Summary
Här presenterar vi två protokoll som tillåter modellering av intestinala apical-specifika interaktioner. Organoid-härledda intestinala monolayers och Luft-Flytande Gränssnitt (ALI) kulturer underlättar generering av väl-differentierade epitel tillgänglig från både luminal och basolateral sidor, medan polaritet-inverterade intestinala organoider exponerar sin apatiska sida och är mottagliga för hög genomströmning analyser.
Abstract
Fodret i tarmepiteelet består av ett enkelt lager av specialiserade epitelceller som exponerar sin apatiska sida för lumen och svarar på externa signaler. Ny optimering av in vitro-odlingsförhållanden möjliggör återskapning av tarmstamcellsnisch och utveckling av avancerade 3-dimensionella (3D) kultursystem som rekapitulerar cellsammansättningen och epitelorganisationen. Intestinala organoider inbäddade i en extracellulär matris (ECM) kan bibehållas för långsiktig och självorganisering för att generera ett väldefinierat, polariserat epitel som omfattar en inre lumen och en extern exponerad basal sida. Denna restriktiva karaktär av intestinala organoider innebär utmaningar i att komma åt den apatiska ytan av epitel in vitro och begränsar undersökningen av biologiska mekanismer såsom näringsupptag och värd-mikrobiota/värd-patogen interaktioner. Här beskriver vi två metoder som underlättar tillgången till den apatiska sidan av det organoida epitelet och stöder differentiering av specifika tarmcellstyper. Först visar vi hur ECM-avlägsnande inducerar en inversion av epitelcellspolariteten och möjliggör generering av adicala 3D-organoider. För det andra beskriver vi hur man genererar 2-dimensionella (2D) monoskikt från encelliga suspensioner som härrör från intestinala organoider, bestående av mogna och differentierade celltyper. Dessa tekniker ger nya verktyg för att studera apical-specifika interaktioner av epitel med externa ledtrådar in vitro och främja användningen av organoider som en plattform för att underlätta precisionsmedicin.
Introduction
Intestinal epitel är det näst största epitelet i människokroppen och består av ett polariserat cellskikt som underlättar näringsupptag och fungerar som en barriär mot miljöförolämpningar1. Denna skillnad mellan de atiska och basolateral sidorna tillåter celler i epitel att utföra sina olika funktioner. Det apikala facket utsätts för lumen och förmedlar epitelinteraktionerna med miljöstimulanser och mikroorganismer, samtidigt som näringsupptaget underlättas. Den basolateral ytan rymmer intercellulära korsningar och cellmatris vidhäftningar, medan interfacing med celler i immunsystemet och andravävnader 2. Dessa korsningar genererar ett ogenomträngligt monoskikt fäst vid källarmembranet, som fungerar som en barriär och levererar de absorberade näringsämnena till den omgivande kroppsvävnaden.
Upprättandet av kultursystem som kan rekapitulera dessa tarmfunktioner in vitro har varit utmanande3. Konventionella in vitro-modeller använder transformerade mänskliga kolorektalcancer cellinjer, såsom Caco-2, för att generera 2D monolayer kulturer. Trots att dessa modeller kan modellera flera funktioner i absorptiva facket kan de inte helt rekapitulera tarmepitelatoriets sammansättning och funktion, vilket begränsar viktiga funktionella egenskaper ochapplikationer 4,5.
Framväxten av organoider som ett avancerat 3D-odlingssystem som genereras från stamceller som kan självorganisering och differentiera till organspecifika celltyper, var ett genombrott i in vitro-studien av intestinal epitel6. Intestinala organoider är inbäddade i en extracellulär matris (ECM) som liknar basal lamina och bildar cellmatriskorsningar som gör att dessa kulturer kan behålla epitelets apikobasala polaritet. Organoider uppvisar en sluten arkitektur där den apatiska sidan utsätts för luminalfacket, vilket efterliknar tarmens struktur. Även om denna slutna organisation erbjuder möjlighet att studera orienteringsspecifika funktioner, begränsar den undersökningar som kräver tillgång till den apatiska sidan av epitelet. Olika metoder har vidtagits för att övervinna dessa begränsningar i både 2D och 3D, inklusive organoid fragmentering, organoid mikroinjektion och generering av monolayer kulturer7. Organoid fragmentering orsakar förlusten av den strukturella organisationen och förstörelsen av cellkorsningar, vilket gör det möjligt att exponera epitelets apatiska yta för mediet. Denna teknik drar nytta av fragmentens regenerativa kapacitet att reformera organoider när de sås till en extracellulär matris och har använts för att modellera infektionssjukdomar och värdpatogeninteraktioner8,9. Samtidig tillgång till både den atiska och basala ytan kan dock också framkalla icke-specifika svar på infektion.
Ett alternativt tillvägagångssätt som ger tillgång till den apatiska ytan och bevarar både den strukturella arkitekturen och cellkorsningarna representeras av mikroinjektion av faktorer i organoidens lumen. Denna metod har använts i stor utsträckning för att studera värdpatogena interaktioner och modellera effekterna av Cryptosporidium10, H. pylori11, och C. difficile12 på mag epitel in vitro. Med liknande tekniker fastställdes den mutagena potentialen hos pks+ stam av E. coli på intestinala epitel13. Även om det är effektivt, är organoid mikroinjektion en mödosam och ineffektiv uppgift med tanke på det stora antalet organoider som behövs injiceras för att erhålla mätbara effekter och begränsar därför dess tillämpning för hög genomströmningsanalyser.
De senaste framstegen med tarmorganoider har också gett metoder för etablering av 2D monolayer organoidkulturer, vilket exponerar deras apatiska yta14,15,16,17. Dessa organoid-härledda monolayers rekapitulera viktiga in vivo egenskaper i intestinala epitel. De uppvisar en fysiologiskt relevant cellsammansättning, som innehåller både differentierade populationer och stamcellspopulationer och modellerar mångfalden över krypt-villusaxeln. Eftersom apicobasal polaritet behålls, tillåter de inneboende monolayeregenskaperna enkel åtkomst av både de apatiska och basolaterala sidorna och medieutbyten kan efterlikna tarmflöde och avfallshantering som möjliggör långsiktig kultur. Dessa funktioner gör organoid-härledda monolayers mottagliga för studier med fokus på luminal interaktioner och ger en överlägsen modell för epitelial barriär integritet ochpermeabilitet 18,19.
Studier har visat att epitelcellspolaritet regleras tätt av ECM-proteiner i MDCK-sfäroider20,21 och nyligen i mänskliga tarmorganoider22. Avlägsnande av ECM-komponenter eller hämning av integrinreceptorn som förmedlar cellmatriskorsningarna resulterar i en polaritetsåterföring av tarmorganoider och exponering av epitelets apatiska sida till mediet22. Detta tillvägagångssätt har lockat intresset hos forskare som arbetar med infektionssjukdomar eftersom det ger enkel tillgång till den apatiska sidan i 3D och gör det mottagligt för höga genomströmningsanalyser. Här beskriver vi ett modifierat protokoll baserat på det senaste arbetet av Amieva lab22, som underlättar genereringen av 3D-tarmorganoider som lätt exponerar sin apatiska sida. Vi beskriver också ett protokoll som effektivt och reproducerbart kan generera intestinala 2D monoskikt som härrör från intestinala organoider.
Protocol
Härledning av mänskliga intestinala organoid kulturer utfördes som beskrivs någon annanstans23. Organoider bibehölls i kultur enligt beskrivningen i produktinformationsbladet (PIS) för intestinala organoidexpansionsmediet (se materialförteckningen).
1. Inversion av intestinal organoid polaritet
OBS: Det här avsnittet beskriver protokollet för att invertera polariteten hos 3D-tarmorganoider. Detta protokoll ger ett detaljerat förfarande för etablering av polariserade organoider med en exponerad apatisk yta i suspension i en odlingsplatta. Detta protokoll är avsett som en slutpunktsanalys, även om organoiderna kan bibehållas i denna konformation i över 2 veckor och upprätthålla en liten stamcellspopulation som gör det möjligt för dem att återupprätta aska-in organoider vid passage.
- Beläggningskulturartiklar och rör med anti-vidhäftande lösning
OBS: För att maximera antalet apakala tarmorganoider och förhindra oönskad fastsättning i odlingsartiklarna krävs i allmänhet förbeläggning av odlingsartiklar. Avsnittet nedan beskriver beläggningen av kultur och plastartiklar med anti-vidhäftande lösning.- Täck odlingsplattor som ska användas i fjädringsdelen av protokollet enligt följande.
- Tillsätt 0,5 ml anti-vidhäftande lösning till varje brunn på en 24-brunns vävnadskulturplatta.
- Snurra plattan för att sprida lösningen jämnt över ytan och brunnarna.
- Centrifugera plattan på 1 300 x g i 10 min.
- Ta bort den anti-vidhäftande lösningen från varje brunn med en aspirator eller en 1 ml pipett.
- Tvätta brunnarna med 1 ml DMEM/F-12 med 15mM HEPES (DMEM/F12).
- Fyll varje tvättad brunn med 0,5 ml DMEM/F-12 och förvara plattan vid 37 °C och 5 % CO2 tills den används.
OBS: Om de inte används omedelbart kan de belagda plattorna förvaras i inkubatorn i minst 1 vecka.
- Täck 15 ml koniska rör som används i detta protokoll enligt följande.
- Tillsätt 4 ml anti-vidhäftande lösning till det koniska röret på 15 ml.
- Snurra röret för att sprida lösningen jämnt över väggarnas yta.
- Centrifugera röret vid 1 300 x g i 10 min.
- Ta bort den anti-vidhäftande lösningen från röret.
- Tvätta röret 1x med 5 ml DMEM/F-12 och aspirera DMEM/F-12. Rören är nu klara för användning.
OBS: Om den inte används omedelbart, tillsätt 5 ml DMEM/F12 och förvara den vid 4 °C. Belagda rör kan hållas vid 4 °C i minst en vecka.
- Täck odlingsplattor som ska användas i fjädringsdelen av protokollet enligt följande.
- Polaritet inversion av tarmorganoider genom suspension kultur
OBS: Stegen nedan beskriver inversion av tarmorganoider som tidigare odlats under vanliga ECM-kupolförhållanden. De procedurer som beskrivs här är för en brunn av en 24-brunnsplatta. Om du använder andra kulturprogram justerar du volymerna i enlighet med detta.- Ta försiktigt bort och kassera mediet från varje brunn som innehåller organoider utan att störa källarmembranets extracellulära matriskupol. Se till att storleken på organoiderna är 150-250 μm diameter (vanligtvis dag 3-5) innan inversionsprotokollet påbörjas.
- Tillsätt 1 ml iskall dissociationslösning i varje brunn.
- Inkubera i rumstemperatur (15-25 °C) i 1 min.
- Tillsätt minst 2 ml anti-vidhäftande lösning till ett 15 ml-rör som ska användas för beläggning av plastspetsar.
- Tillsätt minst 2 ml DMEM/F-12 till ett 15 ml-rör som ska användas för tvätt av plastspetsar som sköljts med anti-vidhäftande lösning.
- Täck en 1 ml pipettspets med anti-vidhäftande lösning, pipettera 1 ml lösning tre gånger in i röret med anti-vidhäftande lösning från steg 1.2.4.
- Tvätta spetsen i kall DMEM/F-12, rör 1 ml lösning tre gånger in i röret med DMEM/F-12 från steg 1.2.5.
- Använd den belagda spetsen och lossa försiktigt kupolerna genom att röra långsamt. Var försiktig så att du inte stör eller fragmentera organoiderna.
- Överför den organoida suspensionen till en platta som behandlats med anti-vidhäftande lösning (från steg 1.1.1).
- Placera plattan på en skakapparat vid 4 °C i 30 min. En gyro shaker kan användas vid 70 varv/min.
OBS: Undvik hårda skakningar, såsom virvel av provet, eftersom det kan leda till organoid fragmentering. Bildandet av bubblor och skum kan indikera hårda skakningar. - Efter 30 min, ta bort plattan. Använd en 1 ml pipettspets belagd med anti-vidhäftande lösning, varsamt pipett lösningen upp och ner.
- Placera plattan på en skakapparat vid 4 °C i 15 min. En gyro shaker kan användas vid 70 varv/min.
- Ta bort plattan och låt organoiderna sätta sig genom gravitation (1-2 min vid rumstemperatur). Observera plattan under mikroskopet för att verifiera organoid sedimentering.
OBS: Undvik omfattande agitation av plattan eftersom det kan orsaka att sedimenterade organoider återanvänds. - När organoiderna har lagt sig, ta bort så mycket av dissociationslösningen som möjligt och tvätta genom att tillsätta 1,5 ml DMEM/F-12.
- Låt organoiderna sedimentera och ta bort så mycket av supernatanten som möjligt. Upprepa tvättsteget en gång till.
OBS: Observera plattan under mikroskopet för att verifiera organoid sedimentering innan du utför något tvättsteg. - Ta bort så mycket av DMEM/F-12 som möjligt och tillsätt 0,5 ml intestinalt organoidexpansionsmedium. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2.
- På följande dag, utför en partiell medium förändring genom att luta plattan i en 25- till 30-graders vinkel och ta bort medium längs brunnens vägg. Ta bort 0,4 ml medium och var försiktig så att du inte tar bort upphängda organoider.
- Tillsätt 0,4 ml tarmorganoidexpansionsmedium. Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 i 3 dagar.
OBS: Efter 3 dagar bör de flesta organoider ha en apatisk polaritet, men stora aggregat kan ha bildats. - Om aggregat har bildats, använd en 1 ml pipett med en spets belagd med anti-vidhäftande lösning (enligt beskrivningen i steg 1.2.6 och 1.2.7) för att kapa aggregaten genom att leda upp och ner 20 gånger samtidigt som spetsens ände trycks in i botten av plattan.
- Placera plattan vid 37 °C och 5 % CO2 och utför en fullständig mediumförändring nästa dag med intestinalt organoidexpansionsmedium (enligt beskrivningen i avsnitt 1.2.17).
- Efter 2 dagar (dag 5 i suspension) kan aprotiska tarmorganoider användas i nedströms analyser.
2. Etablering av intestinala cell 2D-monoskikt och ALI-kulturer (Air-Liquid Interface) som härrör från 3D-tarmorganoider
OBS: Det här avsnittet beskriver protokollet för att generera 2D monolayer kulturer från intestinala organoider. Denna teknik ger fördelen av att etablera en konfluent, polariserad monolayer kultur med en exponerad apatisk yta i en vävnad kultur platta som innehåller cell kultur membran infoga. Även om monoskiktet börjar differentiera i det nedsänkta monoskiktsformatet, kan ytterligare differentiering av monoskiktet uppnås genom att byta till en ALI-kultur efter att den har nått sammanflöde. Både monoskiktet och efterföljande ALI-protokoll är avsedda som slutpunktsanalyser och även om monoskiktskulturen upprätthåller en liten stamcellspopulation kan ingen av dem effektivt delas och passages efter att den har fastställts.
- Förbereda media och tallrikar för intestinal monolayerkultur
- Förbered intestinala organoid differentieringsmedium enligt tillverkarens lydelse för monoskiktskultur (se Materialförteckning). Tillsätt endast Y-27632 till en volym medium som kommer att användas inom 1 vecka vid en slutlig koncentration på 10 μM. Förvara den vid 4 °C om den inte används omedelbart.
- Förvärmd Trypsin EDTA (0,05%) till 37 °C.
- Minst 2 timmar före sådd av monoskiktskulturer, förbered en 2% ECM-beläggningslösning enligt följande.
- Tina ECM på is och tillsätt 1:50 till kall, steril PBS för att förbereda en 2% lösning. Förbered tillräckligt med mängder för att tillsätta 100 μL till den övre brunnen på varje 6,5 mm (0,33 cm2)cellkulturmembraninsats som ska användas. Justera volymen på lämpligt sätt för större eller mindre kulturer.
- Tillsätt 100 μL till varje brunn och inkubera varje platta vid 37 °C och 5 % CO2 tills det behövs (minst 2 timmar före sådd).
- Dissociating intestinala organoider för monolayer generation och kultur
- Ta bort ett lämpligt antal organoida odlingsbrunnar från inkubatorn. Se tabell 1 för det rekommenderade antalet brunnar att skörda för olika odlingsvaror.
- Aspirera alla medier från organoidkulturerna utan att störa ECM-kupolen.
- Tillsätt 1 ml dissociationslösning till varje brunn.
- Inkubera i rumstemperatur (15-25 °C) i minst 1 min.
- Använd en 1 ml pipett, rörett upp och ner för att störa kupolen och släppa ut organoiderna.
- Slå samman de upphängda organoiderna från varje brunn i ett koniskt rör på 15 ml. Inkubera i rumstemperatur i 10 min med mild agitation eller gungning. Organoider för sådd av flera brunnar kan poolas i detta steg, upp till 10 ml volym i varje rör.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort och kassera supernaten. Tillsätt 5 ml iskallt DMEM/F-12 för att återanvända organoider.
- Blanda och centrifug igen vid 200 x g i 5 min vid 4 °C.
- Aspirera supernaten, ta bort så mycket som möjligt, var försiktig så att du inte stör pelleten.
OBS: Vissa kvarvarande ECM kan finnas kvar i pelleten; Detta bör dock inte i någon större grad påverka dissociationen av organoiderna. - Tillsätt 1 ml förvärmda (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05%) till återanvända organoider. Blanda noggrant för att säkerställa en jämn suspension. Lägg till ytterligare 1 ml Trypsin-EDTA för ett stort antal celler, eller om en betydande mängd ECM återstår.
- Inkubera vid 37 °C i 5-10 min.
- Blanda noggrant med en 1 ml pipett för att störa organoiderna så mycket som möjligt. Organoider bör vara helt dissocierade i enstaka celler eller små fragment. Om större fragment eller hela organoider kvarstår efter noggrann pipetting, fortsätt inkubationen med Trypsin-EDTA vid 37 °C i ytterligare 3-5 min.
OBS: Inkubera inte med Trypsin-EDTA i mer än 20 minuter, eftersom detta kan leda till en ökad förlust av cellens livskraft. - När organoiderna är tillräckligt dissocierade, tillsätt en lika stor volym DMEM/F-12 (t.ex. 1 ml DMEM/F-12 per ml Trypsin-EDTA) och pipett upp och ner för att blandas noggrant. Inaktivera Trypsin-EDTA genom att lägga till 10% FBS till DMEM/F-12 i det här steget.
- Centrifugfragment vid 200 x g i 5 min vid 2-8 °C.
- Om de dissocierade organoiderna misslyckas med pellet är detta vanligt och kan bero på en ackumulering av slem som frigörs av de dissocierade cellerna. Blanda i så fall cellerna noggrant genom att leda upp och ner och centrifugera dem igen vid 200 x g i 5 min vid 2-8 °C.
- Ta försiktigt bort så mycket supernatant som möjligt och lämna bara cellpelleten.
- Återanvänd cellerna i 100 μL intestinalt organoid differentieringsmedium (med 10 μM Y-27632) för varje brunn som ska sås. Justera volymen på lämpligt sätt för större eller mindre brunnsstorlekar.
- Ta bort de belagda plattorna från inkubatorn (beredd i steg 3.1.4) och ta bort överskottet ecm från varje brunn.
- Tillsätt 100 μL av cellupphängningen till den övre brunnen i varje cellkulturinlägg.
- Tillsätt 500 μL tarmorganoid differentieringsmedium till den nedre brunnen i varje cellkulturinsättning.
- Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2.
- Byt ut mediet i både de övre och nedre brunnarna varannan till var tredje dag. Monolayer kulturer bör nå confluency inom 7 dagar och kommer ofta att nå confluency inom 2-3 dagar.
- Etablera en ALI-kultur (Air-Liquid Interface)
OBS: Om så önskas kan ytterligare differentiering av en nedsänkt intestinal monolayerkultur åstadkommas genom att överföra den nedsänkta monolayerkulturen till en ALI-kultur. Denna odlingsmetod kommer att möjliggöra en ökning av antalet differentierade celltyper, särskilt celler i den hemlighetsfulla härstamningen, såsom bägare och enteroendokrina celler.- Upprätta en monolayerkultur i ett cellkulturinfogning enligt beskrivningen ovan i steg 2.2.1-2.2.23 och behåll denna kultur vid 100% sammanflöde i minst 4 dagar.
- För att upprätta en ALI-kultur, ta bort medium från de övre och nedre brunnarna. Tillsätt färskt tarmorganoid differentieringsmedium (med Y-27632) till den nedre brunnen, vilket lämnar den övre brunnen tom.
- Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2.
- Byt ut mediet i den nedre brunnen var 2-3 dagar och låt monoskiktet differentiera i minst 1 vecka.
- Skölj den övre brunnen med steril PBS för att vid behov avlägsna överskott av slem.
Under dessa förhållanden kan ALI-kulturen upprätthållas i minst 2-3 veckor.
Representative Results
Organoider genererades från biopsiprover enligt det protokoll sombeskrivits tidigare 23 och i PIS för intestinala organoidexpansionsmedium (se materialförteckningen). Figur 1A, Vänster panel, visar fenotypen av tarmorganoiderna odlade i en kupol med intestinalt organoidexpansionsmedium. Under dessa odlingsförhållanden uppvisar organoider en cystisk morfologi definierad av ett tunt (10-25 μm) epitel som omsluter en lumen(figur 1A, höger panel). I detta skede står den apatiska sidan av tarmepiteelet inför lumen, medan den basolaterala sidan kontaktar den omgivande extracellulära matrisen. När majoriteten av organoiderna nådde önskad storlek avlägsnades den extracellulära matrisen och organoiderna odlades sedan i suspension. Förlusten av cellulär bindning till den extracellulära matrisen utlöser en inversionsprocess i organoiderna, vilket resulterar i en återföring av polariteten hos det organoida epitelet, utsätter den apatiska sidan av epitelet för tillväxtmediet och internaliserar den basolaterala sidan.
I vissa kulturer aggregeras och smälter organoider in, en effekt som är djupare under de första 3 dagarna (Figur 1B, Vänster panel). Tillämpning av en savteknik möjliggör avskildhet av organoiderna och fortsättning av kulturerna i dagar med minimal omarvning(figur 1B,höger panel).
Tarmorganoider odlade i ECM-kupoler fortsätter att expandera (Figur 1C, vänster panel) och uppvisar spontan bildning av sekundära spirande strukturer, som liknar små krypter, på den basolaterala sidan av epitelet som omger lumen ( Figur1C, högerpanel). Samtidigt fortsätter organoider som upprätthålls i 5 dagar i avsaknad av extracellulär matris att utvecklas i suspension(figur 1D, vänster panel). Polaritetens inversion kännetecknas av förtjockningen (30-40 μm) av epitelet som omger kärnan i organoiderna och utseendet på en mängd olika morfologier: långsträckt (figur 1D, höger panel och kompletterande figur 1A), cystisk (kompletterande figur 1B) och oregelbunden (kompletterande figur 1C). Detta kombineras ofta med en krympning av det luminala utrymmet i organoiden, vilket påverkar deras totala storlek.
Effektiv inversion kan också bekräftas genom att analysera uttrycket av intestinala specifika polaritetsmarkörer. Apical-out intestinala organoider visar en distinkt lokalisering av atomkärnorna mot lumen i organoiden, som anges av 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) signalen. Uttrycket av atiska markörer, såsom VILLIN (figur 2A) och ZO-1 (Figur 2B), detekteras på utsidan av det epitel som exponeras för mediet. Denna lokalisering står i skarp kontrast till den som observerats i intestinala organoider odlade i ECM. Extracellulära matrisinbäddade organoider färgade för atomkärnor (DAPI), VILLIN (figur 2C) och ZO-1 (Figur 2D) visar en apikobasal polaritet där den apikala sidan är vänd mot organoidens lumen.
Fullständig borttagning av ECM krävs för att uppnå effektiv polaritet inversion av tarmorganoider. Ibland visar en del av de organoider som finns i suspensionskulturer omgivna av ECM-rester en cystisk morfologi som tyder på ett misslyckande i polaritetsinversion av epitelet (kompletterande figur 2A). Analys av immunofluorescerande färgning, utförd på dessa organoider, ger bevis på den basolaterala positionen hos atomkärnorna (DAPI) längs epitel och uttrycket av ZO-1 på den apikala sidan som står inför lumen i organoiden (kompletterande figur 2B) vilket bekräftar att ofullständigt ECM-avlägsnande orsakar retention av apikobasal polaritet på ett sätt som liknar ECM-inbäddade organoider.
Protokollet för etablering av intestinala monolayerkulturer resulterar i en sammanflödes monolayerkultur inom 7 dagar efter sådd och kulturen kommer ofta att nå sammanflöde inom så lite som 2-3 dagar. En av de viktigaste avgörande faktorerna för framgång är antalet och kvaliteten på celler som används för att så monoskiktet. Figur 3A, Vänster panel ger ett exempel på en idealisk såddtäthet på cirka 150 000 celler i en 6,5 mm cellkulturmembraninsats. Detta nummer är inte fast och kan vara mycket varierande baserat på givaren och kvaliteten på källorganoidkulturen; Därför bör cellnumret optimeras baserat på dessa variabler. Om såddtätheten är för låg eller av dålig kvalitet(figur 3A,höger panel) kanske det inte finns tillräckligt med tillbehör för att bilda en sammanflödeskultur för monoskikt.
När monoskiktet har etablerats (figur 3B) bildar cellerna täta korsningar, vilket skapar ett kullerstensutseende (Figur 3B, Vänster panel). Om de inte bildar ett sammanflöde av monoskikt (figur 3B, höger panel), kommer monoskiktets utseende ofta att vara "ojämnt", med regioner med celltillbehör av god kvalitet, men med större mellanrum mellan dessa regioner. Dessa kulturer ger inte en funktionell barriär mellan de basala och apatiska facken och är inte lämpliga för de beskrivna analyserna. En sammanflödesmonagerorienterar sin VILLIN-innehållande penselkant mot epitelens apokala sida, med dess kärna placerad mot cellens basolaterala pol (Figur 4B). Mellan cellerna bildas intercellulära korsningar bestående av multiproteinkomplex, inklusive ZO-1 (figur 4B). Deras närvaro är nyckeln till att tillhandahålla epitelkulturens barriärfunktion.
När övergången till en ALI-kultur har sammanflöde inducerar den ytterligare differentiering av kulturen (figur 3C). Små, runda bägareceller visas och själva monoskiktet får ett mer vikt utseende. Även om bägare celler finns i epitel av nedsänkt kultur (Figur 4A), de är mer framträdande efter ALI differentiering. Bägare celler närvarande inom epitel utsöndra slem, vilket leder till ett dimmigt utseende över toppen av epitel. Bägarecellerna och det utsöndrade slemmet kan visualiseras genom färgning för det utsöndrade slemproteinet MUC2 (figur 4A,C och D) och ökningen av bägarecellspopulationen kan mätas genom en ökning av MUC2-uttrycket (kompletterande figur 3A). Det är inte nödvändigt att ta bort detta gelliknande slemskikt och det kommer att hålla fast vid epitelytan och förbli efter upprepade tvättar. Om avlägsnande är nödvändigt, tvätta kulturen med en mukolytisk förening, såsom 10 mM N-acetylcystein eller 50 μg/ mL DTT tar bort överflödig slem. Förutom ökningen av bägarecellspopulationen ökar ALI-gränssnittet också förekomsten av enteroendokrina celler (enligt CHGA-uttrycket) (kompletterande figur 3B) och mogna enterocyter (enligt krt20-uttrycket) (kompletterande figur 3C).
Figur 1: Stadier av den apatiska tarmorganoidgenerationen. (A) Representativa bilder av en kupol med organoider av önskad storlek dag 4 (vänster panel, skalstång = 500 μm). Organoider är tunna väggade, med ett öppet luminalt fack (höger panel, skalstång = 100 μm). (B) Representativ bild av en brunn med omfattande aggregering efter 3 dagar i suspension (vänster panel, skalstång = 200 μm). Bild av klumpar fragment direkt efter savning (höger panel, skalstreck = 200 μm). C)Representativ bild av tarmorganoider i kupolen dag 7. Organoider visar en expanderad lumen med bildandet av små knoppar på epitelets basolaterala sida (Vänster 20x förstoring, Höger 100x förstoring av den markerade regionen, Skalstång = 200 μm). D)Representativ bild av tarmorganoider efter ECM avlägsnande och efterföljande suspension kultur i 5 dagar. Organoiderna får en tät morfologi med ett förtjockat epitel och exponerar sin apatiska sida för mediet. (Vänster 20x förstoring, Höger 100x förstoring av det markerade området, Skalstång = 200 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Immunofluorescerande färgning för cellpolaritetsmarkörer i tarmorganoider. Akal-out (A, B), och apical-in (C, D) orienterade intestinala organoider var färgade med apatiska markörer ZO-1 och VILLIN, och med epitelial markör E-CADHERIN (röd). DAPI (blå) användes för att visualisera atomkärnor. Vänster paneler visar bilder tagna vid 25x förstoring och höger paneler visar bilder av olika organoider vid 63x förstoring (endast panel C visar 25x och 63x förstoring av samma organoid). A)A) Akalyptiska tarmorganoider färgade med VILLIN (grön) och E-CADHERIN (röd) indikerar den apatiska sidans exponering för mediet. B)Apatiska tarmorganoider färgade med ZO-1 (grön) och E-CADHERIN (röd) visar närvaron av snäva korsningar och återgång till apikobasal polaritet. C)Matrigel-inbäddad tarmorganoid fläckad med VILLIN (grön) och E-CADHERIN (röd) som visar den apatiska sidan vänd mot den organoida lumen. D)Matrigel-inbäddade tarmorganoider färgade med ZO-1 (grön) och E-CADHERIN (röd) som indikerar närvaron av askande täta korsningar som vetter mot organoidens lumen. (Skalstång = 100 μm). Organoider färgades av immunofluorescens och avbildades med hjälp av tidigare publicerade protokoll24,25. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Etablering av intestinala monolayerkulturer. (A) Representativ bild av 3D-organoider efter behandling med 0,05% Trypsin-EDTA. Organoider är dissocierade till enstaka celler eller små cellklumpar som förberedelse för sådd av monoskiktskulturer. Vänster panel: exempel på optimal såddtäthet för en monoskiktskultur, cirka 150 000 celler per 100 μL på en 6,5 mm cellkulturmembraninsats. Höger panel: exempel på suboptimal såddtäthet vid <50 000 celler per 100 μL på en 6,5 mm cellkulturmembraninsats. B)Representativ ljusfältsbild av en nedsänkt monoskiktskultur. Vänster panel: 100% sammanflödesskikt med det karakteristiska kullerstensutseendet. Höger panel: cirka 50% konfluent monoskikt. Luckor som ses i monoskiktet (indikeras av streckad linje) stängs med tiden på grund av den fortsatta spridningen av tarmstamcellerna. C)Representativ brightfield bild av en differentierad ALI kultur på 7 dagar. (Skalstång = 200 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Immunofluorescerande färgning för differentierade cellmarkörer i monoskiktskulturer. (A) Z-stackbild av immunofluorescerande färgning av en nedsänkt monoskiktskultur för mucinproteinet MUC2, vilket indikerar närvaron av bägareceller i monoskiktskulturen (grön = MUC2, blå = DAPI). (B) Z-stack bild av immunofluorescerande färgning av en nedsänkt monolayer. VILLIN-färgning (grön) längs epitelens apikala ände indikerar närvaron av en penselkant och ZO-1-färgning (röd) indikerar närvaron av snäva korsningar mellan celler (blå = DAPI). (C) Z-stack bild av immunofluorescerande färgning av en ALI-differentierad monolayer kultur för mucin protein MUC2, vilket indikerar förekomsten av ett betydligt större antal bägare celler inom ALI monolayer kultur (grön = MUC2, blå = DAPI). D)Cryosection av ALI-differentierade monolayer kultur, färgas för förekomsten av MUC2 (grön) och E-CADHERIN (röd) som anger förekomsten av bägare celler i epitel och utsöndring av slem längs den apatiska sidan av monolayer kultur. (Skalstång = 200 μm). Monolayer kulturer var färgas av immunofluorescens och avbildas med hjälp av tidigare publicerade protokoll26,27. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Spektrum av fenotyper av anatiskt ut tarmorganoid i odlingsupphängning. A,B,C) Ytterligare representativa bilder av intestinala organoid morfologier upprätthålls i suspension 5 dagar efter ECM avlägsnande. Organoid polaritet har inverterat. Organoiderna har blivit tätare med ett förtjockat epitel och organoidens apatiska sida är vänd utåt. Organoider kan visa en mängd olika morfologier: långsträckt (A), cystic (B) och oregelbunden (C). (Skalstång = 100 μm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Tarmorganoider misslyckas med att invertera polariteten i närvaro av kvarvarande källarmembranmatrismedel i suspensionskulturer. A)Representativ bild av ofullständigt ecm-avlägsnande och underlåtenhet att invertera organoiderna. Matrigelrester finns runt organoiderna och bidrar till att upprätthålla epitelpoläritetsorienterad apical-in. Organoider visar en cystisk morfologi med ett tunt epitel som omger lumen (Skalstång = 200 μm). B)Representativ bild av en icke-inverterad organoid som finns i suspensionskulturförhållanden. Atomkärnor (blå = DAPI) och E-CADHERIN (röd) är placerade på den basolaterala sidan, ZO-1 (grön) uttrycks på den apikala sidan som vetter mot organoidens lumen. (Skalstång = 100 μm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Genuttryck av differentierade cellmarkörer i monoskiktskulturer. A,B,C) Uttryck av MUC2, CHGAoch KRT20 i nedsänkt och ALI-differentierad monolayer kultur genereras i intestinala organoid differentiering Medium i förhållande till en 3D organoid kultur odlas med intestinala organoid expansion medium etablerad via qPCR. Etablering av en nedsänkt monoskiktskultur ökar uttrycket för varje differentierad cellmarkör. Differentiering som ali-kultur ökar dock uttrycket för varje markör exponentiellt. Felstaplar = +/- SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| MONOLAYER KULTURWARE | ANTAL BRUNNAR AV TARMORGANOIDER ATT SKÖRDA (från 50 μL kupol/per brunn som ska sås) |
| 6,5 mm Transwellinsats | 1 - 2 brunnar |
| 12 mm Transwellinsats | 3 - 4 brunnar |
| 6-brunnsplatta | 6 - 8 brunnar |
| 24-brunnsplatta | 3 - 4 brunnar |
| 96-brunnsplatta | 1 - 2 brunnar |
Tabell 1: Antal brunnar av tarmorganoider att skörda för olika odlingsvaror
Discussion
Epitelial organoid modeller har blivit kraftfulla plattformar som kan användas för att modellera vävnad organisation, sjukdomsprogression, och identifieraterapier 23,28,29. Organoid mikroinjektion har tillfört mervärde till organoidens förmåga att modellera infektionssjukdomar eftersom det möjliggör patogen interaktion med den apatiska sidan av värd epitel. De senaste framstegen inom mikroinjektionsteknik har optimerat injektionshastigheten hos organoider och har uppnått en hastighet på upp till 90 injicerade organoider per timme. Barriärfunktionen i injicerade organoider bevarades, och den låga syrekoncentrationen inuti lumen tillät överlevnad av obligatoriska-anaeroba injicerade bakterier30. Studier har dock noterat förekomsten av heterogenitet i organoida populationer inom samma brunn. Dessa skillnader observerades i storlek och form31, uttrycksnivåer av viktigagener 32, liksom spridningshastigheter33. Differentiella svar inom samma organoidpopulation på föreningar som forskolin och PGE2, eller koleratoxin, har också beskrivits28,33. Dessa resultat belyser behovet av höga organoida tal i studier och begränsar användningen av luminal injektion.
Konventionell organoidkultur är baserad på inkapsling och förökning av organoider i en hydrogel. Hydrogeler kan dock utgöra begränsningar för diffusion och införa koncentrationsgradienter, vilket kan öka heterogeniteten34. Dessutom har hög variation dokumenterats, inte bara mellan kulturer och givare utan också inom individuella försöksbetingelseförhållanden. Donatorkälla, hydrogelens biokemiska egenskaper och organoidens inneboende heterogenitet som odlingssystem är viktiga faktorer som kan öka experimentell variabilitet och begränsa reproducerbarheten hos resultat som erhålls i nedströmstillämpningar. Båda de metoder som beskrivs här ger ett enkelt sätt att exponera den apatiska sidan av epitelet, vilket möjliggör modellering av föreningar och patogener av intresse genom att direkt lägga till dem till odlingsmediet. Minskningen av hydrogelutnyttjandet kan begränsa experimentell variabilitet från tekniska felkällor.
De aprokala tarmorganoiderna behåller viktiga egenskaper hos det organoida modellsystemet och deras skalbarhet gör dem mer mottagliga för höga genomströmningsanalyser, jämfört med 2D-monoskiktet. Men eftersom organoiderna behåller sin 3D-struktur är tillgängligheten på den basala sidan begränsad och kan hindra studier som kräver tillgång till båda sidor samtidigt.
Vi har visat att polaritetsinversion av tarmorganoider är beroende av ett effektivt och absolut avlägsnande av ECM, samtidigt som organoidernas intakta struktur bevaras. Både användningen av dissociationslösningen för att avlägsna ECM och den anti-vidhäftande lösningen för att förhindra organoider vidhäftning av plastartiklarna bidrog till att förbättra den totala effektiviteten hos det protokoll som publicerats av Co, J. Y. och kollegor22, särskilt när det gäller antalet aprokala organoider som produceras för nedströmsapplikationer.
Dessutom observerade vi att vårt protokoll stöder effektivare inversion av organoider mindre än 250 μm och användning av större organoider kan resultera i en minskad organoid effekt, på grund av fragmentering orsakad av pipetting. Breda spetsar, som de som anges i materialförteckningen,kan möjliggöra användning av större organoider. Breda spetsar är dock mindre effektiva vid ECM-dissociation jämfört med standardspetsar på grund av den lägre applicerade mekaniska kraften. Därför kan upprepade steg 1.2.9-1.2.11 krävas för tillräcklig störning och fullständigt avlägsnande av alla ECM-rester vid arbete med större organoider.
Organoider i suspension kan överleva i minst 2 veckor. Efter denna tidsperiod observerade vi morfologiska förändringar och ett ökat antal celldöd. Förekomsten av prolifererande celler i de aprokala organoiderna22 möjliggör återetablering av aprotiska in intestinala organoidkulturer. Detta kan uppnås genom att skilja apical-out organoider till enstaka celler och bädda in dem i ECM med intestinala organoid expansion medium.
En begränsning som ofta påträffas i protokoll som beskriver etableringen av tarmorganoider i suspensionskulturer är genereringen av stora aggregat. Detta påverkar flera variabler såsom effektivitet, reproducerbarhet av morfologiska funktioner, permeabilitet till föreningar och parakrina signalering. I likhet med protokollet som publicerats av Co, J. Y. och kollegor, bekräftar vi här att vi har fått polaritet inversion av minst 97% av alla suspenderade organoider utan att shearing efter 3 dagar i suspension. Men i motsats till publikationen har vi infört ett mekaniskt dissociationssteg för att minska bildandet av stora aggregat och öka avkastningen. Eftersom detta förfarande kan skada epitel av organoiderna, förlängde vi inkubationstiden för organoider i ytterligare 2 dagar för att möjliggöra fullständig epitelåtervinning och säkerställa högkvalitativa kulturer för nedströmsapplikationer. Införandet av konstant agitation med användning av en inkubator shaker eller en spinner kolv kan potentiellt minska fusion händelser, minimera fragmentering och öka syresättning. Dessa alternativa metoder kan upprätthålla kulturerna under längre varaktigheter, minska celldöden och möjliggöra ytterligare differentiering av de atiska tarmorganoiderna.
Etableringen av en organoid-härledd 2D monolayer ger flera fördelar och nackdelar jämfört med inverterad polaritet organoider. Protokollet som beskrivs här möjliggör snabb etablering av en sammanflödes monolayerkultur, vanligtvis på mindre än 7 dagar och möjligheten till långsiktigt underhåll av kulturerna under en längre tid (upp till 10 veckor). Protokollet och de medier som används här möjliggör också en effektiv differentiering av ett betydande antal celler, som inte alltid finns i andra organoid-härledda monoskiktskulturer16. Att upprätta ett monoskikt på ett cellkulturinsättningsmembran möjliggör samtidig åtkomst till både de apatiska och basolaterala sidorna av epitelet, vilket gör dem idealiska för studier i barriärintegritet och epiteltransport. Denna förenklade tillgång gör dem också mer mottagliga för infektions- och läkemedelsbehandlingsstudier. Dessutom upprätthåller dessa kulturer många av de egenskaper som är unika för givaren och upprätthåller deras relevans för patientspecifika studier. ALI-odlingsmetoden underlättar också differentiering av ett mer funktionellt epitel bestående av både sekreterliga och absorptiva celltyper, vilket gör det mer representativt för det mänskliga tarmepitetelet. Den relativa stabiliteten hos dessa kulturer gör det också möjligt att upprätthålla dem under en längre tid, vilket ger möjlighet till långsiktiga studier. Begränsningar av detta tillvägagångssätt är dock det stora antalet celler som krävs för att upprätta ett sammanflöde av monoskikt och behovet av att upprätthålla fullständig sammanflöde för att ha en funktionell separation mellan de apatiska och basolaterala kamrarna. Den karakteristiska kryptarkitekturen, som kan modelleras i 3D-organoidkulturerna, går också förlorad när man etablerar en monolayerkultur. Ändå gör det experimentellt vänliga formatet av kulturen och den lätthet med vilken epitelets apatiska och basolaterala sidor kan nås, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för studier av tarmfysiologi.
Disclosures
G. S., W.C., och S. S. är anställda vid STEMCELL Technologies Ltd., Cambridge (UK). M. S., F. E., S. L., A. E., och R. K.C. är anställda vid STEMCELL Technologies Inc., Vancouver (Kanada).
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Horizon 2020-stipendiet OrganoVIR 812673 projektet Organoids for Virus Research - An innovative training-ITN programme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
| Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
| Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
| Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
| Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
| D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
| Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
| IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
| Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |
References
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888 (2017).
- DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
- Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhang, Y. -G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147 (2014).
- Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
- Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
- Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
- Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498 (2020).
- Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, ÖH. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
- Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479 (2019).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
- Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
