Her præsenterer vi to protokoller, der gør det muligt at modellere tarmapikaspecifikke interaktioner. Organoid-afledte tarmmonolag og AIR-Liquid Interface (ALI) kulturer letter generering af veldifferentierede epithelia tilgængelige fra både lysarms- og basolaterale sider, mens polaritetsindvendte tarmorganoider udsætter deres apikale side og kan opnås til høje gennemløbsanalyser.
Tarmepitelets foring består af et simpelt lag af specialiserede epitelceller, der udsætter deres apikale side for lumen og reagerer på eksterne signaler. Nylig optimering af in vitro-kulturbetingelser giver mulighed for genskabelse af tarmstamcellenicher og udvikling af avancerede 3-dimensionelle (3D) kultursystemer, der opsummerer cellesammensætningen og organiseringen af epitelet. Tarmorganoider indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM) kan opretholdes på lang sigt og selvorganisere for at generere et veldefineret, polariseret epitel, der omfatter en intern lumen og en ekstern eksponeret basal side. Tarmorganoidernes restriktive karakter udgør en udfordring med hensyn til at få adgang til epitelin vitroens apikale overflade og begrænser undersøgelsen af biologiske mekanismer såsom optagelse af næringsstoffer og interaktioner mellem vært og mikrobiota/host-patogen. Her beskriver vi to metoder, der letter adgangen til den apikale side af organoidepitelet og understøtter differentieringen af specifikke tarmcelletyper. For det første viser vi, hvordan ECM fjernelse fremkalder en inversion af epitelcelle polaritet og giver mulighed for generering af apikale-out 3D organoider. For det andet beskriver vi, hvordan man genererer 2-dimensionelle (2D) monolayers fra enkeltcelleaffjedringer afledt af tarmorganoider, der består af modne og differentierede celletyper. Disse teknikker giver nye værktøjer til at studere apikale-specifikke interaktioner af epitel med eksterne signaler in vitro og fremme brugen af organoider som en platform for at lette præcision medicin.
Tarmepitelet er det næststørste epitel i menneskekroppen og består af et polariseret cellelag, der letter optagelsen af næringsstoffer og fungerer som en barriere mod miljømæssige fornærmelser1. Denne skelnen mellem de apikale og basolaterale sider gør det muligt for epitelceller at udføre deres forskellige funktioner. Det apikale rum udsættes for lumen og formidler de epiteliske interaktioner med miljømæssige stimuli og mikroorganismer, samtidig med at det letter optagelsen af næringsstoffer. Basolateraloverfladen huser intercellulære kryds og cellematrix vedhæftninger, mens de blander sig med celler i immunsystemet og andet væv2. Disse knudepunkter genererer et uigennemtrængeligt monolag fastgjort til kældermembranen, der fungerer som en barriere og leverer de absorberede næringsstoffer til det omgivende kropsvæv.
Etableringen af kultursystemer, der er i stand til at rekapitalere disse tarmfunktioner in vitro, har været udfordrende3. Konventionelle in vitro modeller udnytte forvandlet human kolorektal cancer cellelinjer, såsom Caco-2, til at generere 2D monolayer kulturer. På trods af at de er i stand til at modellere flere funktioner i absorptive rumet, kan disse modeller ikke fuldt ud opsummere tarmepitelets sammensætning og funktion, som begrænser centrale funktionelle egenskaber og applikationer4,5.
Fremkomsten af organoider som et avanceret 3D-kultursystem genereret fra stamceller, der selvorganiserer og differentierer sig til organspecifikke celletyper, var et gennembrud i in vitro-undersøgelsen af tarmepitelet6. Tarmorganoider er indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM), der ligner de basale lamina og danner cellematrixkryds, der gør det muligt for disse kulturer at bevare epitelets apicobasale polaritet. Organoider udviser en lukket arkitektur, hvor den apikale side udsættes for det luminale rum og dermed efterligner tarmens struktur. Selvom denne lukkede organisation giver mulighed for at studere orienteringsspecifikke funktioner, begrænser den undersøgelser, der kræver adgang til den apikale side af epitelet. Der er taget forskellige tilgange til at overvinde disse begrænsninger i både 2D og 3D, herunder organoid fragmentering, organoid mikroinjection og generation af monolayerkulturer7. Organoid fragmentering forårsager tab af den strukturelle organisation og ødelæggelsen af cellekryds, hvilket gør det muligt at udsætte epitelets apikale overflade for mediet. Denne teknik udnytter fragmenternes regenerative kapacitet til at reformere organoider , når de sås i en ekstracellulær matrix og er blevet brugt til at modellere infektionssygdomme og værtspatogeninteraktioner8,9. Samtidig adgang til både den apikale og basale overflade kan dog også fremkalde ikke-specifikke infektionsresponser.
En alternativ tilgang, der giver adgang til den apikale overflade og bevarer både den strukturelle arkitektur og cellekryds, repræsenteres af mikroinjektionen af faktorer i organoidernes lumen. Denne metode er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere værtspatogeninteraktioner og modellere virkningerne af Cryptosporidium10, H. pylori11og C. difficile12 på mave-tarmepitelet in vitro. Ved hjælp af lignende teknikker blev det mutagene potentiale i pks+ stamme af E. coli på tarmepitelet bestemt13. Selv om det er effektivt, organoid mikroinjection er en besværlig og ineffektiv opgave i betragtning af det store antal organoider, der er nødvendige for at blive injiceret for at opnå målbare virkninger og derfor begrænser dens anvendelse for høj gennemstrømning assays.
Nylige fremskridt med tarmorganoider har også givet metoder til etablering af 2D-monolagsorganoidkulturer , hvorved deres apikale overflade14,15,16,17. Disse organoid-afledte monolayers rekapitalulere nøglen in vivo egenskaber tarm epitel. De udviser en fysiologisk relevant cellesammensætning, der indeholder både differentierede og stamcellepopulationer og modellerer mangfoldigheden på tværs af krypto-villus-aksen. Da apicobasal polaritet bevares, giver de iboende monolayeregenskaber nem adgang til både de apikale og basolaterale sider og medieudvekslinger kan efterligne tarmflow og fjernelse af affald, hvilket giver mulighed for langsigtet kultur. Disse funktioner gør organoid-afledte monolayers modtagelige for undersøgelser med fokus på luminale interaktioner og giver en overlegen model for epitelbarriere integritet og permeabilitet18,19.
Undersøgelser har vist , at epitelcellepolariteten er stramt reguleret af ECM-proteiner i MDCK-sfæroider20,21 og for nylig i humane tarmorganoider22. Fjernelse af ECM-komponenter eller hæmning af den integrinreceptor, der formidler cellematrixkrydsene, resulterer i en polaritetsændring af tarmorganoider og eksponering af epitelets apikale side til mediet22. Denne tilgang har tiltrukket sig interesse fra forskere, der arbejder med smitsomme sygdomme, da det giver nem adgang til den apikale side i 3D og gør det modtageligt for høje gennemløbsanalyser. Her beskriver vi en modificeret protokol baseret på det nylige arbejde fra Amieva lab22, der letter genereringen af 3D-tarmorganoider, der let udsætter deres apikale side. Vi skitserer også en protokol, der effektivt og reproducerbart kan generere tarm 2D-monolag afledt af tarmorganoider.
Epitelorganoidmodeller er blevet kraftfulde platforme, der kan bruges til at modellere vævsorganisation, sygdomsprogression og identificereterapier 23,28,29. Organoid mikroinjection har tilføjet værdi til organoidernes evne til modellering af smitsomme sygdomme, da det giver mulighed for patogeninteraktion med den apikale side af værtsepitelet. Nylige fremskridt inden for mikroinjection teknikker har optimeret injektion hastighed i organoider og har opnået en hastighed på op til 90 injiceres organoider i timen. Barrierefunktionen i injicerede organoider blev bevaret, og den lave iltkoncentration inde i lumen gjorde det muligt for overlevelsen af obligatoriske anaerob injicerede bakterier30. Undersøgelser har imidlertid bemærket tilstedeværelsen af heterogenitet i organoidpopulationer inden for samme brønd. Disse forskelle blev observeret i størrelse og form31, ekspressionsniveauer for nøglegener32samt spredningsrater33. Differentialresponser inden for samme organoidpopulation på forbindelser som forskolin og PGE2 eller koleratoksin er også blevet beskrevet28,33. Disse resultater fremhæver behovet for høje organoidtal i undersøgelser og begrænser udnyttelsen af luminal injektion.
Konventionel organoidkultur er baseret på indkapsling og formering af organoider i en hydrogel. Hydrogels kan dog udgøre begrænsninger på diffusion og indføre koncentrationsgradienter, hvilket kan øge heterogeniteten34. Desuden er der dokumenteret stor variation, ikke kun mellem kulturer og donorer, men også under individuelle forsøgsbetingelser. Donorkilde, hydrogelens biokemiske egenskaber og organoidens iboende heterogenitet som kultursystem er vigtige faktorer, der kan øge eksperimentel variation og begrænse reproducerbarheden af resultater opnået i downstream-applikationer. Begge de metoder, der er beskrevet her, giver et simpelt middel til at udsætte den apikale side af epitelet, hvilket giver mulighed for modellering af forbindelser og patogener af interesse ved direkte at tilføje dem til kulturmediet. Reduktionen i hydrogeludnyttelsen kan begrænse eksperimentelle variabilitet fra tekniske fejlkilder.
De apikale intestinale organoider bevarer de vigtigste egenskaber ved organoidmodelsystemet, og deres skalerbarhed gør dem mere modtagelige for høje gennemløbsanalyser sammenlignet med 2D-monolayeren. Da organoiderne bevarer deres 3D-struktur, er tilgængeligheden af den basale side imidlertid begrænset og kan hindre undersøgelser, der kræver adgang til begge sider samtidigt.
Vi har vist, at polaritetsinversionen af tarmorganoider afhænger af en effektiv og absolut fjernelse af ECM, samtidig med at organoidernes intakte struktur bevares. Både brugen af dissociationsopløsningen til at fjerne ECM og den anti-vedhængende løsning til at forhindre organoider i at klæbe til plastmaterialet bidrog til at forbedre den samlede effektivitet af den protokol, der blev offentliggjort af Co. J. Y. og kolleger22, navnlig med hensyn til antallet af apikale organoider, der blev produceret til downstream-applikationer.
Desuden bemærkede vi, at vores protokol understøtter en mere effektiv inversion af organoider mindre end 250 μm og ved hjælp af større organoider kan resultere i en reduceret organoid output, på grund af fragmentering forårsaget af pipetting. Bredborespidser, som dem, der er angivet i materialetabellen, kan tillade brug af større organoider. Bredborespidser er dog mindre effektive i ECM-dissociation sammenlignet med standardspidser på grund af den lavere anvendte mekaniske kraft. Derfor kan gentage trin 1.2.9-1.2.11 være påkrævet for tilstrækkelig forstyrrelse og fuldstændig fjernelse af alle ECM-rester, når der arbejdes med større organoider.
Organoider i suspension kan overleve i mindst 2 uger. Efter denne periode observerede vi morfologiændringer og et øget antal celledød. Tilstedeværelsen af formerende celler i de apikale organoider22 giver mulighed for genetablering af apikale intestinale organoidkulturer. Dette kan opnås ved at adskille apikale organoider til enkelte celler og integrere dem i ECM med tarmorganoid ekspansionsmedium.
En begrænsning, der ofte forekommer i protokoller, der beskriver etableringen af tarmorganoider i suspensionskulturer, er generering af store aggregater. Dette påvirker flere variabler såsom effektivitet, reproducerbarhed af de morfologiske træk, permeabilitet til forbindelser og parakrinesignalering. I lighed med protokollen offentliggjort af Co, J. Y. og kolleger bekræfter vi her at have opnået polaritetsinversion på mindst 97% af alle de suspenderede organoider uden at klippe efter 3 dage i suspension. I modsætning til offentliggørelsen har vi imidlertid indført et mekanisk dissociationstrin for at reducere dannelsen af store aggregater og øge udbyttet. Da denne procedure kan beskadige organoidernes epitel, forlængede vi organoids inkubationsperioden i yderligere 2 dage for at muliggøre fuldstændig epitelgenvinding og sikre kulturer af høj kvalitet til downstream-applikationer. Indførelsen af konstant omrøring ved brug af en inkubator shaker eller en spinner kolbe kan potentielt reducere fusionshændelser, minimere fragmentering og øge iltningen. Disse alternative tilgange kan opretholde kulturerne i længere tid, reducere celledøden og give mulighed for yderligere differentiering af de apikale tarmorganoider.
Etableringen af en organoid-afledt 2D monolayer giver flere fordele og ulemper i forhold til de omvendte polaritet organoider. Den her beskrevne protokol giver mulighed for hurtig etablering af en sammenløbet monolayerkultur, typisk på mindre end 7 dage og mulighed for langsigtet vedligeholdelse af kulturerne i en længere periode (op til 10 uger). Protokollen og de medier, der anvendes her, giver også mulighed for effektiv differentiering af et betydeligt antal celler, der ikke altid findes i andre organoid-afledte monolayerkulturer16. Etablering af en monolayer på en cellekulturindsatsmembran giver samtidig adgang til både de apikale og basolaterale sider af epitelet, hvilket gør dem ideelle til undersøgelser i barriereintegritet og epiteltransport. Denne forenklede adgang gør dem også mere modtagelige for infektions- og lægemiddelbehandlingsundersøgelser. Desuden opretholder disse kulturer mange af de egenskaber, der er unikke for donoren, og bevarer deres relevans for patientspecifikke undersøgelser. ALI-kulturmetoden letter også differentieringen af et mere funktionelt epitel bestående af både sekretoriske og absorptive celletyper, hvilket gør det mere repræsentativt for det menneskelige tarmepitetel. Den relative stabilitet i disse kulturer gør det også muligt at opretholde dem i en længere periode, hvilket giver mulighed for langsigtede undersøgelser. Begrænsningerne i denne tilgang er imidlertid det store antal celler, der kræves for at etablere et sammenstømret monolag, og behovet for at opretholde fuldstændig sammenløb for at have en funktionel adskillelse mellem de apikale og basolaterale kamre. Den karakteristiske kryptarkitektur, som kan modelleres i 3D-organoidkulturerne, går også tabt ved etablering af en monolagskultur. Ikke desto mindre gør kulturens eksperimentelt venlige format og den lethed, hvormed de apikale og basolaterale sider af epitelet kan tilgås, det til et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af tarmfysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af Horizon 2020-bevillingen OrganoVIR 812673 på projektet Organoids for Virus Research – Et innovativt uddannelse-ITN-program.
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |