld, zou nuttig kunnen zijn voor studies van macrofagen tijdens SARS-CoV-2-infectie.

Andere overwegingen
Dit protocol is ontworpen om knock-in cellen te identificeren die een POI uitdrukken met behulp van flowcytometrische analyses van een fluorescerende reporter, in ons geval de EBFP2-reporter. Wanneer echter oppervlakte-etiketteringsantistoffen die door FACS kunnen worden gedetecteerd, beschikbaar zijn voor een oppervlakte-eiwit49,is het niet nodig om het reportersysteem50te gebruiken. De T-cel- en macrofaagcellijnen, evenals de voorbeelden van OST-gelabelde eiwitten die worden gebruikt voor interactoomstudies, worden voornamelijk gebruikt voor signaleringsstudies en de meerderheid van deze signaalmoleculen zijn gelokaliseerd in het cytosol of de kernen van cellen. Er kan dus een fluorescerende reporter nodig zijn voor de identificatie van wenselijke knock-in cellen.

Het is belangrijk om erop te wijzen dat dit protocol is ontwikkeld voor cellijnen en dat de toepassing op primaire immuuncellen zoals T-cellen, monocyten / macrofagen niet is gevalideerd. Vanwege de beperkte capaciteit van de cellen om zich te vermenigvuldigen, raden we dit protocol niet aan voor gebruik met primaire immuuncellen. Omdat de fluorescerende reporter EBFP2 tot expressie kwam onder dezelfde promotor als het knock-in gen of POI met behulp van een IRES-element, hebben we geen cellen waargenomen die de fluorescerende reporter tot expressie brengen in afwezigheid van het knock-in gen. We vermoeden dat het herstel van de fluorescerende eiwit-tot expressie brengende cellen sterk afhankelijk is van het succes van homologe recombinatie. Zoals gemeld in een eerdere studie, is het vervelend om de juiste knock-in cellen te sorteren, uit te breiden en te identificeren door eencellige sortering wanneer de knock-in-efficiëntie erg laag is42, wat ook verklaart waarom we de cellen in bulk moesten sorteren om het slagingspercentage te verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken de flowcytometrie kernfaciliteit van Xinxiang Medical University. De ontwikkeling van dergelijke technologie is ondersteund door NSFC-subsidies 81601360 aan LZ, 81471595 en 32070898 aan YL. Het werk wordt ook ondersteund door de Foundation of Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Immunologie en infectie knock-in CRISPR/Cas9 Rosa26 macrofaag T-cel hACE2
Gene Knock-in door CRISPR/Cas9 en celsortering in macrofaag- en T-cellijnen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter