Her presenterer vi to protokoller som tillater modellering av intestinale apikale spesifikke interaksjoner. Organoid-avledede intestinale monolayers og Air-Liquid Interface (ALI) kulturer letter genereringen av godt differensiert epithelia tilgjengelig fra både lysende og basolaterale sider, mens polaritet-inverterte intestinale organoider utsetter sin apikale side og er mottagelige for høy gjennomstrømningsanalyser.
Foringen av tarmepitelet består av et enkelt lag med spesialiserte epitelceller som utsetter deres apikale side for lumen og reagerer på eksterne signaler. Nylig optimalisering av in vitro-kulturforhold gjør det mulig å gjenskape tarmstammecellenisjen og utviklingen av avanserte 3-dimensjonale (3D) kultursystemer som rekapitulerer cellesammensetningen og organiseringen av epitelet. Intestinale organoider innebygd i en ekstracellulær matrise (ECM) kan opprettholdes for langsiktig og selvorganisert for å generere et veldefinert, polarisert epitel som omfatter en intern lumen og en ekstern eksponert basal side. Denne restriktive naturen til tarmorganoidene gir utfordringer med å få tilgang til epitelintroens apikale overflate og begrenser undersøkelsen av biologiske mekanismer som næringsopptak og vertsmikrobiota / vertspatogeninteraksjoner. Her beskriver vi to metoder som letter tilgangen til den apikale siden av det organoide epitelet og støtter differensiering av spesifikke tarmcelletyper. Først viser vi hvordan ECM-fjerning induserer en inversjon av epitelcellepolariteten og tillater generering av apikale 3D-organoider. For det andre beskriver vi hvordan man genererer 2-dimensjonale (2D) monolayers fra encellede suspensjoner avledet fra intestinale organoider, bestående av modne og differensierte celletyper. Disse teknikkene gir nye verktøy for å studere apikale spesifikke interaksjoner av epitelet med eksterne signaler in vitro og fremme bruk av organoider som plattform for å lette presisjonsmedisin.
Intestinal epitel er det nest største epitelet i menneskekroppen og består av et polarisert cellelag som letter næringsopptaket og fungerer som en barriere mot miljømessige fornærmelser1. Dette skillet mellom de apikale og basolaterale sidene gjør at epitelets celler kan utføre sine forskjellige funksjoner. Det apikale rommet er utsatt for lumen og formidler epitelinteraksjonene med miljøstimuli og mikroorganismer, samtidig som det letter næringsopptaket. Den basolaterale overflaten huser intercellulære veikryss og cellematriseadhesjoner, mens de interfacing med celler i immunsystemet og andre vev2. Disse kryssene genererer en ugjennomtrengelig monolayer festet til kjellermembranen, som fungerer som en barriere og leverer de absorberte næringsstoffene til det omkringliggende kroppsvevet.
Etableringen av kultursystemer som er i stand til å rekapitulere disse tarmfunksjonene in vitro har vært utfordrende3. Konvensjonelle in vitro-modeller bruker transformerte cellelinjer for humant kolorektal kreft, for eksempel Caco-2, for å generere 2D-monolayerkulturer. Til tross for å være i stand til å modellere flere funksjoner i det absorptive rommet, kan disse modellene ikke fullt ut rekapitulere tarmepitelets sammensetning og funksjon, noe som begrenser viktige funksjonelle egenskaper og applikasjoner4,5.
Fremveksten av organoider som et avansert 3D-kultursystem generert fra stamceller som selv kan organisere og skille seg fra organspesifikke celletyper, var et gjennombrudd i in vitro-studien av tarmepitelet6. Intestinale organoider er innebygd i en ekstracellulær matrise (ECM) som ligner basal lamina og danner cellematrisekryss som gjør at disse kulturene kan beholde epitelets apikobasale polaritet. Organoider viser en lukket arkitektur der den apikale siden blir utsatt for lyskammeret, og dermed etterligner tarmens struktur. Selv om denne lukkede organisasjonen tilbyr muligheten til å studere orienteringsspesifikke funksjoner, begrenser den undersøkelser som krever tilgang til den apikale siden av epitelet. Ulike tilnærminger har blitt tatt for å overvinne disse begrensningene i både 2D og 3D, inkludert organoid fragmentering, organoid mikroinjeksjon og generering av monolayerkulturer7. Organoid fragmentering forårsaker tap av strukturorganisasjonen og ødeleggelse av cellekryss, noe som gjør det mulig å eksponeringen av epitelets apikale overflate til mediet. Denne teknikken drar nytte av fragmentenes regenerative kapasitet til å reformere organoider når de frøes til en ekstracellulær matrise og har blitt brukt til å modellere smittsomme sykdommer og vertspatogeninteraksjoner8,9. Samtidig tilgang til både den apikale og basale overflaten kan imidlertid også fremkalle ikke-spesifikke reaksjoner på infeksjon.
En alternativ tilnærming som gir tilgang til den apikale overflaten og bevarer både strukturarkitekturen og cellekryssene, er representert av mikroinjeksjon av faktorer i organoidenes lumen. Denne metoden har blitt mye brukt til å studere vert-patogen interaksjoner og modellere effekten av Cryptosporidium10, H. pylori11, og C. difficile12 på gastrointestinal epitel in vitro. Ved hjelp av lignende teknikker ble det mutagene potensialet til pks+ stamme av E. coli på intestinal epitel bestemt13. Selv om det er effektivt, er organoid mikroinjeksjon en arbeidskrevende og ineffektiv oppgave med tanke på det høye antallet organoider som må injiseres for å oppnå målbare effekter og begrenser derfor anvendelsen for analyser med høy gjennomstrømning.
Nylige fremskritt med intestinale organoider har også gitt metoder for etablering av 2D monolayer organoidkulturer, og dermed utsette deres apikale overflate14,15,16,17. Disse organoid-avledede monolayers recapitulate nøkkel in vivo egenskaper av intestinal epitel. De viser en fysiologisk relevant cellesammensetning, som inneholder både differensierte og stamcellepopulasjoner og modellerer mangfoldet på tvers av krypt-villusaksen. Etter hvert som apicobasal polaritet beholdes, gir de iboende monolayeregenskapene enkel tilgang til både de apikale og basolaterale sidene, og medieutvekslinger kan etterligne tarmstrøm og avfallsfjerning som muliggjør langsiktig kultur. Disse funksjonene gjør organoid-avledede monolayers egnet for studier som fokuserer på lysende interaksjoner og gir en overlegen modell for epitelial barriereintegritet og permeabilitet18,19.
Studier har vist at epitelcellepolaritet er tett regulert av ECM-proteiner i MDCK-sfæroider20,21 og nylig i humane tarmorganoider22. Fjerning av ECM-komponenter eller hemming av den integrinske reseptoren som formidler cellematrisekryssene resulterer i en polaritets reversering av intestinale organoider og eksponering av den apikale siden av epitelet til medium22. Denne tilnærmingen har tiltrukket seg interessen til forskere som jobber med smittsomme sykdommer, da den gir enkel tilgang til den apikale siden i 3D og gjør den mottagelig for høye gjennomstrømningsanalyser. Her beskriver vi en modifisert protokoll basert på det nylige arbeidet fra Amieva lab22, som letter genereringen av 3D intestinale organoider som lett utsetter deres apikale side. Vi skisserer også en protokoll som effektivt og reproduserer intestinale 2D-monolayre avledet fra tarmorganoider.
Epiteliale organoidmodeller har blitt kraftige plattformer som kan brukes til å modellere vevsorganisasjon, sykdomsprogresjon og identifisere terapeutiskestoffer 23,28,29. Organoid mikroinjeksjon har tilført verdi til organoidenes evne til å modellere smittsomme sykdommer, da det tillater patogeninteraksjon med den apikale siden av vertsepitelet. Nylige fremskritt innen mikroinjeksjonsteknikker har optimalisert injeksjonshastigheten i organoider og har oppnådd en hastighet på opptil 90 injiserte organoider per time. Barrierefunksjonen i injiserte organoider ble bevart, og den lave oksygenkonsentrasjonen inne i lumen tillot overlevelse av obligatoriske anaerobe injiserte bakterier30. Studier har imidlertid notert tilstedeværelsen av heterogenitet i organoidpopulasjoner i samme brønn. Disse forskjellene ble observert i størrelse og form31, uttrykksnivåer av nøkkelgener32, samt spredningshastigheter33. Differensialresponser i samme organoidpopulasjon til forbindelser som forskolin og PGE2, eller til koleratoksin, har også blitt beskrevet28,33. Disse resultatene fremhever behovet for høye organoidtall i studier og begrenser bruken av lysinjeksjon.
Konvensjonell organoidkultur er basert på innkapsling og forplantning av organoider i en hydrogel. Hydrogeler kan imidlertid utgjøre begrensninger på diffusjon og introdusere konsentrasjonsgradienter, noe som kan øke heterogeniteten34. Videre er det dokumentert høy variasjon, ikke bare mellom kulturer og givere, men også innenfor individuelle eksperimentelle forhold. Donorkilde, biokjemiske egenskaper til hydrogelen og organoidens iboende heterogenitet som kultursystem er viktige faktorer som kan øke eksperimentell variasjon og begrense reproduserbarheten av resultater oppnådd i nedstrømsapplikasjoner. Begge metodene beskrevet her gir et enkelt middel til å utsette den apikale siden av epitelet, noe som muliggjør modellering av forbindelser og patogener av interesse ved å direkte legge dem til kulturmediet. Reduksjonen i hydrogelutnyttelsen kan begrense eksperimentell variasjon fra tekniske feilkilder.
De apikale tarmorganoidene beholder nøkkelegenskapene til det organoide modellsystemet, og deres skalerbarhet gjør dem mer mottagelige for analyser med høy gjennomstrømning, sammenlignet med 2D-monolayeren. Men ettersom organoidene beholder sin 3D-struktur, er tilgjengeligheten av basalsiden begrenset og kan hindre studier som krever tilgang til begge sider samtidig.
Vi har vist at polaritetsinversjon av intestinale organoider er avhengig av effektiv og absolutt fjerning av ECM, samtidig som den intakte strukturen til organoidene bevares. Både bruken av dissosiasjonsløsningen for å fjerne ECM og den antitilknyttede løsningen for å forhindre organoider overholdelse av plasttøyet bidro til å forbedre den generelle effektiviteten til protokollen publisert av Co, J. Y. og kolleger22, spesielt med hensyn til antall apical-out organoider produsert for nedstrøms applikasjoner.
Videre observerte vi at vår protokoll støtter mer effektiv inversjon av organoider mindre enn 250 μm og bruk av større organoider kan resultere i redusert organoid utgang, på grunn av fragmentering forårsaket av pipettering. Brede tips, for eksempel de som er angitt i materialtabellen, kan tillate utnyttelse av større organoider. Imidlertid er brede spisser mindre effektive i ECM-dissosiasjon sammenlignet med standardtips på grunn av den lavere påførte mekaniske kraften. Gjentakende trinn 1.2.9-1.2.11 kan derfor være nødvendig for tilstrekkelig forstyrrelse og fullstendig fjerning av alle ECM-rester når du arbeider med større organoider.
Organoider i suspensjon kan overleve i minst 2 uker. Etter denne perioden observerte vi morfologiendringer og et økt antall celledød. Tilstedeværelsen av prolifererende celler i de apikale organoidene22 gjør det mulig å reetablere apikale tarmorganoidkulturer. Dette kan oppnås ved å dissosiere apikale organoider til enkeltceller og legge dem inn i ECM med intestinal organoid ekspansjonsmedium.
En begrensning som ofte oppstår i protokoller som beskriver etableringen av tarmorganoider i suspensjonskulturer, er genereringen av store aggregater. Dette påvirker flere variabler som effektivitet, reproduserbarhet av morfologiske egenskaper, permeabilitet til forbindelser og parakrinesignalering. I likhet med protokollen publisert av Co, J. Y. og kolleger, bekrefter vi her å ha oppnådd polaritetsinversjon av minst 97% av alle suspenderte organoider uten å skjære etter 3 dager i suspensjon. Men i motsetning til publikasjonen har vi innført et mekanisk dissosiasjonstrinn for å redusere dannelsen av store aggregater og øke utbyttet. Siden denne prosedyren kan skade epitelet til organoidene, utvidet vi organoidene inkubasjonsperioden i ytterligere 2 dager for å tillate fullstendig epitelgjenoppretting og sikre kulturer av høy kvalitet for nedstrøms applikasjoner. Innføringen av konstant agitasjon ved bruk av en inkubator shaker eller en spinnerflaske kan potensielt redusere fusjonshendelser, minimere fragmentering og øke oksygenering. Disse alternative tilnærmingene kan opprettholde kulturene i lengre varigheter, redusere celledød og tillate ytterligere differensiering av de apikale tarmorganoidene.
Etableringen av en organoid-avledet 2D-monolayer gir flere fordeler og ulemper sammenlignet med de inverterte polaritetsorganoidene. Protokollen beskrevet her tillater rask etablering av en sammenfallende monolayerkultur, vanligvis på mindre enn 7 dager og muligheten for langsiktig vedlikehold av kulturene i en lengre periode (opptil 10 uker). Protokollen og mediene som brukes her, tillater også effektiv differensiering av betydelig antall celler, ikke alltid funnet i andre organoid-avledede monolayerkulturer16. Etablering av en monolayer på en cellekulturinnsatsmembran gir samtidig tilgang til både de apikale og basolaterale sidene av epitelet, noe som gjør dem ideelle for studier i barriereintegritet og epiteltransport. Denne forenklede tilgangen gjør dem også mer mottagelige for studier av infeksjon og narkotikabehandling. Videre opprettholder disse kulturene mange av egenskapene som er unike for giveren, og opprettholder deres relevans for pasientspesifikke studier. ALI-kulturmetoden letter også differensiering av et mer funksjonelt epitel sammensatt av både sekretoriske og absorptive celletyper, noe som gjør det mer representativt for det menneskelige intestinale epitelet. Den relative stabiliteten til disse kulturene gjør det også mulig for dem å opprettholdes i en lengre periode, noe som gir mulighet for langsiktige studier. Imidlertid er begrensninger i denne tilnærmingen det høye antallet celler som kreves for å etablere en samtidig monolayer og behovet for å opprettholde fullstendig samløp for å ha en funksjonell separasjon mellom de apikale og basolaterale kamrene. Den karakteristiske kryptarkitekturen, som kan modelleres i 3D-organoidkulturene, går også tapt ved etablering av en monolayerkultur. Likevel, det eksperimentelt vennlige formatet til kulturen og hvor enkelt de apikale og basolaterale sidene av epitelet kan nås, gjør det til et kraftig verktøy for studiet av tarmfysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av Horisont 2020-stipendet OrganoVIR 812673 på prosjektet Organoids for Virus Research – Et innovativt opplærings-ITN-program.
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |