Här presenterar vi två protokoll som tillåter modellering av intestinala apical-specifika interaktioner. Organoid-härledda intestinala monolayers och Luft-Flytande Gränssnitt (ALI) kulturer underlättar generering av väl-differentierade epitel tillgänglig från både luminal och basolateral sidor, medan polaritet-inverterade intestinala organoider exponerar sin apatiska sida och är mottagliga för hög genomströmning analyser.
Fodret i tarmepiteelet består av ett enkelt lager av specialiserade epitelceller som exponerar sin apatiska sida för lumen och svarar på externa signaler. Ny optimering av in vitro-odlingsförhållanden möjliggör återskapning av tarmstamcellsnisch och utveckling av avancerade 3-dimensionella (3D) kultursystem som rekapitulerar cellsammansättningen och epitelorganisationen. Intestinala organoider inbäddade i en extracellulär matris (ECM) kan bibehållas för långsiktig och självorganisering för att generera ett väldefinierat, polariserat epitel som omfattar en inre lumen och en extern exponerad basal sida. Denna restriktiva karaktär av intestinala organoider innebär utmaningar i att komma åt den apatiska ytan av epitel in vitro och begränsar undersökningen av biologiska mekanismer såsom näringsupptag och värd-mikrobiota/värd-patogen interaktioner. Här beskriver vi två metoder som underlättar tillgången till den apatiska sidan av det organoida epitelet och stöder differentiering av specifika tarmcellstyper. Först visar vi hur ECM-avlägsnande inducerar en inversion av epitelcellspolariteten och möjliggör generering av adicala 3D-organoider. För det andra beskriver vi hur man genererar 2-dimensionella (2D) monoskikt från encelliga suspensioner som härrör från intestinala organoider, bestående av mogna och differentierade celltyper. Dessa tekniker ger nya verktyg för att studera apical-specifika interaktioner av epitel med externa ledtrådar in vitro och främja användningen av organoider som en plattform för att underlätta precisionsmedicin.
Intestinal epitel är det näst största epitelet i människokroppen och består av ett polariserat cellskikt som underlättar näringsupptag och fungerar som en barriär mot miljöförolämpningar1. Denna skillnad mellan de atiska och basolateral sidorna tillåter celler i epitel att utföra sina olika funktioner. Det apikala facket utsätts för lumen och förmedlar epitelinteraktionerna med miljöstimulanser och mikroorganismer, samtidigt som näringsupptaget underlättas. Den basolateral ytan rymmer intercellulära korsningar och cellmatris vidhäftningar, medan interfacing med celler i immunsystemet och andravävnader 2. Dessa korsningar genererar ett ogenomträngligt monoskikt fäst vid källarmembranet, som fungerar som en barriär och levererar de absorberade näringsämnena till den omgivande kroppsvävnaden.
Upprättandet av kultursystem som kan rekapitulera dessa tarmfunktioner in vitro har varit utmanande3. Konventionella in vitro-modeller använder transformerade mänskliga kolorektalcancer cellinjer, såsom Caco-2, för att generera 2D monolayer kulturer. Trots att dessa modeller kan modellera flera funktioner i absorptiva facket kan de inte helt rekapitulera tarmepitelatoriets sammansättning och funktion, vilket begränsar viktiga funktionella egenskaper ochapplikationer 4,5.
Framväxten av organoider som ett avancerat 3D-odlingssystem som genereras från stamceller som kan självorganisering och differentiera till organspecifika celltyper, var ett genombrott i in vitro-studien av intestinal epitel6. Intestinala organoider är inbäddade i en extracellulär matris (ECM) som liknar basal lamina och bildar cellmatriskorsningar som gör att dessa kulturer kan behålla epitelets apikobasala polaritet. Organoider uppvisar en sluten arkitektur där den apatiska sidan utsätts för luminalfacket, vilket efterliknar tarmens struktur. Även om denna slutna organisation erbjuder möjlighet att studera orienteringsspecifika funktioner, begränsar den undersökningar som kräver tillgång till den apatiska sidan av epitelet. Olika metoder har vidtagits för att övervinna dessa begränsningar i både 2D och 3D, inklusive organoid fragmentering, organoid mikroinjektion och generering av monolayer kulturer7. Organoid fragmentering orsakar förlusten av den strukturella organisationen och förstörelsen av cellkorsningar, vilket gör det möjligt att exponera epitelets apatiska yta för mediet. Denna teknik drar nytta av fragmentens regenerativa kapacitet att reformera organoider när de sås till en extracellulär matris och har använts för att modellera infektionssjukdomar och värdpatogeninteraktioner8,9. Samtidig tillgång till både den atiska och basala ytan kan dock också framkalla icke-specifika svar på infektion.
Ett alternativt tillvägagångssätt som ger tillgång till den apatiska ytan och bevarar både den strukturella arkitekturen och cellkorsningarna representeras av mikroinjektion av faktorer i organoidens lumen. Denna metod har använts i stor utsträckning för att studera värdpatogena interaktioner och modellera effekterna av Cryptosporidium10, H. pylori11, och C. difficile12 på mag epitel in vitro. Med liknande tekniker fastställdes den mutagena potentialen hos pks+ stam av E. coli på intestinala epitel13. Även om det är effektivt, är organoid mikroinjektion en mödosam och ineffektiv uppgift med tanke på det stora antalet organoider som behövs injiceras för att erhålla mätbara effekter och begränsar därför dess tillämpning för hög genomströmningsanalyser.
De senaste framstegen med tarmorganoider har också gett metoder för etablering av 2D monolayer organoidkulturer, vilket exponerar deras apatiska yta14,15,16,17. Dessa organoid-härledda monolayers rekapitulera viktiga in vivo egenskaper i intestinala epitel. De uppvisar en fysiologiskt relevant cellsammansättning, som innehåller både differentierade populationer och stamcellspopulationer och modellerar mångfalden över krypt-villusaxeln. Eftersom apicobasal polaritet behålls, tillåter de inneboende monolayeregenskaperna enkel åtkomst av både de apatiska och basolaterala sidorna och medieutbyten kan efterlikna tarmflöde och avfallshantering som möjliggör långsiktig kultur. Dessa funktioner gör organoid-härledda monolayers mottagliga för studier med fokus på luminal interaktioner och ger en överlägsen modell för epitelial barriär integritet ochpermeabilitet 18,19.
Studier har visat att epitelcellspolaritet regleras tätt av ECM-proteiner i MDCK-sfäroider20,21 och nyligen i mänskliga tarmorganoider22. Avlägsnande av ECM-komponenter eller hämning av integrinreceptorn som förmedlar cellmatriskorsningarna resulterar i en polaritetsåterföring av tarmorganoider och exponering av epitelets apatiska sida till mediet22. Detta tillvägagångssätt har lockat intresset hos forskare som arbetar med infektionssjukdomar eftersom det ger enkel tillgång till den apatiska sidan i 3D och gör det mottagligt för höga genomströmningsanalyser. Här beskriver vi ett modifierat protokoll baserat på det senaste arbetet av Amieva lab22, som underlättar genereringen av 3D-tarmorganoider som lätt exponerar sin apatiska sida. Vi beskriver också ett protokoll som effektivt och reproducerbart kan generera intestinala 2D monoskikt som härrör från intestinala organoider.
Epitelial organoid modeller har blivit kraftfulla plattformar som kan användas för att modellera vävnad organisation, sjukdomsprogression, och identifieraterapier 23,28,29. Organoid mikroinjektion har tillfört mervärde till organoidens förmåga att modellera infektionssjukdomar eftersom det möjliggör patogen interaktion med den apatiska sidan av värd epitel. De senaste framstegen inom mikroinjektionsteknik har optimerat injektionshastigheten hos organoider och har uppnått en hastighet på upp till 90 injicerade organoider per timme. Barriärfunktionen i injicerade organoider bevarades, och den låga syrekoncentrationen inuti lumen tillät överlevnad av obligatoriska-anaeroba injicerade bakterier30. Studier har dock noterat förekomsten av heterogenitet i organoida populationer inom samma brunn. Dessa skillnader observerades i storlek och form31, uttrycksnivåer av viktigagener 32, liksom spridningshastigheter33. Differentiella svar inom samma organoidpopulation på föreningar som forskolin och PGE2, eller koleratoxin, har också beskrivits28,33. Dessa resultat belyser behovet av höga organoida tal i studier och begränsar användningen av luminal injektion.
Konventionell organoidkultur är baserad på inkapsling och förökning av organoider i en hydrogel. Hydrogeler kan dock utgöra begränsningar för diffusion och införa koncentrationsgradienter, vilket kan öka heterogeniteten34. Dessutom har hög variation dokumenterats, inte bara mellan kulturer och givare utan också inom individuella försöksbetingelseförhållanden. Donatorkälla, hydrogelens biokemiska egenskaper och organoidens inneboende heterogenitet som odlingssystem är viktiga faktorer som kan öka experimentell variabilitet och begränsa reproducerbarheten hos resultat som erhålls i nedströmstillämpningar. Båda de metoder som beskrivs här ger ett enkelt sätt att exponera den apatiska sidan av epitelet, vilket möjliggör modellering av föreningar och patogener av intresse genom att direkt lägga till dem till odlingsmediet. Minskningen av hydrogelutnyttjandet kan begränsa experimentell variabilitet från tekniska felkällor.
De aprokala tarmorganoiderna behåller viktiga egenskaper hos det organoida modellsystemet och deras skalbarhet gör dem mer mottagliga för höga genomströmningsanalyser, jämfört med 2D-monoskiktet. Men eftersom organoiderna behåller sin 3D-struktur är tillgängligheten på den basala sidan begränsad och kan hindra studier som kräver tillgång till båda sidor samtidigt.
Vi har visat att polaritetsinversion av tarmorganoider är beroende av ett effektivt och absolut avlägsnande av ECM, samtidigt som organoidernas intakta struktur bevaras. Både användningen av dissociationslösningen för att avlägsna ECM och den anti-vidhäftande lösningen för att förhindra organoider vidhäftning av plastartiklarna bidrog till att förbättra den totala effektiviteten hos det protokoll som publicerats av Co, J. Y. och kollegor22, särskilt när det gäller antalet aprokala organoider som produceras för nedströmsapplikationer.
Dessutom observerade vi att vårt protokoll stöder effektivare inversion av organoider mindre än 250 μm och användning av större organoider kan resultera i en minskad organoid effekt, på grund av fragmentering orsakad av pipetting. Breda spetsar, som de som anges i materialförteckningen,kan möjliggöra användning av större organoider. Breda spetsar är dock mindre effektiva vid ECM-dissociation jämfört med standardspetsar på grund av den lägre applicerade mekaniska kraften. Därför kan upprepade steg 1.2.9-1.2.11 krävas för tillräcklig störning och fullständigt avlägsnande av alla ECM-rester vid arbete med större organoider.
Organoider i suspension kan överleva i minst 2 veckor. Efter denna tidsperiod observerade vi morfologiska förändringar och ett ökat antal celldöd. Förekomsten av prolifererande celler i de aprokala organoiderna22 möjliggör återetablering av aprotiska in intestinala organoidkulturer. Detta kan uppnås genom att skilja apical-out organoider till enstaka celler och bädda in dem i ECM med intestinala organoid expansion medium.
En begränsning som ofta påträffas i protokoll som beskriver etableringen av tarmorganoider i suspensionskulturer är genereringen av stora aggregat. Detta påverkar flera variabler såsom effektivitet, reproducerbarhet av morfologiska funktioner, permeabilitet till föreningar och parakrina signalering. I likhet med protokollet som publicerats av Co, J. Y. och kollegor, bekräftar vi här att vi har fått polaritet inversion av minst 97% av alla suspenderade organoider utan att shearing efter 3 dagar i suspension. Men i motsats till publikationen har vi infört ett mekaniskt dissociationssteg för att minska bildandet av stora aggregat och öka avkastningen. Eftersom detta förfarande kan skada epitel av organoiderna, förlängde vi inkubationstiden för organoider i ytterligare 2 dagar för att möjliggöra fullständig epitelåtervinning och säkerställa högkvalitativa kulturer för nedströmsapplikationer. Införandet av konstant agitation med användning av en inkubator shaker eller en spinner kolv kan potentiellt minska fusion händelser, minimera fragmentering och öka syresättning. Dessa alternativa metoder kan upprätthålla kulturerna under längre varaktigheter, minska celldöden och möjliggöra ytterligare differentiering av de atiska tarmorganoiderna.
Etableringen av en organoid-härledd 2D monolayer ger flera fördelar och nackdelar jämfört med inverterad polaritet organoider. Protokollet som beskrivs här möjliggör snabb etablering av en sammanflödes monolayerkultur, vanligtvis på mindre än 7 dagar och möjligheten till långsiktigt underhåll av kulturerna under en längre tid (upp till 10 veckor). Protokollet och de medier som används här möjliggör också en effektiv differentiering av ett betydande antal celler, som inte alltid finns i andra organoid-härledda monoskiktskulturer16. Att upprätta ett monoskikt på ett cellkulturinsättningsmembran möjliggör samtidig åtkomst till både de apatiska och basolaterala sidorna av epitelet, vilket gör dem idealiska för studier i barriärintegritet och epiteltransport. Denna förenklade tillgång gör dem också mer mottagliga för infektions- och läkemedelsbehandlingsstudier. Dessutom upprätthåller dessa kulturer många av de egenskaper som är unika för givaren och upprätthåller deras relevans för patientspecifika studier. ALI-odlingsmetoden underlättar också differentiering av ett mer funktionellt epitel bestående av både sekreterliga och absorptiva celltyper, vilket gör det mer representativt för det mänskliga tarmepitetelet. Den relativa stabiliteten hos dessa kulturer gör det också möjligt att upprätthålla dem under en längre tid, vilket ger möjlighet till långsiktiga studier. Begränsningar av detta tillvägagångssätt är dock det stora antalet celler som krävs för att upprätta ett sammanflöde av monoskikt och behovet av att upprätthålla fullständig sammanflöde för att ha en funktionell separation mellan de apatiska och basolaterala kamrarna. Den karakteristiska kryptarkitekturen, som kan modelleras i 3D-organoidkulturerna, går också förlorad när man etablerar en monolayerkultur. Ändå gör det experimentellt vänliga formatet av kulturen och den lätthet med vilken epitelets apatiska och basolaterala sidor kan nås, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för studier av tarmfysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansierades av Horizon 2020-stipendiet OrganoVIR 812673 projektet Organoids for Virus Research – An innovative training-ITN programme.
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |