यहां हम दो प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो आंतों के एपिकल-विशिष्ट इंटरैक्शन के मॉडलिंग की अनुमति देते हैं। ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न आंतों के मोनोलेयर और एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) संस्कृतियां चमकदार और बेसोलेटरल दोनों पक्षों से अच्छी तरह से विभेदित एपिथेलिया की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाती हैं, जबकि ध्रुवीयता-उल्टे आंतों के ऑर्गेनॉइड उनके एपिकल पक्ष को बेनकाब करते हैं और उच्च थ्रूपुट परख के लिए उत्तरदायी हैं।
आंत एपिथेलियम की परत विशेष एपिथेलियल कोशिकाओं की एक साधारण परत से बनी है जो उनके एपिकल साइड को ल्यूमेन में बेनकाब करती है और बाहरी संकेतों का जवाब देती है। इन विट्रो संस्कृति स्थितियों का हालिया अनुकूलन आंतों के स्टेम सेल आला के पुनः निर्माण और उन्नत 3-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों के विकास के लिए अनुमति देता है जो सेल संरचना और एपिथेलियम के संगठन को पुन: स्थापित करते हैं। एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड आंतों के ऑर्गेनॉइड को लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है और एक अच्छी तरह से परिभाषित, ध्रुवीकृत एपिथेलियम उत्पन्न करने के लिए स्वयं-व्यवस्थित किया जा सकता है जिसमें एक आंतरिक ल्यूमेन और एक बाहरी उजागर बेसल पक्ष शामिल है। आंतों के ऑर्गेनॉइड की यह प्रतिबंधात्मक प्रकृति विट्रो में एपिथेलियम की एपिकल सतह तक पहुंचने में चुनौतियां प्रस्तुत करती है और पोषक तत्वों के तेज और मेजबान-माइक्रोबायोटा/मेजबान-रोगजनक बातचीत जैसे जैविक तंत्रों की जांच को सीमित करती है । यहां, हम दो तरीकों का वर्णन करते हैं जो ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम के एपिकल साइड तक पहुंच की सुविधा प्रदान करते हैं और विशिष्ट आंतों के सेल प्रकारों के भेदभाव का समर्थन करते हैं। सबसे पहले, हम दिखाते हैं कि कैसे ईसीएम हटाने एपिथेलियल सेल ध्रुवता के उलटा होता है और एपिकल-आउट 3 डी ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। दूसरा, हम बताते हैं कि आंतों के ऑर्गेनॉइड से प्राप्त एकल कोशिका निलंबन से 2-आयामी (2डी) मोनोलेयर कैसे उत्पन्न करें, जिसमें परिपक्व और विभेदित कोशिका प्रकार शामिल हैं। ये तकनीकें विट्रो में बाहरी संकेतों के साथ एपिथेलियम के एपिकल-विशिष्ट इंटरैक्शन का अध्ययन करने और सटीक दवा की सुविधा के लिए एक मंच के रूप में ऑर्गेनॉइड के उपयोग को बढ़ावा देने के लिए उपन्यास उपकरण प्रदान करती हैं।
आंतों का एपिथेलियम मानव शरीर का दूसरा सबसे बड़ा एपिथेलियम है और इसमें एक ध्रुवीकृत कोशिका परत होती है जो पोषक तत्वों को तेज करने की सुविधा प्रदान करती है और पर्यावरण के अपमान के खिलाफ बाधा के रूप में कार्य करती है1. एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों के बीच यह अंतर एपिथेलियम की कोशिकाओं को अपने विविध कार्यों को पूरा करने की अनुमति देता है। एपिकल डिब्बे को ल्यूमेन के संपर्क में आता है और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं और सूक्ष्मजीवों के साथ एपिथेलियल इंटरैक्शन में मध्यस्थता करता है, जबकि पोषक तत्वों को तेज करने में भी सुविधा प्रदान करता है। बेसोलेटेरल सतह में अंतरकोशिकीय जंक्शन और सेल-मैट्रिक्स आसंजन होते हैं, जबकि प्रतिरक्षा प्रणाली और अन्य ऊतकों की कोशिकाओं के साथ इंटरफेसिंग2। ये जंक्शन तहखाने की झिल्ली से जुड़ा एक अभेद्य मोनोलेयर उत्पन्न करते हैं, जो एक बाधा के रूप में कार्य करता है और शरीर के ऊतकों को अवशोषित पोषक तत्वों को बचाता है।
इन आंतों के कार्यों को विट्रो में पुनः पुनः स्थापित करने में सक्षम संस्कृति प्रणालियों की स्थापनाचुनौतीपूर्णरही है । पारंपरिक इन विट्रो मॉडल 2D मोनोलेयर संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए कैको-2 जैसी मानव कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करते हैं। अवशोषण डिब्बे के कई कार्यों को मॉडलिंग करने में सक्षम होने के बावजूद, ये मॉडल आंतों के एपिथेलियम संरचना और कार्य को पूरी तरह से पुन: स्थापित नहीं कर सकते हैं, जो प्रमुख कार्यात्मक विशेषताओं और अनुप्रयोगों को सीमित करता है4,5।
स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न एक उन्नत 3 डी संस्कृति प्रणाली के रूप में ऑर्गेनॉइड का उद्भव जो अंग-विशिष्ट कोशिका प्रकारों को स्वयं व्यवस्थित और अंतर कर सकता है, आंतों के एपिथेलियम6के इन विट्रो अध्ययन में एक सफलता थी। आंतों के ऑर्गेनॉइड एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड होते हैं जो बेसल लैमिना जैसा दिखता है और सेल-मैट्रिक्स जंक्शनों का निर्माण करता है जो इन संस्कृतियों को एपिथेलियम की एपिकोबेसल ध्रुवीयता को बनाए रखने की अनुमति देता है। ऑर्गेनॉइड एक संलग्न वास्तुकला प्रदर्शित करते हैं जिसमें एपिकल साइड ल्यूमिनल डिब्बे के संपर्क में आता है, इस प्रकार आंत की संरचना की नकल करता है। यद्यपि यह बंद संगठन अभिविन्यास-विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है, यह उन जांचों को सीमित करता है जिनके लिए एपिथेलियम के एपिकल पक्ष तक पहुंच की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनॉइड विखंडन, ऑर्गेनॉइड माइक्रोइंजेक्शन और मोनोलेयरसंस्कृतियोंकी पीढ़ी सहित 2डी और 3 डी दोनों में इन सीमाओं को दूर करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण अपनाए गए हैं। ऑर्गेनॉइड विखंडन संरचनात्मक संगठन के नुकसान और सेल जंक्शनों के विनाश का कारण बनता है, जो एपिथेलियम की एपिकल सतह के माध्यम के जोखिम की अनुमति देता है। यह तकनीक एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स में वरीयता प्राप्त होने पर ऑर्गेनॉइड में सुधार करने के लिए टुकड़ों की पुनर्योजी क्षमता का लाभ उठाती है और इसका उपयोग संक्रामक रोग और मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन8,9को मॉडल करने के लिए किया गया है। हालांकि, दोनों apical और बेसल सतह के लिए एक साथ उपयोग भी संक्रमण के लिए गैर विशिष्ट प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना हो सकता है ।
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जो एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति देता है और संरचनात्मक वास्तुकला और सेल जंक्शनों दोनों को संरक्षित करता है, ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन में कारकों के माइक्रोइंजेक्शन द्वारा दर्शाया जाता है। इस विधि का बड़े पैमाने पर उपयोग मेजबान-रोगजनक बातचीत का अध्ययन करने और क्रिप्टोस्पोरिडियम10, एच पाइलोरी11 और सी डिफिसिल12 के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इसी तरह की तकनीकों का उपयोग करते हुए, आंतों के एपिथेलियम पर ई कोलाई के पीकेएस+ तनाव की उत्परिवर्तनीय क्षमता13निर्धारित की गई थी। हालांकि प्रभावी, ऑर्गेनॉइड माइक्रोइंजेक्शन एक श्रमसाध्य और अक्षम कार्य है जो ऑर्गेनॉइड की उच्च संख्या को ध्यान में रखते हुए है जिसे मापने योग्य प्रभाव प्राप्त करने के लिए इंजेक्ट किए जाने की आवश्यकता होती है और इसलिए उच्च थ्रूपुट परख के लिए इसके आवेदन को सीमित करता है।
आंतों के ऑर्गेनॉइड के साथ हाल ही में हुई प्रगति ने 2डी मोनोलेयर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की स्थापना के लिए तरीके भी प्रदान किए हैं, जिससे उनकी एपिकल सतह14,15,16, 17को उजागर किया गया है। ये ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर आंतों के एपिथेलियम के वीवो गुणों में कुंजी को फिर से अपडेट करते हैं। वे एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेल संरचना प्रदर्शित करते हैं, जिसमें विभेदित और स्टेम सेल आबादी दोनों होते हैं और क्रिप्ट-विल्लस अक्ष में विविधता को मॉडल करते हैं। जैसा कि एपिकोबासल ध्रुवीकरण को बनाए रखा जाता है, अंतर्निहित मोनोलेयर गुण एपिकल और बेसोलेटरल दोनों पक्षों की आसान पहुंच के लिए अनुमति देते हैं और मीडिया एक्सचेंज दीर्घकालिक संस्कृति के लिए आंतों के प्रवाह और अपशिष्ट हटाने की नकल कर सकते हैं। ये विशेषताएं चमकीले बातचीत पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों के लिए ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर को उत्तरदायी प्रदान करती हैं और एपिथेलियल बैरियर अखंडता और पारगम्यता18, 19के लिए एक बेहतर मॉडल प्रदान करती हैं।
अध्ययनों से पता चला है कि एपिथेलियल सेल पोलरिटी को एमडीकेके स्फेरॉइड20 , 21और हाल ही में मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड22 में ईसीएम प्रोटीन द्वारा कसकर विनियमित कियाजाताहै । ईसीएम घटकों को हटाने या सेल-मैट्रिक्स जंक्शनों में मध्यस्थता करने वाले इंटीग्रीन रिसेप्टर का अवरोध के परिणामस्वरूप आंतों के ऑर्गेनॉइड के ध्रुवता उत्क्रमण और एपिथेलियम के एपिकल साइड के माध्यमसे 22के संपर्क में आते हैं। इस दृष्टिकोण ने संक्रामक रोगों पर काम कर रहे शोधकर्ताओं के हित को आकर्षित किया है क्योंकि यह 3 डी में एपिकल पक्ष तक आसान पहुंच की अनुमति देता है और इसे उच्च थ्रूपुट परख के लिए उत्तरदायी बनाता है। यहां, हम अमीवा लैब22द्वारा हाल के काम के आधार पर एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो 3 डी आंतों के ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाता है जो आसानी से उनके एपिकल साइड को बेनकाब करता है। हम एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा भी तैयार करते हैं जो आंतों के ऑर्गेनॉइड से प्राप्त आंतों के 2D मोनोलेयर को कुशलतापूर्वक और पुन: उत्पन्न कर सकता है।
एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड मॉडल शक्तिशाली प्लेटफ़ॉर्म बन गए हैं जिनका उपयोग ऊतक संगठन, रोग प्रगति को मॉडल करने औरचिकित्सीय23, 28,29की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। ऑर्गेनॉइड माइक्रोइंजेक्शन ने संक्रामक रोगों के मॉडलिंग की ऑर्गेनॉइड की क्षमता में मूल्य जोड़ा है क्योंकि यह मेजबान एपिथेलियम के एपिकल साइड के साथ रोगजनक बातचीत की अनुमति देता है। माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों में हाल ही में हुई प्रगति ने ऑर्गेनॉइड में इंजेक्शन की गति को अनुकूलित किया है और प्रति घंटे 90 इंजेक्शन ऑर्गेनॉइड तक की दर हासिल की है। इंजेक्शन ऑर्गेनॉइड में बाधा कार्य को संरक्षित किया गया था, और लुमेन के अंदर कम ऑक्सीजन एकाग्रता अनिवार्य-एनारोबिक इंजेक्शन बैक्टीरिया30के अस्तित्व के लिए अनुमति दी गई थी। हालांकि, अध्ययनों ने एक ही कुएं के भीतर ऑर्गेनॉइड आबादी में विषमता की उपस्थिति को नोट किया है। ये अंतर आकार और आकार31में देखा गया , प्रमुख जीन32के अभिव्यक्ति स्तर के साथ – साथ प्रसार दर33. फोरस्कोलिन और पीजीई2, या हैजा टॉक्सिन जैसे यौगिकों के लिए एक ही ऑर्गेनॉइड आबादी के भीतर अंतर प्रतिक्रियाओं को भी28,33वर्णित किया गया है। ये परिणाम अध्ययन में उच्च ऑर्गेनॉइड नंबरों की आवश्यकता को उजागर करते हैं और ल्यूमिनल इंजेक्शन के उपयोग को सीमित करते हैं।
पारंपरिक ऑर्गेनॉइड संस्कृति हाइड्रोगेल में ऑर्गेनॉइड के एनकैप्सुलेशन और प्रचार पर आधारित है। हालांकि, हाइड्रोगेल प्रसार पर सीमाएं पैदा कर सकते हैं और एकाग्रता ढाल पेश कर सकते हैं, जो विषमता34को बढ़ा सकते हैं। इसके अलावा, उच्च परिवर्तनशीलता का दस्तावेजीकरण किया गया है, न केवल संस्कृतियों और दानदाताओं के बीच बल्कि व्यक्तिगत प्रायोगिक परिस्थितियों में भी । दाता स्रोत, हाइड्रोगेल के जैव रासायनिक गुण, और संस्कृति प्रणाली के रूप में ऑर्गेनॉइड की आंतरिक विषमता महत्वपूर्ण कारक हैं जो प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैं और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में प्राप्त परिणामों की प्रजनन क्षमता को सीमित कर सकते हैं। यहां वर्णित दोनों विधियां एपिथेलियम के एपिकल पक्ष को उजागर करने का एक सरल साधन प्रदान करती हैं, जिससे यौगिकों और ब्याज के रोगजनकों के मॉडलिंग के लिए सीधे संस्कृति माध्यम में जोड़कर अनुमति मिलती है। हाइड्रोजेल उपयोग में कमी त्रुटि के तकनीकी स्रोतों से प्रायोगिक परिवर्तनशीलता को सीमित कर सकती है।
एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड ऑर्गेनॉइड ऑर्गेनॉइड मॉडल सिस्टम की प्रमुख विशेषताओं को बनाए रखते हैं और उनकी स्केलेबिलिटी उन्हें 2डी मोनोलेयर की तुलना में उच्च थ्रूपुट असाक के लिए अधिक उत्तरदायी बनाती है। हालांकि, चूंकि ऑर्गेनॉइड अपनी 3डी संरचना को बनाए रखते हैं, बेसल पक्ष की पहुंच सीमित है और दोनों पक्षों तक पहुंच की आवश्यकता वाले अध्ययनों में एक साथ बाधा डाल सकती है।
हमने दिखा दिया है कि आंतों के ऑर्गेनॉइड का ध्रुवता उलटा ईसीएम के कुशल और पूर्ण हटाने पर निर्भर करता है, जबकि ऑर्गेनॉइड की अक्षुण्ण संरचना को भी संरक्षित करता है। ईसीएम को हटाने के लिए वियोजन समाधान का उपयोग और प्लास्टिकवेयर के ऑर्गेनॉइड के पालन को रोकने के लिए एंटी-अनुयायी समाधानदोनोंने सीओ, जेवाई और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल की समग्र दक्षता को सुधारने में योगदान दिया, विशेष रूप से डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उत्पादित एपिकल-आउट ऑर्गेनॉइड की संख्या के संबंध में।
इसके अलावा, हमने देखा कि हमारा प्रोटोकॉल 250 माइक्रोन से छोटे ऑर्गेनॉइड के अधिक कुशल विलोपन का समर्थन करता है और बड़े ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने से पिपटिंग के कारण विखंडन के कारण कम ऑर्गेनॉइड आउटपुट हो सकता है। व्यापक बोर युक्तियां, जैसे कि सामग्री की तालिकामें इंगित किए गए, बड़े ऑर्गेनॉइड के उपयोग की अनुमति दे सकते हैं। हालांकि, कम लागू यांत्रिक बल के कारण मानक युक्तियों की तुलना में ईसीएम वियोजन में चौड़े बोर युक्तियां कम प्रभावी होती हैं। इसलिए, बड़े ऑर्गेनॉइड के साथ काम करते समय पर्याप्त व्यवधान और सभी ईसीएम अवशेषों को पूरी तरह से हटाने के लिए 1.2.9-1.2.11 के कदमों को दोहराने की आवश्यकता हो सकती है।
निलंबन में ऑर्गेनॉइड कम से कम 2 सप्ताह तक जीवित रह सकते हैं। इस अवधि के बाद, हमने आकृति विज्ञान परिवर्तन और कोशिका मृत्यु की बढ़ी हुई संख्या देखी। एपिकल-आउट ऑर्गेनॉइड22 में प्रोलाइफिंग कोशिकाओं की उपस्थिति आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में एपिकल-इन की पुनः स्थापना के लिए अनुमति देती है। यह एकल कोशिकाओं के लिए एपिकल-आउट ऑर्गेनॉइड को अलग करके और उन्हें आंतों के ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम के साथ ईसीएम में एम्बेड करके प्राप्त किया जा सकता है।
निलंबन संस्कृतियों में आंतों के ऑर्गेनॉइड की स्थापना का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल में अक्सर सामना करने वाली एक सीमा बड़े समुच्चय की पीढ़ी है। यह दक्षता, रूपात्मक विशेषताओं की प्रजनन क्षमता, यौगिकों के लिए पारिम्यता और पैराक्रिन सिग्नलिंग जैसे कई चरों को प्रभावित करता है। सीओ, जेवाई और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के समान, यहां हम निलंबन में 3 दिनों के बाद कतरनी के बिना सभी निलंबित ऑर्गेनॉइड के कम से कम 97% की ध्रुवीयता उलटा प्राप्त करने की पुष्टि करते हैं। हालांकि, प्रकाशन के विपरीत, हमने बड़े समुच्चय के गठन को कम करने और उपज में वृद्धि करने के लिए एक यांत्रिक वियोजन चरण शुरू किया है। चूंकि यह प्रक्रिया ऑर्गेनॉइड के एपिथेलियम को नुकसान पहुंचा सकती है, इसलिए हमने ऑर्गेनॉइड इनक्यूबेशन अवधि को अतिरिक्त 2 दिनों के लिए बढ़ा दिया ताकि पूर्ण एपिथेलियम वसूली की अनुमति दी जा सके और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उच्च गुणवत्ता वाली संस्कृतियों को सुनिश्चित किया जा सके। एक इनक्यूबेटर शेखर या एक स्पिनर फ्लास्क के उपयोग के साथ लगातार आंदोलन की शुरूआत संभावित रूप से संलयन घटनाओं को कम कर सकती है, विखंडन को कम कर सकती है, और ऑक्सीजन में वृद्धि कर सकती है। ये वैकल्पिक दृष्टिकोण संस्कृतियों को लंबी अवधि के लिए बनाए रख सकते हैं, सेल मृत्यु को कम कर सकते हैं, और एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड के आगे भेदभाव की अनुमति दे सकते हैं।
ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न 2डी मोनोलेयर की स्थापना उल्टे ध्रुवीयता ऑर्गेनॉइड की तुलना में कई फायदे और नुकसान प्रदान करती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर संस्कृति की तेजी से स्थापना के लिए अनुमति देता है, आमतौर पर, 7 दिनों से कम समय में और संस्कृतियों के दीर्घकालिक रखरखाव का विकल्प समय की विस्तारित अवधि (10 सप्ताह तक) के लिए। प्रोटोकॉल और मीडिया यहां इस्तेमाल किया भी कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या के कुशल भेदभाव के लिए अनुमति देते हैं, हमेशा अंय ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर संस्कृतियों में नहीं पाया16। एक सेल संस्कृति डालें झिल्ली पर एक मोनोलेयर की स्थापना एपिथेलियम के दोनों एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों तक एक साथ पहुंच के लिए अनुमति देती है जिससे उन्हें बाधा अखंडता और एपिथेलियल परिवहन में अध्ययन के लिए आदर्श बना दिया जाता है। यह सरलीकृत पहुंच उन्हें संक्रमण और दवा उपचार अध्ययन के लिए अधिक उत्तरदायी भी प्रदान करती है। इसके अलावा, ये संस्कृतियां दाता के लिए अद्वितीय विशेषताओं में से कई को बनाए रखते हैं, रोगी-विशिष्ट अध्ययनों के लिए उनकी प्रासंगिकता को बनाए रखते हैं। अली संस्कृति विधि स्राव और अवशोषण कोशिका दोनों प्रकारों से बने अधिक कार्यात्मक एपिथेलियम के भेदभाव की सुविधा भी प्रदान करती है, जिससे यह मानव आंतों के एपिथेलियम का अधिक प्रतिनिधि बन जाता है। इन संस्कृतियों की सापेक्ष स्थिरता भी उन्हें लंबे समय तक बनाए रखने की अनुमति देती है, जो दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए संभावना प्रदान करती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की सीमाएं एक कन्फ्लूंट मोनोलेयर स्थापित करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की उच्च संख्या हैं और एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों के बीच एक कार्यात्मक अलगाव के लिए पूर्ण उदारता बनाए रखने की आवश्यकता है। विशेषता तहखाना वास्तुकला, जिसे 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में मॉडलिंग किया जा सकता है, मोनोलेयर संस्कृति स्थापित करने पर भी खो जाता है। फिर भी, संस्कृति का प्रयोगात्मक अनुकूल प्रारूप और जिस सहजता पर एपिथेलियम के एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों तक पहुंचा जा सकता है, इसे आंतों के शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को क्षितिज 2020 अनुदान ऑर्गेनोवीर 812673 द्वारा वायरस अनुसंधान के लिए परियोजना ऑर्गेनॉइड – एक अभिनव प्रशिक्षण-आईटीएन कार्यक्रम पर वित्त पोषित किया गया था।
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |