Summary
Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.
Abstract
Funktionelle Genomik-Studien des Immunsystems erfordern genetische Manipulationen, die sowohl die Deletion von Zielgenen als auch die Zugabe von Elementen zu interessierenden Proteinen beinhalten. Die Identifizierung von Genfunktionen in Zelllinienmodellen ist wichtig für die Genentdeckung und Erforschung zellintrinsischer Mechanismen. Genetische Manipulationen von Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagenzelllinien mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Knock-in sind jedoch aufgrund der geringen Transfektionseffizienz dieser Zellen, insbesondere in einem Ruhezustand, schwierig. Um Gene in Immunzellen zu modifizieren, werden typischerweise Arzneimittelresistenzselektion und virale Vektoren verwendet, um Zellen anzureichern, die das CRIPSR / Cas9-System exprimieren, was unweigerlich zu unerwünschten Eingriffen der Zellen führt. In einer früheren Studie haben wir duale fluoreszierende Reporter entwickelt, die mit CRISPR/Cas9 gekoppelt sind und nach der Elektroporation vorübergehend exprimiert wurden. Diese technische Lösung führt zu einer schnellen Genselöschung in Immunzellen; Das Einklopfen von Genen in Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagen ohne den Einsatz von Arzneimittelresistenzselektion oder viralen Vektoren ist jedoch noch schwieriger. In diesem Artikel zeigen wir, dass durch die Verwendung von Zellsortierung zur Unterstützung der Selektion von Zellen, die transient CRISPR/Cas9-Konstrukte exprimieren, die auf den Rosa26-Locus in Kombination mit einem Spenderplasmid abzielen, ein Gen-Knock-in sowohl in T-Zellen als auch in Makrophagen ohne Arzneimittelresistenzanreicherung erreicht werden kann. Als Beispiel zeigen wir, wie man menschliches ACE2, einen Rezeptor von SARS-Cov-2, der für die aktuelle Covid-19-Pandemie verantwortlich ist, in RAW264.7-Makrophagen durch Knock-in-Experimente exprimiert. Solche Gen-Knock-in-Zellen können häufig für mechanistische Studien verwendet werden.
Introduction
Immunzellen sind entscheidend für die Abwehr von Krankheitserregern. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunität sind für die Clearance von Infektiva und die Aufrechterhaltung der Gewebeöostase erforderlich1,2. Zelllinienmodelle sind wesentliche Werkzeuge, um die molekularen Grundlagen des Immunsystems von Säugetieren zu verstehen. Sie werden in funktionellen In-vitro-Assays verwendet, z. B. bei der Modellierung der Aktivierung menschlicher T-Zellen und bei der Bestimmung der Funktion genetischer Faktoren bei der Aktivierung oder Dämpfung von Immunantworten3,4. Es ist wichtig zu beachten, dass das Immunsystem von Säugetieren enorm heterogen ist und, ebenso wichtig, eine große Anzahl von Molekülen die Differenzierung, Migration und Funktion eines bestimmten Zelltyps5,6steuert.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Genome Editing Tools ermöglichen die genetische Manipulation bestimmter Zelltypen, was die funktionelle Annotation von Genen auf präzise Weise erleichtert7,8. Mehrere veröffentlichte Protokolle haben die Abgabe von CRISPR/Cas9 in Form von Cas9-Guide-RNA-Komplexen beschrieben, die als Ribonukleoproteine (RNPs) in HEK293-Zellen, Jurkat-Zelllinien, primären T-Zellen9,10, Makrophagen11,12,13, Stammzellen14und anderen15,16bekannt sind . In diesen Protokollen wird das Gen-Tagging normalerweise durch Verschmelzen eines fluoreszierenden Tags mit endogenen Proteinenerreicht 17,18. Es wurden jedoch nur wenige Versuche unternommen, duale fluoreszierende Reporter zu verwenden, die mit der Einzelzellsortierung kompatibel sind, um Knock-in-Experimente19,20, insbesondere in Immunzellen , zu erleichtern.
Eingehende mechanistische Analysen, die darauf abzielen, die Funktionen eines neuartigen genetischen Faktors in Immunzellen zu verstehen, erfordern in der Regel eine zelltypspezifische Deletion eines Gens, genetische Rettungsexperimente und idealerweise die Identifizierung seiner Interaktoren. Obwohl Methoden zur Optimierung der genetischen Deletion von Genen in Immunzellen veröffentlicht wurden9,15,21, wurden weit weniger Methoden zur Einführung von Knock-in-Allelen mit vielseitigen Funktionen zum Verständnis der Immunantwort berichtet. Daher wollen wir in diesem Protokoll ein effizientes und hochreproduzierbares Protokoll beschreiben, um ein Protein von Interesse (POI) am Safe-Harbor-Locus Rosa26 sowohl in menschlichen als auch in murinen Immunzelllinien zu exprimieren. Wir haben ein zweifarbiges Reportersystem entwickelt, um Zellen anzureichern, die mit Plasmiden transfiziert sind, die CRISPR/Cas9 (DsRed2) exprimieren, und eine rekombinante DNA-Vorlage (EBFP2), die durch Zellsortierung isoliert werden kann. Nach diesem Protokoll erhielten wir mehrere Knock-in-Linien der menschlichen T-Zelllinie Jurkat und des murinen Makrophagen RAW264.7 für funktionelle Analysen von schlecht untersuchten Proteinen.
Als Beispiel zeigen wir in diesem Protokoll, wie man Knock-in RAW264.7 Makrophagen erhält, die stabil menschliches ACE2 (ein Rezeptor von SARS-Cov-2)22exprimieren. Da angeborene Immunzellen an der Pathogenese von Covid-1923beteiligt sind,24 und humanes ACE2 als hauptrezeptor gilt, der für den viralen Eintritt in Zellen vor der Replikation benötigt wird, können Makrophagen mit Knock-in von humanem ACE2 als nützliches Werkzeug für mechanistische Studien der viralen Vermehrung in Makrophagen dienen. Parallel dazu präsentieren wir auch ein Beispiel für das Einschalten eines Gens am menschlichen ROSA26-Locus, um das RASGRP1-Protein zu exprimiert, das an seinem Aminoterminus mit einem Affinitäts-Twin-Strep-Tag (OST) verschmolzen wurde. T-Zellen sind wichtige Zielzellen in Immuntherapien, und eine zunehmende Anzahl von Studien hat sich auf die Manipulation ihrer Reaktionsfähigkeit auf Krebs konzentriert25,26. Da Rasgrp1 als schlüsselhaftes Signalmolekül nach dem T-Zell-Rezeptor bekannt ist und seine Interaktoren nicht gut aufgeklärt sind27, bietet das OST-RASGRP1-Knock-in-Modell die Grundlage für die Identifizierung von Interaktoren, die die Reaktion von T-Zellen auf Tumore und Infektionen regulieren. Zusammengenommen können diese Werkzeuge für Covid-19-Studien und die Entdeckung neuartiger Moleküle verwendet werden, die mit Rasgrp1 interagieren.
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Protocol
1. Design und Plasmidkonstruktion von sgRNAs für Rosa26 Locus
- Designleitfaden-RNAs rund um die gewünschte Einfügestelle
- Stellen Sie sicher, dass sich die Einfügestelle für Rosa26-Knock-in-Experimente der Maus Rosa26 (im Folgenden als mRosa26bezeichnet) im ersten Intron von mRosa26befindet. Diese Seite wurde in früheren Studien verwendet28,29. Stellen Sie bei Knock-in-Experimenten in menschlichen Zellen sicher, dass sich die Insertionsstelle im menschlichen ROSA26-Locus (im Folgenden hROSA26genannt) befindet, der als menschlicher Homolog von mRosa2630identifiziert wurde.
- Verwenden Sie die genomischen Sequenzen von Maus- und menschlichen Spezies, die aus der Mausgenominformatik (http://www.informatics.jax.org/) bzw. dem Ensembl-Genombrowser (http://www.ensembl.org/index.html) gewonnen wurden. Kopieren Sie 50 Basenpaare (bp) der genomischen Sequenz des mRosa26- oder hROSA26-Locus auf jeder Seite, die die gewünschte Insertionsstelle flankiert.
- Design Guide RNAs mit dem Online-Webtool CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Fügen Sie die 100 bp Der Eingabesequenz aus 1.1.2 ein. Wählen Sie zwei Leit-RNAs mit einem hohen Spezifitätswert, einem hohen Effizienzwert und einer niedrigen Off-Target-Aktivität aus. Wählen Sie außerdem RNA-Guides mit höheren Doench-Werten und vermeiden Sie diejenigen, die als "ineffizient" gekennzeichnet sind32.
HINWEIS: Alternative CRISPR-Design-Tools sind ebenfalls wertvoll und öffentlich verfügbar, zum Beispiel das Benchling CRISPR-Design-Tool (https://benchling.com/crispr). Um die Häufigkeit von CRISPR/Cas9-vermittelten Knock-in-mutierten Zellen zu erhöhen, wählen Sie nach Möglichkeit zwei Führungs-RNAs in der Nähe der gewünschten Einfügestelleaus 33. - Verwenden Sie für den mRosa26-Locus zwei benachbarte Führungs-RNAs, die als mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') und mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') bezeichnet werden(Abbildung 1A). Verwenden Sie für den hROSA26-Locus zwei benachbarte Führungs-RNAs, nämlich hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') und hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Abbildung 1B).
HINWEIS: Genom-Editing-Aktivitäten von mR26-sg1 und mR26-sg2 sowie die von hR26-sg1 und hR26-sg2 wurden in RAW264.7-Zellen bzw. Jurkat-Zellen ausgewertet (siehe Ergänzungsdatei, Abbildung S1).
- Klonen von CRISPR-Expressionsvektoren, die sgRNA enthalten, die auf den Rosa26 Locus abzielen
- Synthetisieren Sie Vorwärts- und Rückwärtsoligos für eine Leit-RNA (siehe Ergänzungsdatei).
HINWEIS: Es ist vorzuziehen, am Anfang der Führungssequenz ein "G"-Nukleotid hinzuzufügen, das bei der vom U6-Promotor gesteuerten Expression hilft. Um beispielsweise das oben genannte mR26-sg1 zu klonen, ist das vordere Oligo CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT und das umgekehrte Oligo ist AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Das zusätzliche G im vorderen Oligo und sein Komplement im umgekehrten Oligo sind fett gedruckt. - Klonen Sie synthetische Oligos, die den Leit-RNAs entsprechen, in den All-in-One-CRISPR-Expressionsvektor pX458-DsRed2, der in unserer vorherigen Arbeit21 (Abbildung 1C) unter Verwendung des von Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/) entwickelten allgemeinen Protokolls für das gRNA-Klonen generiert wurde; Überspringen Sie jedoch den Gelreinigungsschritt und reinigen Sie den verdauten Vektor mit einem PCR-Reinigungskit (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: In früheren Protokollen wurde eine Gelreinigung des BbsI-verdauten Vektors durchgeführt; Dieser Schritt ist jedoch zeitaufwändig. Im vorliegenden Protokoll wird das verdaute Produkt mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt und direkt für die nachgeschaltete Ligationsreaktion verwendet, die in der Regel positive Kolonien mit vergleichbarer Effizienz erzeugt. - 10 μL des Ligationsprodukts (Schritt 1.2.2) werden gemäß den Anweisungen des Herstellers in 50 μLescherichia coli DH5α kompetente Zellen umgewandelt. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Kolonien aus einer LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg / ml) und impfen Sie jede in 3 ml LB-Medium mit Ampicillin, um sie über Nacht zu kultivieren.
- Verwenden Sie 1 ml der Bakterienkultur über Nacht für die Sanger-Sequenzierung und halten Sie den Rest bei 4 °C, bis das Konstrukt als korrekt bestätigt ist: pDsR-mR26-sg1 und pDsR-mR26-sg2 für mRosa26 Locus Knock-in und pDsR-hR26-sg1 und pDsR-hR26-sg2 für den hROSA26-Locus.
- Eine hohe Konzentration an Plasmid-DNA (ca. 2 μg/μL) wird mit einem Maxiprep-Kit zur Reinigung von Transfektionsplasmid (siehe Materialtabelle) vorbereitet.
- Synthetisieren Sie Vorwärts- und Rückwärtsoligos für eine Leit-RNA (siehe Ergänzungsdatei).
2. Design und Konstruktion von Targeting-Vektoren als homologe Rekombinationsvorlagen
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Entwerfen einer homologiegesteuerten Reparaturvorlage
- Entwerfen Sie einen Targeting-Vektor, um den POI konstitutiv zu exprimieren, indem Sie eine Expressionskassette verwenden, die aus einer früheren Studie29optimiert wurde und einen CAG-Hybridpromotor, eine AscI-Restriktionsstelle, die das Klonen der cDNA des POI ermöglicht, einen IRES-EBFP2-Reporter und ein Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal (bGH-polyA) enthält (Abbildung 1B und Ergänzende Datei).
- Entwerfen Sie Homologiearme (HAs), die die Homologie mit den genomischen Sequenzen des mRosa26- oder hROSA26-Locus teilen. Fügen Sie ~1 kb der 5' HA ein, die der vorgelagerten genomischen Sequenz von der gewünschten Einfügestelle links von der Expressionskassette entsprechen. In ähnlicher Weise schließen Sie ~ 1 kb des 3' HA ein, das der nachgeschalteten genomischen Sequenz von der Einfügestelle rechts neben der Expressionskassette entspricht.
HINWEIS: Die Expressionskassette wird so nah wie möglich an den CRISPR/Cas9-Spaltstellen34eingelegt. Um ein erneutes Schneiden des Zielallels durch CRISPR/Cas9 zu vermeiden, integrieren Sie Nukleotidänderungen in die Protospacer-Adjacent Motif (PAM)-Sequenz (5'-NGG-3') im Zielvektor34,35. - Um eine Linearisierung des Zielvektors zu ermöglichen, fügen Sie eine eindeutige EcoRI-Site direkt vor der 5'-HA und eine eindeutige BamHI-Site direkt hinter der 3'-HA ein.
- Lassen Sie einen kommerziellen Anbieter die Targeting-Vektoren synthetisieren und sie als pKR26-iBFP bzw. pKhR26-iBFP für mRosa26 bzw. hROSA26 Knock-in bezeichnen.
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Erstellen eines Zielvektors als homologiegesteuerte Reparaturvorlage
- Um den POI zu exprimieren, erhalten Sie die cDNA-Sequenz (kodierende Sequenz) aus dem Ensembl-Genombrowser und wählen Sie das Transkript mit der längsten Proteinsequenz aus. Zum Beispiel ist die cDNA des menschlichen ACE2-Gens ACE2-202 ENST00000427411.2 und die cDNA des menschlichen RASGRP1-Gens ist RASGRP1 ENSG00000172575.
- Synthetisieren Sie die cDNA des POI mit Hilfe eines kommerziellen Anbieters. Es ist auch möglich, die cDNA über PCR-Amplifikation zu klonen (hier nicht beschrieben). Platzieren Sie die Sequenz GGCGCGCCACC (5' - 3'), die eine AscI-Restriktionsstelle (kursiv und fett) und eine Kozak-Konsensübersetzungsinitiierungs-Initiationsseite (unterstrichen) enthält, unmittelbar vor dem ATG-Initiationskodon der cDNA und einer weiteren AscI-Restriktionsstelle (5'- GGCGCGCC -3') nach dem Stop-Codon der cDNA.
- Verdauen Sie die synthetisierte Sequenz mit AscI und reinigen Sie sie mit einem PCR-Reinigungskit, das für die Reinigung von DNA-Fragmenten nach Restaumentaufschluss gemäß den Anweisungen des Herstellers entwickelt wurde (siehe Materialtabelle).
- Ligaieren Sie den gereinigten cDNA-Einsatz in den AscI-linearisierten Backbone-Vektor pKR26-iBFP oder pKhR26-iBFP mit T4-DNA-Ligase gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Überprüfen Sie den endgültigen Zielvektor pKR26-POI-iBFP oder pKhR26-POI-iBFP durch Sequenzierung. Verwenden Sie maxiprep, um die verifizierten Konstrukte gemäß dem Protokoll des Herstellers zu reinigen.
- Verdauen Sie den Zielvektor entweder mit EcoRI oder BamHI und reinigen Sie das Aufschlussprodukt mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lagern Sie den linearisierten Zielvektor (~0,8 μg/μL) bei -20 °C bis zur Elektroporation.
3. Elektroporation von Makrophagen und T-Zelllinien
- Zellkulturen für die Elektroporation vorbereiten
- Bereiten Sie das Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) als vollständiges Wachstumsmedium für Jurkat T-Zellen vor. Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% FBS für die Kultivierung von RAW264.7-Makrophagen vor. Ergänzen Sie alle vollständigen Wachstumsmedien mit 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin (Pen / Streptokokken), mit Ausnahme von Medien, die für die Inkubation nach der Transfektion vor der Zellsortierung verwendet werden.
- Führen Sie subkulturierte RAW264.7- und Jurkat T-Zellen gemäß den Anweisungen des Lieferanten durch (siehe Materialtabelle). Wenn Sie RAW264,7-Zellen subkulturieren, verwenden Sie Trypsin-EDTA-Lösung (0,25%), um Zellen zu lösen. Verwenden Sie FBS ergänzt mit 10% (v/v) DMSO als Kryokonservierungsmedium für RAW264.7- und Jurkat-Zellen.
- Sammeln Sie Zellen bei 250 × g für 5 min für RAW264.7 Makrophagen und 90 × g für 8 min für Jurkat T-Zellen. Dann mit 5-10 ml 1× DPBS (ohne Ca2+ oder Mg2+ Ionen) waschen. Entfernen Sie die DPBS.
- Das Zellpellet wird mit 2 ml 1× DPBS wieder resuspendiert. Verwenden Sie 10 μL Zellen und mischen Sie mit einem gleichen Volumen von 0,2% Trypanblau, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu schätzen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellkultur am Tag der Transfektion >90% Lebensfähigkeit aufweist. - Führen Sie für ein einzelnes Knock-in-Experiment eine Elektroporation mit 10 μL Nukleofektionsspitzen mit fünf Wiederholungen durch. Berechnen Sie das benötigte Volumen für 2,0 × 106 Zellen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Zellpellet erneut mit 1× DPBS wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.
HINWEIS: Bei Verwendung von 10 μL Nukleofektionsspitzen werden 4,0 ×10 5 Zellen pro Elektroporation benötigt. Bereiten Sie dementsprechend mindestens 2,0 × 106 Zellen für ein Knock-in-Experiment vor. - Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 0,5 ml vollständigem Wachstumsmedium (vorbereitet in Schritt 3.1.1) pro Vertiefung ohne Pen/Strep vor und wärmen Sie sie in einem 37 °C-Inkubator vor.
- Elektroporation von CRISPR/Cas9-Komponenten und des Zielvektors
- Schalten Sie das Elektroporationssystem ein. Verwenden Sie Elektroporationsparameter, die in einer früheren Studie21optimiert wurden: 1.400 V/20 ms/2 Impulse für RAW264.7-Makrophagen und 1350 V/20 ms/2-Impulse für Jurkat-T-Zellen.
- Unter Berücksichtigung des Probenverlusts durch Pipettieren ist eine 55 μL Elektroporationsmischung in einem sterilen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 2,5 μg jedes CRISPR/Cas9-Vektors, 2,4 μg des linearisierten Zielvektors und dem Resuspensionspuffer R.
HINWEIS: Um Zeit zu sparen, kann das Elektroporationsgemisch während der Zentrifugation hergestellt werden (Schritt 3.1.5). - 2.0 × 106 Zellen (hergestellt in Schritt 3.1.5) in der 55 μL Elektroporationsmischung aus Schritt 3.2.2 wiedergeben.
- Das Zell-Elektroporations-Gemisch aus Schritt 3.2.3 mit einer 10 μL-Nukleofektionsspitze mit einer Pipette absaugen.
HINWEIS: Vermeiden Sie während des Pipettierens das Einbringen von Luftblasen, die zu einem Elektroporationsfehler führen können. - Die Probe wird in ein Röhrchen gegeben, das mit 3 ml Buffer E aus dem Elektroporationskit gefüllt ist.
- Wenden Sie die Elektroporationsparameter für die beiden Zelltypen wie in Schritt 3.2.1 beschrieben an.
- Die Probe wird in eine Vertiefung der 24-Well-Platte mit vorgewarmtem Medium aus Schritt 3.1.6 überführen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4-3.2.7 für die anderen vier Wiederholungen sowie für die Steuerelemente nur für den Zielvektor und den CRISPR-Ausdrucksvektor.
HINWEIS: Ändern Sie die Nukleofektionsspitze und den Röhrchen, wenn Sie zu einem anderen Zelltyp / Plasmid-DNA wechseln. - Die transfizierten Zellen werden 48-72 h lang kultiviert, um die Rückgewinnung nach Elektroporation und Expression von CRISPR/Cas9-Komponenten vor der Durchflusszytometrie-Analyse oder fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) zu ermöglichen. Untersuchen Sie die Expression von DsRed2 mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem roten Kanal bei 24 h nach der Transfektion ausgestattet ist.
HINWEIS: Ein Vorteil der Überwachung von DsRed2-Fluoreszenzzellen besteht darin, dass die Effizienz der Elektroporation abschätzen und die Eignung für eine weitere Zellsortierung vorhergesagt werden kann.
4. Zellsortierung zur Isolierung mutmaßlicher Knock-in-Zellen
- Vor der FACS-Sortierung die transfizierten Zellen einmal mit vollständigem Wachstumsmedium waschen. Pelletzellen durch Zentrifugation wie in Schritt 3.1.3 beschrieben und das Pellet in 500 μL frischem Medium resuspendieren.
- Stellen Sie den Zellsortierer (in einer Biosicherheitswerkbank) mit einer 85-μm-Düse und einer niedrigen Durchflussrate ein. Wählen Sie den "Einzelzellen"-Modus für die Sortierung und testen Sie die Effizienz und Präzision der Einzelzellsortierung, indem Sie 20-30 Zellen auf die Abdeckung der 96-Well-Mikroplatte sortieren. Ein Tröpfchen, das in der Mitte jeder Vertiefung lokalisiert ist, zeigt die richtige Einrichtung des Instruments an.
- Die Zellsuspension aus Schritt 4.1 wird in sterile FACS-Röhrchen übergehen und SYTOX Red Dead Cell Stain zu einer Endkonzentration von 1 nM hinzugefügt.
- Analysieren Sie Proben auf dem Zellsortierer. SYTOX Red und EBFP2 werden von einem 405-nm-Laser angeregt und von den V450/BV421- bzw. APC-Kanälen detektiert. DsRed2 wird von einem 488-nm-Laser angeregt und vom PE-Kanal detektiert. Verwenden Sie nicht transfizierte Zellen und EBFP2- und DsRed2-Single-Positive-Zellen als Kontrollen für die spektrale Kompensation.
- Sortieren Sie 10 einzelne Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte, die 150 μL pro Vertiefung des vorgewärmten vollständigen Wachstumsmediums enthält. Verwenden Sie runde Bodenmikroplatten für die Kultivierung von Suspensionszelllinien wie Jurkat T-Zellen und flachen Bodenmikroplatten für adhärente RAW264.7-Makrophagen.
HINWEIS: Die Sortierung von 10 Zellen pro Vertiefung ist eine optimierte Strategie zur Verbesserung des Zellüberlebens und zur Minimierung der Anzahl der 96-Well-Mikroplatten, die ausgesät werden müssen, und der Anzahl der Proben, die durch Durchflusszytometrie und Genotypisierung gescreent werden müssen. Wenn nur eine Zelle pro Vertiefung sortiert wird, ist die Aussaat von mehr Mikroplatten erforderlich, um die Chance zu erhöhen, korrekt bearbeitete Zellen zu erhalten.
5. Screening und Validierung positiver Knock-in-Zellen
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Screening auf Kandidaten-Knock-in-Zellen mittels Durchflusszytometrie
- Inkubieren Sie die Zellen ab Schritt 4.5 für 10-15 Tage und fügen Sie alle 3 Tage vollständiges Wachstumsmedium hinzu, um die durch Verdampfung verlorene Flüssigkeit zu ersetzen. Übertragen Sie bei Jurkat-T-Zellen Zellen, die in der runden unteren 96-Well-Platte gezüchtet wurden, auf eine flache Bodenplatte, um die Zellproliferation zu optimieren.
- Übertragen Sie die expandierten sortierten Zellen zur weiteren Expansion auf 48-Well-Platten.
- Wenn sich Zellen in der Nähe des Zusammenflusses befinden, verwenden Sie die Hälfte der Kultur, um die EBFP2-Expression durch Durchflusszytometrie zu untersuchen (Abbildung 3). Normalerweise entspricht die Hälfte der Kultur in einer 48-Well-Platte nach konfluentem Wachstum 0,5-1,0 × 105 Zellen, was für die Analyse einer Probe durch Durchflusszytometrie ausreichend ist.
- Die verbleibenden Zellen werden zur weiteren Proliferation auf 24-Well-Platten übertragen.
- Halten Sie die Kandidatenzellpopulationen mit einem hohen Anteil an EBFP2-positiven Zellen für weitere Genotypisierungsexperimente.
HINWEIS: Da 10 Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Mikroplatte sortiert sind, ist es möglich, dass die Knock-in-Zellen mit Zellen wachsen, die das Knock-in-Gen nicht exprimieren. Daher ist es normal, eine zusätzliche Zellsortierung durchzuführen, um die EBFP2-positiven Zellen von den negativen Zellen zu trennen.
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Screening auf Kandidaten-Knock-in-Zellen mittels PCR und Sequenzierung
- Sammeln Sie 2 × 105 Kandidatenzellen. Extrahieren Sie die genomische DNA mit einem DNA-Prep-Kit (siehe Materialtabelle).
- Um zu überprüfen, ob eine präzise homologiegerichtete Reparatur (HDR) am mRosa26-Locus und nicht an zufälligen Stellen im Genom der Kandidaten-Knock-in-Zellen stattgefunden hat, führen Sie eine PCR mit Primern durch, die sich über jede Seite der HAs erstrecken (Abbildung 4). Wählen Sie einen Primer, der sich im genomischen Bereich außerhalb des Targeting-Vektors befindet (externes Oligo) und einen anderen Primer innerhalb des Targeting-Vektors (internes Oligo).
HINWEIS: Ein ähnliches Design wird verwendet, um HDR am hROSA26-Locus zu überprüfen. PCR-Primer können auch einfach für die Erkennung des Einfügens der POI-Sequenz entwickelt werden. Zusätzlich können die Wildtyp- und Knock-in-Allel-Genotypen gleichzeitig mittels Drei-Primer-PCR detektiert werden (siehe Ergänzungsdatei, Abbildung S2). - Klonen Sie die positiven PCR-Produkte mit einem Schnellklonierungskit (siehe Materialtabelle). Wandeln Sie das Reaktionsgemisch in DH5α-kompetente Zellen um.
- Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 8-10 einzelne Bakterienkolonien pro Transformation aus und sequenzieren Sie die PCR-Produkte aus Schritt 5.2.3 durch Sanger-Sequenzierung.
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Validierung positiver Knock-in-Zellen durch Immunoblot-Analyse und Affinitätsreinigung
HINWEIS: Kandidatenzellen werden einer Immunoblot-Analyse zur Validierung der Insertion des POI oder der Affinitätsreinigung (AP) für Studien der Protein-Protein-Interaktion unterzogen.- Führen Sie eine Immunoblot-Analyse gemäß den Anweisungen des Antikörperherstellers durch. Informationen zur Verwendung von primären Antikörpern und sekundären Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle.
- Die Lysate der Knock-in-Zellen, die den OST-markierten POI exprimieren, werden mit Strep-Tactin Sepharose-Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers an AP unterstellt(siehe Materialtabelle ).
- Erkennen Sie Chemilumineszenz mit einem Imager.
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Representative Results
Nach dem oben beschriebenen Protokoll zur Durchführung von Knock-in-Experimenten am mRosa26-Locus mit murinen RAW264.7-Makrophagen haben wir einen Zielvektor entwickelt, um menschliches ACE2, einen Rezeptor für das SARS-Cov-2-Virus, zu exprimiert (Abbildung 2A). Mit einem ähnlichen Design erzeugten wir menschliche Jurkat-T-Zellen mit Knock-In des OST-markierten RASGRP1-Fusionsproteins (Abbildung 2C). Nach der Transfektion von drei Plasmiden, von denen zwei für die Expression von CRISPR/Cas9 verwendet wurden (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 und pDsR-mR26-sg2 für mRosa26-Knock-in; pDsR-hR26-sg1 und pDsR-hR26-sg2 für das hROSA26-Knock-in) und ein anderes als DNA-Vorlage für homologe Rekombination (EBFP2) verwendet wurden, wurden doppelt positive Zellen, die zwei fluoreszierende Reporter exprimierten, in eine 96-Well-Platte sortiert. Von den RAW264.7-Zellen, die im Einzelzellsortiermodus sortiert wurden, waren 0,91% DsRed2+ EBFP2+,aber 10 Zellen wurden in jeder Vertiefung gesammelt (Abbildung 2B). Die Jurkat-T-Zellen hatten eine höhere Transfektionseffizienz, und der Prozentsatz der doppelt positiven Zellen betrug 7,91% in diesem repräsentativen Experiment, was ein erfolgreiches Einklopfen des OST-RASGRP1-Fusionsproteins zeigte (Abbildung 2D).
Im nächsten Schritt wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um die Kandidatenbohrungen mit EBFP2-positiven Zellen zu screenen. Repräsentative Histogramme zeigten, dass es offensichtliche EBFP2-positive Populationen gab (Abbildung 3). Es ist bemerkenswert, dass die Knock-in-Zellen DsRed2 nicht exprimierten, als die Durchflusszytometrie zwei Wochen nach der Zellsortierung durchgeführt wurde.
Zur Unterscheidung präziser Knock-Ins und zufälliger Insertionen wurde die genomische DNA aus den EBFP2-positiven Zellen weiter getestet, indem eine PCR mit Primern durchgeführt wurde, die genomische Sequenz außerhalb der HAs des Zielvektors und der spezifischen Region innerhalb der Expressionskassette erkannten (Abbildung 4A und 4B). Die Sequenzanalyse dieser PCR-Produkte bestätigte das Auftreten von HDR an der mRosa26-Zielstelle (Abbildung 4C). Die gleiche Genotypisierungsstrategie kann angewendet werden, um das präzise Einsetzen der Expressionskassette inden hROSA26-Locus von Jurkat-T-Zellen zu validieren.
Um eine reine Population von hACE2-exprimierenden RAW264.7-Zellen zu erhalten, haben wir die Zellen weiter sortiert und das Vorhandensein der fluoreszierenden Reporter nach der Expansion mit Wildtypzellen als Kontrollen validiert (Abbildung 5A). Die expandierten Zellen waren EBFP2-positiv, und das hACE2-Protein war in murinen RAW264.7-Makrophagen leicht nachweisbar (Abbildung 5B und 5C). In ähnlicher Weise validierten wir die Expression von fluoreszierenden Reportern und des OST-RASGRP1-Proteins in menschlichen Jurkat-T-Zellen nach dem Screening und einer zweiten Runde der Zellsortierung (Abbildung 6A und 6B). Darüber hinaus wurde die Affinitätsreinigung des OST-RASGRP1-Proteins mit kommerziell erhältlichen Perlen durchgeführt. Wir fanden eine höhere Menge an RASGRP1-Protein in den Gesamtzelllysaten von Knock-in-Jurkat-Zellen als in denen von Wildtyp-Zellen; Als Kontrollen wurden RASGRP1 Knockout-Jurkat-Zellen verwendet (Abbildung 6C). Nach der Reinigung mit dem OST-Tag hatten nur die Einschlagsproben nachweisbares RASGRP1 (Abbildung 6D).
Abbildung 1. Gen-Targeting-Strategie zur Erzeugung von mRosa26/ hROSA26-Knock-in-Zelllinien, die ein Protein von Interesse überexprimieren. (A) mRosa26-spezifischeLeit-RNA-Targeting-Sequenzen und die Protospacer-Nachbarmotive (PAMs) in der gewünschten Insertionsstelle sind in blauen bzw. roten Buchstaben angegeben. Cas9 spaltet normalerweise 3-4 bp vor der PAM-Sequenz, die durch grüne Pfeile angezeigt wird. Der Zielvektor wird als Vorlage für die homologiegerichtete Reparatur (HDR) verwendet, die zum präzisen Einsetzen der Expressionskassette in das Maus- oder menschliche Genom führt. Jede der 1 kb-Sequenzen vor und nach der gewünschten Zielstelle wird als 5'- und 3'-Homologiearme (HAs) im Zielvektor verwendet. Die HAs werden durch eine Expressionskassette getrennt, die aus einem CAG-Promotor, der cDNA-Sequenz des Interessierenden Proteins (POI) mit OST-Tag, einem IRES-EBFP2-Reporter und einem bGH-PolyA-Signal (pA) besteht. Die Restriktionsstelle AscI wird zum Klonen des POI verwendet, und EcoRI und BamHI werden für die Linearisierung des Zielvektors verwendet. Die Strategie für CRISPR/Cas9-vermitteltes Knock-in am hROSA26-Locus ist ähnlich. (B) Diagramm des menschlichen ROSA26-Locus. Die Zielsequenzen hR26-sg1 und hR26-sg2 sind in blauen Buchstaben und die entsprechenden PAM-Sequenzen in Rot gekennzeichnet. (C) Schematisch für den All-in-One-CRISPR-Expressionsvektor pX458-DsRed2, der eine menschliche U6-gesteuerte sgRNA-Expressionskassette und eine Cas9-T2A-DsRed2-Fluoreszenz-Reporterkassette enthält. Zwei BbsI-Restriktionsstellen ermöglichen das Klonen der Leit-RNA. U6, humaner U6-RNA-Polymerase-III-Promotor; sgRNA, eine chimäre Single-Guide-RNA; CBh, ein Β-Aktin-Hybridpromotor; NLS, nukleares Lokalisierungssignal; T2A, Thosea Asigna Virus 2A selbstspleißendes Peptid; bGH-pA, Rinderwachstumshormon Polyadenylierungssignal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Einzelzellsortierung von RAW264.7- und Jurkat-Zellen, die mit CRISPR/Cas9-Vektoren transfiziert wurden, und Zielvektoren für die homologe Rekombination. Targeting-Vektoren, die für eine stabile Genexpression in RAW264.7 (A) und Jurkat (C) Zellen verwendet werden. Repräsentative durchflusszytometrische Diagramme von RAW264.7-Makrophagen (B) und menschlichen Jurkat-T-Zellen (D) transfiziert mit CRISPR/Cas9-Vektoren, die den DsRed2-Reporter und den Zielvektor exprimieren, der den EBFP2-Reporter exprimiert. Zellen, die DsRed2 und EBFP2 co-exprimierten, wurden einer Zellsortierung unterzogen und zur Expansion kultiviert; Zahlen neben den skizzierten Bereichen geben den Prozentsatz der Zellen in jedem Gate an, und nicht transfizierte Zellen wurden als Negativkontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Screening von Knock-in-Zellen durch Nachweis der EBFP2-Expression. Durchflusszytometrische Analyse von EBFP2+ und DsRed2+ RAW264.7 Makrophagen (A) und Jurkat T Zellen (B) 14 Tage nach der Elektroporation. In den Histogrammen wird die Fluoreszenzintensität (FI) von EBFP2+ oder DsRed2+ Zellen auf der X-Achse und die Anzahl der Ereignisse in jedem Fluoreszenzkanal auf der Y-Achse angezeigt. (A) Die Expression von EBFP2 und hACE2 wurde von demselben Promotor am Rosa26-Locus in RAW264.7-Mausmakrophagen angetrieben. (B) In Jurkat-Zellen ist die OST-RASGRP1-Expression mit der EBFP2-Expression am humanen ROSA26-Locus verknüpft. 14 Tage nach der Elektroporation ergab die durchflusszytometrische Analyse fast keine DsRed2+ -Zellen unter den sortierten Zellen. Wildtypzellen (WT) wurden als Negativkontrolle verwendet, und KI steht für Knock-in-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Screening auf Kandidaten-Knock-in-Zellen durch PCR und Sequenzierung. (A) Strategie zur Erzeugung von hACE2-Knock-in-Zellen. Die Positionen der PCR-Primer, die zur Unterscheidung von präzisem HDR und zufälligem Einsetzen verwendet werden, werden durch grüne Pfeile angezeigt. (B) Die PCR-Genotypisierung von fünf Kandidatenzellen (#4, #15, #22, #25 und #43), die durch Durchflusszytometrie-Screening auf EBFP2-Expression identifiziert wurden, wie in Abbildung 3veranschaulicht, zeigte, dass sowohl der 5'-Übergang (1472 bp) als auch der 3'-Übergang (1472 bp), der die Homologiearme überspannte, korrekt waren. M, DNA-Leiter; WT, das Wildtyp-RAW264.7-Steuerelement; H2O, Negativkontrolle. (C) Die Sanger-Sequenzierung der PCR-Produkte aus B ergab ein erfolgreiches Einklopfen der hACE2-Expressionskassette in den mRosa26-Locus ohne Mutationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Validierung des erfolgreichen Einklopfens der hACE2-Expressionskassette in den mRosa26-Locus in RAW264.7-Makrophagen. (A) WT RAW264.7-Makrophagen wurden als Negativkontrolle für die durchflusszytometrische Analyse verwendet. (B) Um die EBFP2-positiven Zellen von den negativen Zellen zu trennen, wurde eine zusätzliche Zellsortierung durchgeführt, um eine Population zu erhalten, die zu fast 100% aus EBFP2+ Knock-in-Zellen besteht, die als hACE2 KI-Zellen bezeichnet werden. Die DsRed2-Expression wurde ebenfalls untersucht, um sicherzustellen, dass das CRISPR/Cas9-Plasmid nicht in das Genom von RAW264.7-Makrophagen integriert wurde. In den Histogrammen wird die Fluoreszenzintensität (FI) von ENTWEDER EBFP2+ oder DsRed2+ Zellen auf der X-Achse und die Anzahl der Ereignisse in jedem Fluoreszenzkanal auf der Y-Achse angezeigt. (C) Nachweis der hACE2-Expression durch Immunoblot-Analyse mit kaninchenfeindlichen anti-humanen ACE2-monoklonalen Antikörpern. Die Expression von hACE2 wurde in Zellen aus mehreren Vertiefungen (#4, #15, #22, #25 und #43) beobachtet. WT RAW264.7 Makrophagen wurden als Negativkontrolle und GAPDH als Ladekontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Validierung des erfolgreichen Einklopfens der OST-RASGRP1-Expressionskassette in den hROSA26-Locus in Jurkat-T-Zellen. (A) WT Jurkat T-Zellen wurden als Negativkontrolle für die durchflusszytometrische Analyse verwendet. (B) EBPF2+ Subpopulationen von Jurkat-Zellen wurden durch zusätzliche Runden der Zellsortierung angereichert und erweitert; diese Zellen wurden als OST-RASGRP1 KI-Zellen bezeichnet. Die Knock-in-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert und hielten den DsRed2-exprimierenden Vektor nicht. In den Histogrammen wird die Fluoreszenzintensität (FI) von EBFP2+ oder DsRed2+ Zellen auf der X-Achse und die Anzahl der Ereignisse in jedem Fluoreszenzkanal auf der Y-Achse angezeigt. (C) Nachweis der OST-RASGRP1-Expression in zwei unabhängigen Knock-in-Zellen (#1 und #2) durch Immunoblot-Analyse mit Anti-RASGRP1-Antikörpern. WT Jurkat und RASGRP1-Knockout Jurkat Zellen wurden als Kontrollen und β-Actin als Belastungskontrolle verwendet. (D) Die OST-vermittelte Affinitätsreinigung wurde verwendet, um die Expression von OST-RASGRP1 unter Verwendung von RASGRP1-Knockout-Zellen als Negativkontrolle zu validieren. Immunoblot-Analyse gleicher Mengen an Proteinen aus Zelllysaten, die entweder einer Affinitätsreinigung an Strep-Tactin Sepharose-Perlen unterzogen wurden (Affinitätsreinigung) oder direkt analysiert (Gesamtlysate) und mit RASGRP1- oder GAPDH-Antikörpern (Loading Control) untersucht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In unseren Experimenten haben wir gezeigt, wie man Knock-in-Editing in Immunzellen vom Konstruktdesign bis zum Knock-in-Zellscreening und Validierung am Beispiel menschlicher Jurkat-T-Zellen und muriner RAW264.7-Makrophagen durchführt. Sowohl T-Zell- als auch Makrophagen-Zelllinien sind resistent gegen Transfektion36,37; Das Problem der geringen Effizienz der CRISPR/Cas9-Abgabe kann jedoch mit Hilfe von fluoreszierenden Reportern in Verbindung mit der Zellsortierung überwunden werden. Dieses Protokoll eignet sich für Genrettungsexperimente und Protein-Protein-Interaktionsexperimente, kann jedoch nicht auf die Untersuchung regulatorischer DNA-Sequenzen wie Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren angewendet werden, da das Protokoll für die Knock-in-Modifikation des Rosa26-Locus entwickelt wurde.
Zwei fluoreszierende Reporter unterstützten die CRISPR/Cas9-Knock-In-Bearbeitung
Wir haben erfolgreich ein duales fluoreszierendes Reportersystem angewendet, um unabhängige Sätze von CRISPR/Cas9-Vektoren in Immunzellen vorübergehend zu exprimieren, was in früheren Studien zur Deletion großer DNA-Fragmente führte21. Wir haben ein CRISPR/Cas9-Targeting-Tool entwickelt, das das fluoreszierende Protein DsRed2 als Reporter und ein zusätzliches spektral unterscheidendes fluoreszierendes Protein verwendet, um die Lieferung der DNA-Vorlage für die Knock-in-Modifikation zu verfolgen. Um eine Knock-in-Allelmodifikation möglich zu machen, haben wir den EBFP2-Fluoreszenzprotein-Reporter verwendet, der keinen spektralen Spillover mit dem RFP (in unserem Fall DsRed2) aufwies, um die Transfektion der Spender-DNA zu überwachen, die als Vorlage während der homologen Rekombination dient. Um die Kassette zu optimieren, die den POI und den fluoreszierenden Reporter exprimiert, wurde eine IRES-Sequenz eingeführt, um unabhängige Proteine zu erhalten. In unserer vorherigen Studie stellten wir fest, dass die verbleibenden Aminosäuren aus dem P2A- oder T2A-Linker, die nach der posttranskriptionellen Spaltung übrig blieben, die Proteinlokalisation auf der Zelloberfläche beeinflussten. Die IRES-Sequenz hinterlässt solche Restaminosäuren nicht. Wie in einer früheren Studie beschrieben, führte die IRES zu höheren Konzentrationen des fluoreszierenden Reporters, nachdem das Cas9-Protein durch CAG-Promotor38angetrieben wurde.
All-in-One CRISPR/Cas9 Plasmid
Verschiedene Formate und Kombinationen des CRISPR/Cas9-Systems wurden in früheren Studien beschrieben, wie z.B. Cas9-Transfektion als mRNA oder Protein zusammen mit chemisch synthetisierten sgRNAs39. CRISPR/Cas9 RNP-Komplexe wurden auch in Säugetierzellen abgegeben; Diese Strategie bietet die Vorteile eines früheren Beginns der Nukleaseaktivität und einer kürzeren Halbwertszeit; Die Kennzeichnung der RNPs ist jedoch im Vergleich zur Konstruktion von All-in-One-Plasmid weniger kostengünstig. In unseren früheren Studien fanden wir heraus, dass die Verwendung der Einzelzellsortierung zur Isolierung dieser seltenen Zellen, die CRISPR / Cas9 (DsRed2-positiv) und das Knock-in-Protein (EBFP2-positiv) exprimieren, weitaus weniger kompliziert ist als die Verwendung der RNP-Verabreichung, und es ist einfach, die Plasmide vorzubereiten. Es ist wahr, dass dieses Protokoll auf einzelliger Sortierung beruht. Aber unser Protokoll ist einfach durchzuführen und führt zu erfolgreichen Knock-in-Modifikationen mit hoher Reproduzierbarkeit.
Expression eines POI aus dem Rosa26 Locus
Es gibt mehrere Berichte in der Literatur, die Methoden zur Markierung endogener Proteine mit fluoreszierenden Reportern unter Verwendung von CRISPR / Cas9-Bearbeitung40,41,42beschreiben. Die Vorteile des endogenen Taggings bestehen darin, dass es möglich ist, die subzelluläre Lokalisation zu bestimmen und das endogene Protein in vivo zu verfolgen. Probleme können jedoch auftreten, wenn es nicht möglich ist, eine geeignete CRIPSR-Leit-RNA am endogenen Locus zu entwerfen. Hier haben wir eine alternative Knock-in-Methode entwickelt, indem wir POI-IRES-EBFP2 in den genomischen Safe-Harbor-Locus Rosa26integriert haben, der die Einschränkungen der Suche nach geeigneten Leitfäden für die Positionierung endogener Tags überwindet.
Wir fassen einige wichtige Punkte zusammen, die bei den Experimenten beachtet werden müssen, um die technische Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Zunächst benötigt der Zellsortierer einen 405 nm violetten Laser zur Anregung von EBFP2 und einen 488 nm blauen Laser oder alternativ einen 561 nm gelben Laser zur Anregung von DsRed2. Mit solchen Konfigurationen können EBFP2 und DsRed2 ohne spektralen Spillover detektiert werden, was zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. In unseren Experimenten lag der Anteil von DsRed2+ EBFP2+ doppelt positiven Zellen bei nur 0,9%; Daher war die Gating der richtigen Population für den Erfolg der Experimente unerlässlich. Eine zweite Sortierrunde wurde durchgeführt, um die EBFP2+ positiven Zellen zu gaten, gefolgt von einer PCR-Validierung. Darüber hinaus ist es für den Nachweis von Knock-in-Proteinen vorzuziehen, ein Protein-Tag wie OST oder eine andere Art von Tag einzuführen. Der Knockout des Gens vor Rosa26 Locus Knock-in-Experimenten bietet eine gute Gelegenheit zu beurteilen, ob der Antikörper eine wünschenswerte Spezifität aufwies. Wenn die Antikörperspezifität nicht ausreicht, sollte der Nachweis des Knock-in-Proteins nach dem Pulldown über das Protein-Tag erfolgen. Schließlich kann während des FACS-Screenings der Zellen, die das Knock-in-Allel exprimieren, die Intensität von EBFP2 verwendet werden, um zu beurteilen, ob zwei Kopien oder eine Kopie des Knock-in-Allels vorhanden sind.
Anträge
In diesem Protokoll beschrieben wir die Knock-in-Modifikation von RASGRP1, einem Schlüsselmolekül, das an der T-Zell-Aktivierung beteiligt ist27. Wir erhielten zuerst RASGRP1-Knockout-Jurkat-Zellen, die für Funktionsverluststudien verwendet werden können, und wir erzeugten zusätzliche Jurkat-Zellen, die OST-RASGRP1 am hROSA26-Locus exprimierten. Jurkat-Zellen sind die am häufigsten verwendete menschliche Zelllinie für das Studium der T-Zellbiologie43. Aufgrund des Erfolgs der Immuntherapie bei der Verhinderung der T-Zell-Erschöpfung bei Krebspatienten haben Immunologen und Krebsbiologen großes Interesse daran, Jurkat-Zellen für funktionelle Studien von Kandidatenmolekülen zu modifizieren. Es ist auch bemerkenswert, dass die Jurkat T-Zelllinie häufig zur Dissektion von Signalwegen verwendet wird, aber es gibt Einschränkungen bei der Verwendung dieser Zelllinie, da Jurkat-Zellen bei Stimulation schlechte Produzenten von IFN-γ sind44. Frühere Studien verwendeten sowohl endogene Locus-Modifikation45 als auch Gentechnik am hROSA26-Locus 46, um Knock-in-Experimente in menschlichen Jurkat-Zellen durchzuführen. Beide Strategien haben ihre eigenen Vorteile; durch Modifikation des endogenen Locus wird das Protein vermutlich auf einer "physiologischen" Ebene exprimiert. Die Knock-in-Modifikation am hROSA26-Locus führt zu vorhersagbaren Ergebnissen, da ein alternatives Spleißen von mRNA vermieden wird und auch die Häufigkeit des modifizierten Proteins leicht nachweisbar ist. Andere genomische Safe Harbors, wie die Adeno-assoziierte Virusstelle 1(AAVS1)und der Chemokinrezeptor (CC-Motiv) 5(CCR5)47,48 verdienen mehr Erforschung.
In unserer vorherigen Studie, als Vav1-OST in höheren Konzentrationen am Rosa26-Locus der Maus in RAW264.7-Zellen exprimiert wurde, die sehr häufig verwendete Makrophagenzellen sind, konnten wir seine Wechselwirkung mit niedrig exprimierten Vav3-Molekülen aufgrund des hohen Gehalts an Köderprotein und der hohen Effizienz der OST-Affinitätsreinigung nachweisen13. Wir beschrieben auch Knock-in-Experimente, um eine Makrophagenzelllinie zu etablieren, die stabil hACE2 exprimiert, einen Rezeptor für SARS-CoV-2, in dem eine reichliche Expression garantiert ist. In der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdatenbank wird murines Ace2 in Lungenmakrophagen exprimiert, und das von uns entwickelte genetische ZelluläreModell, das hACE2 exprimiert, könnte für Studien an Makrophagen während einer SARS-CoV-2-Infektion nützlich sein.
Sonstige Überlegungen
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Knock-in-Zellen zu identifizieren, die einen POI mit Hilfe von durchflusszytometrischen Analysen eines fluoreszierenden Reporters, in unserem Fall des EBFP2-Reporters, exprimieren. Wenn jedoch für ein Oberflächenprotein49oberflächenmarkierende Antikörper verfügbar sind, die durch FACS nachweisbar sind, ist es nicht erforderlich, das Reportersystem50zu verwenden. Die T-Zell- und Makrophagenzelllinien sowie die Beispiele von OST-markierten Proteinen, die für Interaktomstudien verwendet werden, werden hauptsächlich für Signalstudien verwendet, und die Mehrheit dieser Signalmoleküle ist im Zytosol oder in den Zellkernen lokalisiert. Daher kann ein fluoreszierender Reporter für die Identifizierung von wünschenswerten Knock-in-Zellen benötigt werden.
Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass dieses Protokoll für Zelllinien entwickelt wurde und die Anwendung auf primäre Immunzellen wie T-Zellen, Monozyten / Makrophagen nicht validiert wurde. Aufgrund der begrenzten Fähigkeit der Zellen, sich zu vermehren, empfehlen wir dieses Protokoll nicht für die Verwendung mit primären Immunzellen. Da der fluoreszierende Reporter EBFP2 unter dem gleichen Promotor wie das Knock-in-Gen oder POI unter Verwendung eines IRES-Elements exprimiert wurde, beobachteten wir keine Zellen, die den fluoreszierenden Reporter in Abwesenheit des Knock-in-Gens exprimierten. Wir vermuten, dass die Erholung der fluoreszierenden proteinexpressierenden Zellen stark vom Erfolg der homologen Rekombination abhängt. Wie in einer früheren Studie berichtet, ist es mühsam, die richtigen Knock-in-Zellen durch Einzelzellsortierung zu sortieren, zu erweitern und zu identifizieren, wenn die Knock-in-Effizienz sehr niedrig ist42, was auch erklärt, warum wir die Zellen in großen Mengen sortieren mussten, um die Erfolgsrate zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken der Durchflusszytometrie-Kerneinrichtung der Xinxiang Medical University. Die Entwicklung einer solchen Technologie wurde durch NSFC-Zuschüsse 81601360 an LZ, 81471595 und 32070898 an YL unterstützt. Die Arbeit wird auch von der Stiftung des Henan Educational Committee Nr. 21IRTSTHN030 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
| Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
| Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
| BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
| Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
| E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
| FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
| GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
| Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
| Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
| LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
| Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
| Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
| Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
| Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
| RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
| Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
| RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
| Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
| 1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
| 96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |
References
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