Summary
Questo protocollo descrive la procedura per rimuovere il lobo ventrale del fegato nel pesce zebra adulto per consentire lo studio della rigenerazione epatica.
Abstract
L'insufficienza epatica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e la mortalità per malattie croniche del fegato sta aumentando bruscamente negli Stati Uniti. I fegati sani sono in grado di rigenerarsi da danni tossici, ma nelle malattie epatiche avanzate, la naturale capacità del fegato di rigenerarsi è compromessa. Zebrafish è emerso come un potente sistema sperimentale per lo studio della rigenerazione. Sono un modello ideale per studiare la rigenerazione epatica dall'epatomia parziale, una procedura con rilevanza clinica diretta in cui parte del fegato viene rimossa chirurgicamente, lasciando intatto il resto. Non esiste un protocollo standard per l'epatotomia parziale; studi precedenti che utilizzano questo modello hanno utilizzato protocolli leggermente diversi e riportato risultati disparati. Qui descritto è un protocollo efficiente e riproducibile per eseguire un'epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto. Usiamo questa tecnica per dimostrare che i pesci zebra sono in grado di rigenerazione epimorfica del lobo reinsediato. Questo protocollo può essere utilizzato per interrogare ulteriormente i meccanismi necessari per la rigenerazione epatica nel pesce zebra.
Introduction
Tra gli organi solidi nell'uomo, il fegato è l'unico organo in grado di rigenerazione1. Questo è fondamentale, in quanto il fegato è un organo essenziale, responsabile delle principali funzioni metaboliche, conservazione dell'energia, disintossicazione del sangue, secrezione di proteine plasmatiche e produzione di bile2. Gli epatociti persi a causa di danni tossici o infiammatori vengono sostituiti principalmente attraverso la divisione degli epatociti rimanenti1. Un modello sperimentale classico per lo studio della rigenerazione epatica è l'epatomia parziale, in cui vengono rimossi i singoli lobi del fegato, lasciando intatti i lobirimanenti 3. Questa procedura è stata inizialmente sviluppata nei ratti, in cui vengono rimossi circa due terzi della massa epatica. Dopo un'epatomia parziale nei mammiferi, la rigenerazione compensativa si verifica nei lobi rimanenti fino a quando il fegato non recupera la sua massa iniziale. In particolare, il fegato di mammifero non sostituisce i lobi mancanti.
I pesci zebra (Danio rerio) rappresentano un modello trattabile per lo studio della rigenerazione di organi adulti4. Il fegato di zebrafish, sebbene strutturalmente diverso dal fegato di mammifero, è costituito dagli stessi tipi di cellule e svolge la stessa funzione dei mammiferi2. È composto da tre lobi, con due lobi dorsali e un singolo lobo ventrale che sono appiattiti lungo l'intestino. L'epatotomia parziale è stata precedentemente eseguita in zebrafish, con resoconti contrastanti sulla modalità precisa di rigenerazione. Tipicamente, un'epatotectomia parziale di un terzo viene eseguita rimozione dell'intero lobo ventrale. I primi rapporti indicavano che dopo la rimozione del lobo ventrale, è stato completamente rigenerato entrouna settimana 5,6,7, suggerendo che a differenza del fegato di mammifero, il fegato di zebrafish è in grado di rigenerazione epimorfica. Studi successivi hanno dimostrato che la rimozione del lobo ventrale ha portato alla rigenerazione compensativa nei lobi dorsali, piuttosto che alla rigenerazione del lobo ventrale mancante e, in ultima analisi, al recupero della massa epatica entrouna settimana 8,9. La profilazione trascrittamica dei lobi dorsali a seguito della resezione del lobo ventrale ha rivelato cambiamenti significativi associati alla rigenerazionecompensativa 10. Dato che la modalità di rigenerazione epatica può variare con l'entità dellalesione 8, abbiamo ipotizzato che le discrepanze nei risultati possano essere dovute a variazioni tecniche nel protocollo parziale di epatomia tra gruppi di ricerca.
Questo protocollo descrive una procedura per eseguire un'epatotectomia parziale di un terzo sul pesce zebra adulto rimuovendo il lobo ventrale. Questa tecnica sarà preziosa per valutare i meccanismi di rigenerazione epatica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafish sono stati allevati e allevati secondo procedure standard. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Brigham and Women's Hospital (2016N000405). I pesci zebra adulti sono stati digiunati per 24 ore prima dell'inizio del protocollo. L'acqua del sistema si riferisce all'acqua nei serbatoi di alloggiamento del pesce zebra nella struttura acquatica.
1. Preparazione e anestesizzazione
- Preparare la soluzione di Tricaine 0,016% nell'acqua del sistema.
ATTENZIONE: La tricaina è irritante se viene a contatto con gli occhi, la pelle o le vie respiratorie. - Preparare una spugna per tenere il pesce zebra anestetizzato durante il protocollo di dissezione. Tagliare una spugna piena in quarti. Utilizzando una lama di rasoio, rimuovere un sottile cuneo di spugna che corre parallelo al lungo asse del quarto di spugna.
- La fessura dovrebbe essere abbastanza lunga da ospitare un pesce adulto (questo varierà tra diverse dimensioni di pesce). Ad esempio, per un pesce adulto di 35 mm di lunghezza, la lunghezza della fessura dovrebbe essere di 20 mm. La testa e il corpo sono comodamente tenuti nella spugna, ma la coda corre oltre il bordo della spugna (Figura 1B).
- Immergere la spugna in soluzione di Tricaine allo 0,016%.
- Posizionare il pesce zebra adulto (maschio o femmina) in 625 mL di soluzione di Tricaine 0,016%.
- Incubare per 6 minuti o fino a quando il pesce non risponde al tatto.
- Utilizzando le flessure, rimuovere con cura il pesce dal serbatoio di Tricaine e posizionare il lato ventrale del pesce nella scanalatura dellaspugna (Figura 1A - B).
- Posizionare la spugna sotto un microscopio sezionato con illuminazione dall'alto verso il basso.
2. Chirurgia
- Usando forcep fini, pizzicare la pelle e ridimensionare medialmente, appena posteriore al cuore (Figura 1B).
- Utilizzando forbici a molla, effettuare un taglio sotto le forcep per creare un foro nella cavità corporea (Figura 1C - D). Fare attenzione a non ferire il cuore o un vaso sanguigno principale, in quanto ciò comporterà un aumento della mortalità.
- Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione di 3-4 mm lungo l'addome, elaborando posteriormente fino a quando l'incisione arriva alle pinne pelviche(Figura 1D - E). A questo punto, il lobo ventrale del fegato può essere visibile attraverso l'incisione.
- Spremere i lati della spugna con una mano per forzare gli organi viscerali fuori dalla cavità corporea. Il lobo ventrale del fegato sarà visibile sopra l'intestino(figure 1F,2A-B). Il fegato apparirà come una struttura rosa o arancione distribuita sull'intestino bruno-dorato. A questo punto vengono recuperati animali designati come controlli fittizi.
- Spremere le forcep sottili in modo che i due denti si tocchino. Pur mantenendo la pressione sulla spugna, far scorrere i denti delle forcep fini tra il fegato e l'intestino (Figura 1G). Fai attenzione a non forare l'intestino, poiché ciò comporterà un aumento della mortalità.
- Rilassare lentamente la pressione sui farsa in modo che i denti si allontanino l'uno dall'altro(Figura 1H). Questa azione scorrevole aggredisce i numerosi attacchi delle vene portale tra il lobo ventrale e l'intestino(Figura 2B),ed è necessaria per rimuovere in modo pulito il lobo ventrale. Ripetere questo processo fino a quando tutte le connessioni del portale tra fegato e intestino non sono state recise.
- Sbucciare il lobo ventrale dall'intestino usando forcep fini e tagliare il lobo ventrale libero dal resto del fegato (Figura 1I).
- Questa procedura si traduce in un'epatotectomia parziale di un terzo (figura 1J).
3. Recupero
- Rimuovere con cura il pesce dalla spugna e posizionarelo in un serbatoio di acqua di sistema.
- Il sistema pipette innaffia sulle branchie per alcuni minuti fino a quando il pesce nuota da solo(Figura 1K).
- Monitorare i pesci per 2-4 ore prima di rimetterli sul sistema. Non nutrire il pesce per un pieno 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
- Monitorare quotidianamente i pesci per tutta la durata dell'esperimento.
- Con il tempo, l'incisione nella parete corporea guarirà naturalmente senza la necessità di suture(Figura 1L,2C).
4. Analisi della lunghezza da lobo ventrale a intestino
- Eutanasia di tutti gli animali destinati all'analisi in acqua ghiacciata per 10 minuti fino a quando non cessano tutti i movimenti opercolari.
- Rimuovere il pesce dall'acqua ghiacciata e posizionarlo lato ventrale verso l'alto nel solco di una spugna.
- Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione nella parete del corpo ventrale nella posizione anteriore-posteriore del cuore. Quindi fare altre due incisioni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore dalla prima incisione fino alle pinne pelviche. (Figura 2A).
- Sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali (Figura 2A).
- Acquisire immagini luminose e fluorescenti degli organi viscerali utilizzando un microscopio a epifluorescenza. Questo campo visivo includerà l'area in cui è stato rispecchiato il lobo ventrale. Poiché gli animali vengono eutanasiati prima dell'analisi, questo tipo di analisi impedisce l'imaging a lungo termine dello stesso pesce.
5. Analisi del rapporto fegato/peso corporeo
- Eutanasia di tutti gli animali destinati all'analisi in acqua ghiacciata per 10 minuti fino a quando non cessano tutti i movimenti opercolari.
- Mettere il pesce in un tubo conico da 50 ml.
- Aggiungere 25 ml di paraformaldeide al 4% in 1x PBS e 0,3% di Interpolazione al tubo.
ATTENZIONE: La formaldeide è tossica e le soluzioni contenenti formaldeide devono sempre essere lavorate in una cappa chimica. - Nutato per 48 h a 4 °C.
- Eseguire quattro lavaggi da 10 minuti in 1x PBS e 0,3% tween.
- Recuperare il pesce con le affelli e asciugare su un tovagliolo di carta.
- Registrare il peso dell'intero pesce.
- Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione nella parete del corpo ventrale nella posizione anteriore-posteriore del cuore. Quindi, fare altre due incisioni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore dalla prima incisione fino alle pinne pelviche. (Figura 2A).
- Sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali (Figura 2A).
- Acquisire immagini a campo luminoso del fegato utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
- Sezionare il fegato, posizionando i pezzi di fegato su una barca di pesatura.
- Registrare il peso del fegato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Al fine di esaminare il potenziale rigenerativo del fegato di zebrafish adulto, abbiamo eseguito un'epatotectomia parziale (PHX) nel pesce zebra adulto. In generale, sono stati selezionati grandi adulti (30-40 mm di lunghezza), che vanno da 1,5 a 2,5 anni. All'interno dei singoli esperimenti, gli animali venivano selezionati dallo stesso serbatoio e corrispondevano all'età e alle dimensioni. Come controllo appropriato, abbiamo utilizzato interventi chirurgici fittizi in cui l'animale è stato anestetizzato e ha ricevuto una grande incisione nella parete del corpo ventrale ma è stato recuperato senza rimuovere alcun tessuto. I tassi di sopravvivenza per i controlli fittizi variavano dal 90% al 100% sia per il pesce zebra maschio che per quello femminile. I tassi di sopravvivenza per gli animali PHX variavano dal 60%-75% per il pesce zebra maschio e dal 60%-90% per le zebrafish femminili, con tutti i decessi che si verificavano nelle prime 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
Il gold standard per quantificare il recupero del fegato dopo PHX è il rapporto fegato/peso corporeo, o LBR. Questo saggio è stato utilizzato sia per la misurazione del recupero della massa epatica sia nei modelli di mammiferi11 che zebrafish8. Per quantificare in modo affidabile il peso del fegato, abbiamo effettuato misurazioni del peso su animali fissi, come descritto in precedenza8. Abbiamo eseguito misurazioni LBR su tipo selvatico, pesce zebra illeso, e abbiamo scoperto che, comeprecedentemente riportato 8, il pesce zebra femmina aveva quasi il doppio dell'LBR rispetto al pesce zebra maschio (3,3% per le zebre femmine e 1,8% per il pesce zebra maschio)(Figura 3A). Abbiamo eseguito sia sham che PHX su zebrafish adulti di entrambi i sessi e analizzato l'LBR a 0 e 7 giorni dopo l'infortunio (dpi)(Figura 3B). A 0 dpi, gli animali fittizi avevano un lobo ventrale chiaramente visibile, mentre negli animali PHX il lobo ventrale era completamente assente(Figura 3C). In particolare, ciò ha comportato una significativa riduzione della LBR (riduzione del 30% del pesce maschio, riduzione del 20% del pesce femminile)(figura 3D). Nella coorte di pesci analizzati a 7 dpi, la Corte ha riscontrato che il lobo ventrale non si era rigenerato (Figura 3E), eppure l'LBR dei controlli PHX e sham era comparabile(figura 3F). Queste misurazioni indicano che di 7 dpi, il fegato ha riacquistato massa rispetto ai controlli fittizi, presumibilmente mediante rigenerazione compensativa nei lobi dorsali, in accordo con le precedentirelazioni 8,9.
Abbiamo deciso di indagare se, dato abbastanza tempo, il lobo ventrale del fegato fosse in grado di rigenerarsi. I pesci adulti Tg(fabp10a:CFP-NTR) sono stati selezionati per la sperimentazione, poiché questi pesci esprimono CFP negli epatociti, consentendo la visualizzazione del fegato utilizzando la microscopia a fluorescenza. Una coorte di animali è stata sottoposta al protocollo completo di epatomia parziale di un terzo. Gli animali sono stati analizzati a 1 o 36 dpi(figura 4A). Per ogni animale è stato misurato il rapporto tra la lunghezza del lobo ventrale e l'intestino(figura 4B).
Gli animali sottoposti a finti interventi chirurgici avevano un prominente lobo ventrale che occupava il 50-100% della lunghezza dell'intestino, mentre gli animali sottoposti a un terzo di epatomia parziale avevano un lobo ventrale gravemente ridotto. Sorprendentemente, molti animali dell'epatomia parziale a 36 dpi avevano un rapporto tra lobo ventrale e intestino aumentato rispetto agli animali dell'epatomia parziale a 1 dpi(figura 4C). Non c'è stato alcun aumento delle dimensioni del lobo ventrale nei controlli fittizi; tuttavia, un aumento statisticamente significativo delle dimensioni del lobo ventrale è stato osservato dopo il recupero dall'epatomia parziale (Figura 4D). Abbiamo notato che c'era un'ampia variazione nella risposta all'intervento chirurgico, con alcuni animali che non mostravano rigenerazione e altri che rigeneravano chiaramente un lobo ventrale ben definito (Figura 4E). Questi risultati dimostrano che il lobo ventrale è in grado di rigenerarsi dalla resezione chirurgica del fegato nel pesce zebra adulto. Nel complesso, il nostro lavoro indica che il fegato di zebrafish è in grado di rigenerazione sia epimorfa che compensativa.
Figura 1: Protocollo parziale di epatomia. (A) Diagramma di un pesce zebra adulto, con gli assi anteriore-posteriore e dorsale-ventrale annotato. (B) Dopo l'anestesia, un animale è incorporato in una spugna (mostrato in blu) in modo che sia lato ventrale verso l'alto. Le forcep fini vengono utilizzate per pizzicare la pelle appena posteriore al cuore. La spugna non viene mostrata nei pannelli successivi per chiarezza. (C) Le forbici vengono utilizzate per rompere la pelle appena posteriore al cuore. (D-E) Le forbici vengono utilizzate alla ferita ora aperta per fare un'incisione di 3-4 mm che corre da anteriore a posteriore, terminando poco prima delle pinne pelviche. (F) Spremere i lati della spugna fa sì che gli organi viscerali esoppino dalla ferita più grande. (G) Le forcep fini con entrambi i denti che toccano sono scivolate tra il lobo ventrale del fegato e l'intestino. (H) Le forcep sono rilassate, facendole rompere gli attacchi delle vene portale tra il fegato e l'intestino. Questo processo viene ripetuto lungo la lunghezza del lobo ventrale. (I-J) Il lobo ventrale viene tirato su dalla sua estremità posteriore, mentre le forbici vengono utilizzate per severare il lobo ventrale dal resto del fegato. (K) L'animale viene posto in una camera di recupero con acqua di sistema, dove riacquista conoscenza e diritti stessi. (L) Con il tempo, i visceri vengono tirati indietro nella cavità corporea e la ferita guarisce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Anatomia del pesce zebra e recupero dall'epatomia parziale. (A) Per l'analisi degli organi viscerali, gli animali vengono eutanasiati e posizionati sul lato ventrale su una spugna. In primo luogo, un'incisione viene eseguita nella posizione anteriore-posteriore del cuore (linea rossa). Quindi, vengono generate due incisioni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore fino alle pinne pelviche (linea blu). Quindi, la pelle e i muscoli vengono sbucciati all'indietro, rivelando gli organi viscerali. Etichettati sono l'intestino, il lobo ventrale del fegato e la vena centrale in quel lobo. (B) Immagine in diretta di una vista ventrale di un pesce zebra predisposto per l'analisi degli organi viscerali. Il lobo ventrale del fegato è delineato con una linea bianca punteggiata. La casella gialla nell'immagine 2x indica la posizione dell'immagine 8x. Le punte di freccia bianche indicano connessioni delle vene portale tra l'intestino e il fegato. (C) Visione ventrale della ferita generata dalla procedura parziale di epatomia nei punti temporali indicati. Nel tempo, l'incisione guarisce completamente. Barre di scala, 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rigenerazione compensativa dopo epatectomia parziale. (A) I rapporti fegato/peso corporeo (LBR) sono stati misurati per il tipo selvatico, il pesce zebra illeso. Le zebre femmine hanno quasi il doppio dell'LBR rispetto al pesce zebra maschio. Gli animali femminili sono stati confrontati con animali maschi che utilizzano un test di somma di grado Wilcoxon, ****p < 0,0001. (B) Schema che indica che per questo esperimento sono stati utilizzati zebrafish di tipo selvatico. Gli animali sono stati sottoposti a epatectomia fittizia o parziale (PHX), e poi fissati a 0 o 7 giorni dopo la lesione (dpi). Gli animali fissi sono stati immagini e sottoposti a misurazioni LBR. (C,E) Sono mostrate immagini rappresentative di animali sottoposti a sham o PHX a 0 dpi (C) e 7 dpi (E). Si noti la completa assenza dei lobi ventrali negli animali PHX. Per tutte le immagini, mostrata è una vista ventrale degli organi viscerali. Le immagini sono immagini a campo luminoso. Il lobo ventrale del fegato è delineato in bianco. Barre di scala, 500 μm. (D,F) Grafici a barre dei rapporti fegato/peso corporeo sia per il pesce zebra maschio che per quello femminile dopo interventi chirurgici sham e PHX a 0 dpi (D) e 7 dpi (F). L'altezza della barra è il valore medio e le barre di errore rappresentano SEM. Mentre c'è una riduzione dell'LBR a seguito di epatomia parziale a 0 dpi, non vi è alcuna differenza significativa tra PHX e animali fittizi a 7 dpi, indicando il ripristino della LBR. I campioni parziali di epatomia sono stati confrontati con i controlli fittizi usando un test di somma di rango wilcoxon, ns = non significativo, *p < 0,05, **p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: I pesci zebra possono rigenerare i lobi ventrali dopo un'epatomia parziale. (A) Schema che indica che per questo esperimento sono stati utilizzati Tg(fabp10a:CFP-NTR). L'intervento chirurgico e l'analisi mediante imaging sono stati eseguiti nei punti di tempo indicati. (B) Un'immagine di esempio per dimostrare come sono stati analizzati gli animali. Gli animali sono stati quantificati misurando la lunghezza del lobo ventrale (in rosso), la lunghezza dell'intestino (in giallo) e calcolando la percentuale dell'intestino che il lobo ventrale occupa (in bianco). (C) È mostrata un'immagine rappresentativa degli animali sottoposti a epatectomia fittizia o parziale (PHX) a 1 e 36 giorni dopo la lesione (dpi). (D) Trame per violino del rapporto tra lunghezza ventrale del lobo e lunghezza dell'intestino per animali sottoposti a epatectomia fittizia o parziale a 1 e 36 dpi. Ogni punto rappresenta il valore di un singolo pesce. I valori per i pesci maschi sono in blu, pesci femmina in rosso. I campioni parziali di epatomia sono stati confrontati con i controlli fittizi usando un test di somma di rango wilcoxon, ns = non significativo, *p < 0,05. (E) Sono riportati due esempi di animali dell'epatomia parziale a 36 dpi che non si sono rigenerati e due esempi che si sono rigenerati. Per tutte le immagini, mostrata è una vista ventrale degli organi viscerali. Le immagini sono un'unione di un'immagine a fluorescenza CFP e di un'immagine a campo luminoso. La fluorescenza della PCP è presente solo nel fegato. Il lobo ventrale del fegato è delineato in rosso. La percentuale dell'intestino che occupa il lobo ventrale è in bianco. Barre di scala, 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le differenze anatomiche tra zebrafish e modelli di mammiferi per la rigenerazione del fegato presentano sfide uniche per la resezione epatica. Il fegato nei pesci zebra è nelle immediate vicinanze del cuore e dell'intestino; inavvertitamente dannoso per entrambi gli organi si traduce in un aumento della mortalità. Il fegato di zebrafish non è incapsulato, rendendo più difficile separarsi dall'intestino. Il fegato riceve sangue ricco di nutrienti dall'intestino attraverso le vene portale. Nei mammiferi, le vene che lasciano l'intestino convergono su una vena porta primaria che poi si divide mentre entra nel fegato12. Al contrario, il fegato zebrafish riceve la circolazione del portale da una serie di piccoli vasi che si spostano direttamente dall'intestino al fegato (Figura 2B). Pertanto, ogni lobo del fegato, appiattito sopra l'intestino, è saldamente attaccato all'intestino da questi vasi. Il tentativo di rimuovere il lobo ventrale senza prima recidere le vene del portale può spesso comportare una resezione incompleta (dati non mostrati). Alcuni dei protocolli iniziali descrivono di estrarre il lobo ventrale attraverso un'incisione relativamente minore, che non consente di recidere questi allegatiportale 5,6.
Il protocollo qui descritto è progettato per affrontare queste sfide per consentire la rimozione coerente del lobo ventrale. I pesci zebra anestetizzati sono posizionati comodamente nel solco della spugna per mantenere bagnate le loro branchie e i loro corpi immobili per tutta la durata della procedura. Pizzicare la pelle appena posteriore al cuore consente di posizionare un'incisione nella pelle senza danneggiare nessuno degli organi interni. L'apertura di una grande incisione (3-4 mm) rende semplice la rimozione del fegato e la valutazione del grado di rimozione(Figura 2C). È importante sottolineare che il pesce zebra può riprendersi e alla fine guarire una ferita di queste dimensioni senza alcuna chiusura primaria della ferita. Stringendo la spugna e comprimendo la parete corporea, gli organi viscerali diventano più accessibili ed è possibile far scorrere i denti di una pinze tra il fegato e l'intestino. Le forcep possono quindi essere utilizzate per severare le connessioni del portale tra il fegato e l'intestino. Una volta raggiunto questo obiettivo, le forcep sottili possono essere utilizzate per sbucciare il lobo ventrale in modo che possa essere separato dal resto del fegato.
Abbiamo misurato i rapporti fegato/peso corporeo (LBR) degli animali sottoposti a interventi chirurgici sham e PHX. La Corte ha riscontrato che, di 7 dpi, l'LBR degli animali PHX era paragonabile ai controlli(figura 3F). Dato che il lobo ventrale non si era rigenerato a questo punto (Figura 3E), abbiamo dedotto che la rigenerazione si è verificata attraverso la compensazione nei lobi dorsali. Per affrontare la questione se il lobo ventrale possa in definitiva rigenerarsi nel pesce zebra, abbiamo eseguito PHX ed esaminato la ri-crescita del fegato. In media, il rapporto tra la lunghezza del lobo ventrale e l'intestino era più alto a 36 dpi rispetto a 1 dpi, indicando la rigenerazione del lobo ventrale(figura 4C-D). Vi è un'ampia variazione nella risposta degli animali alle lesioni, con alcuni animali che hanno registrato una crescita molto bassa e altri che sperimentano un sostanziale recupero del lobo ventrale (figura 4E). Concludiamo che il fegato può rigenerarsi con una miscela di rigenerazione epimorfa del lobo ventrale e rigenerazione compensativa nei lobi dorsali, anche se in tempi diversi. Poiché studi precedenti hanno utilizzato epatotomie parziali per saggiare il ruolodei singoli geni 5,7,9 e le vie di segnalazione6,8,10 dopo la resezione, prevediamo che questo protocollo farà progredire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari di rigenerazione epatica in un vertebrato adulto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
I.M.O. è supportato dal NIAAA (F32AA027135). W.G. è supportato da R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 e dal Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. è uno studioso di scienze biomediche di Pew.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K.
- Grisham, J. W.
