Summary
Este protocolo describe el procedimiento para eliminar el lóbulo ventral del hígado en el pez cebra adulto para permitir el estudio de la regeneración hepática.
Abstract
La insuficiencia hepática es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la mortalidad por enfermedad hepática crónica está aumentando bruscamente en los Estados Unidos. Los hígados sanos son capaces de regenerarse a partir de daños tóxicos, pero en la enfermedad hepática avanzada, la capacidad natural del hígado para regenerarse se ve afectada. El pez cebra ha surgido como un poderoso sistema experimental para estudiar la regeneración. Son un modelo ideal para estudiar la regeneración hepática a partir de la hepatectomía parcial, un procedimiento con relevancia clínica directa en el que se extirpa quirúrgicamente parte del hígado, dejando el resto intacto. No existe un protocolo estándar para la hepatectomía parcial; los estudios anteriores que utilizaron este modelo han utilizado protocolos ligeramente diferentes y han reportado resultados dispares. Aquí se describe un protocolo eficiente y reproducible para realizar una hepatectomía parcial en peces cebra adultos. Utilizamos esta técnica para demostrar que los peces cebra son capaces de regeneración epimórfica del lóbulo resecado. Este protocolo se puede utilizar para interrogar más lejos los mecanismos requeridos para la regeneración del hígado en el pez cebra.
Introduction
Entre los órganos sólidos en los seres humanos, el hígado es el único órgano capaz de regeneración1. Esto es crítico, ya que el hígado es un órgano esencial, responsable de las funciones metabólicas clave, el almacenamiento de energía, la desintoxicación de la sangre, la secreción de proteínas plasmáticas y la producciónde bilis 2. Los hepatocitos perdidos debido a daños tóxicos o inflamatorios se reemplazan principalmente a través de la división de los hepatocitos restantes1. Un modelo experimental clásico para estudiar la regeneración hepática es la hepatectomía parcial, donde se extirpan los lóbulos individuales del hígado, dejando intactos los lóbulos restantes3. Este procedimiento se desarrolló inicialmente en ratas, en las que se eliminan aproximadamente dos tercios de la masa hepática. Después de la hepatectomía parcial en mamíferos, la regeneración compensatoria se produce en los lóbulos restantes hasta que el hígado recupera su masa inicial. En particular, el hígado de los mamíferos no reemplaza los lóbulos que faltan.
El pez cebra(Danio rerio)representa un modelo manejable para el estudio de la regeneración de órganos adultos4. El hígado del pez cebra, aunque estructuralmente diferente del hígado de los mamíferos, está formado por los mismos tipos de células y cumple la misma función que en los mamíferos2. Se compone de tres lóbulos, con dos lóbulos dorsales y un solo lóbulo ventral que se aplanan a lo largo del intestino. Hepatectomy parcial se ha realizado previamente en el pez cebra, con cuentas contradictorias en cuanto al modo exacto de regeneración. Por lo general, una hepatectomía parcial de un tercio se realiza mediante la extirpación de todo el lóbulo ventral. Los informes iniciales indicaron que después de la eliminación del lóbulo ventral, se regeneró completamente dentro de una semana5,6,7,lo que sugiere que en contraste con el hígado de mamífero, el hígado de pez cebra es capaz de regeneración epimórfica. Estudios posteriores demostraron que la eliminación del lóbulo ventral dio lugar a la regeneración compensatoria en los lóbulos dorsales, en lugar de la regeneración del lóbulo ventral faltante, y en última instancia la recuperación de la masa hepática en el plazo de una semana8,9. El perfil transcriptómico de los lóbulos dorsales después de la resección del lóbulo ventral reveló cambios significativos asociados a la regeneración compensatoria10. Dado que el modo de regeneración hepática puede variar con la extensión de la lesión8,especulamos que las discrepancias en los resultados pueden deberse a la variación técnica en el protocolo de hepatectomía parcial entre los grupos de investigación.
Este protocolo describe un procedimiento para realizar un tercio de hepatectomía parcial en el pez cebra adulto mediante la eliminación del lóbulo ventral. Esta técnica será valiosa para evaluar los mecanismos de regeneración hepática.
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Protocol
Los peces cebra fueron criados y criados de acuerdo con los procedimientos estándar. Los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Brigham and Women's Hospital (2016N000405). El pez cebra adulto fue ayunado durante 24 h antes del inicio del protocolo. El agua del sistema se refiere al agua en los tanques de alojamiento de pez cebra en la instalación acuática.
1. Preparación y anestesia
- Preparar solución Tricaine al 0,016% en agua del sistema.
PRECAUCIÓN: Tricaine es un irritante si entra en contacto con los ojos, la piel o las vías respiratorias. - Prepare una esponja para sostener el pez cebra anestesiado durante el protocolo de disección. Cortar una esponja completa en cuartos. Con una cuchilla de afeitar, retire una cuña delgada de esponja que corre paralela al eje largo del cuarto de la esponja.
- La rendija debe ser lo suficientemente larga como para acomodar a un pez adulto (esto variará entre los diferentes tamaños de los peces). Por ejemplo, para un pez adulto de 35 mm de longitud, la longitud de la rendija debe ser de 20 mm. La cabeza y el cuerpo se sostienen cómodamente en la esponja, pero la cola corre más allá del borde de la esponja (Figura 1B).
- Remoje la esponja en solución Tricaine al 0.016%.
- Colocar el pez cebra adulto (ya sea macho o hembra) en 625 mL de solución tricaína al 0,016%.
- Incubar durante 6 minutos o hasta que el pescado no responda al tacto.
- Usando fórceps, retire cuidadosamente el pez del tanque Tricaine y coloque el lado ventral del pez en el surco de la esponja (Figura 1A - B).
- Coloque la esponja bajo un microscopio de disección con iluminación de arriba hacia abajo.
2. Cirugía
- Usando fórceps finos, pellizcar la piel y las escamas medialmente, justo después del corazón (Figura 1B).
- Usando tijeras cargadas de resorte, haga un corte debajo de las fórceps para crear un agujero en la cavidad corporal (Figura 1C - D). Tenga cuidado de no lesionar el corazón o un vaso sanguíneo importante, ya que esto resultará en un aumento de la mortalidad.
- Usando tijeras con resorte, haga una incisión de 3-4 mm a lo largo del abdomen, procesándolo posteriormente hasta que la incisión llegue a las aletas pélvicas (Figura 1D - E). En este punto, el lóbulo ventral del hígado puede ser visible a través de la incisión.
- Apriete los lados de la esponja con una mano para forzar los órganos viscerales a salir de la cavidad corporal. El lóbulo ventral del hígado será visible en la parte superior del intestino (Figuras 1F,2A-B). El hígado aparecerá como una estructura rosada o naranja extendida sobre el intestino de color marrón dorado. Los animales designados como controles simulados se recuperan en este punto.
- Apriete las brocas finas para que los dos dientes se toquen. Mientras mantiene la presión sobre la esponja, deslice los dientes de las fórceps finas entre el hígado y el intestino (Figura 1G). Tenga cuidado de no perforar el intestino, ya que esto resultará en un aumento de la mortalidad.
- Relaje lentamente la presión sobre las fórceps para que los dientes se alejen unos de otros (Figura 1H). Esta acción de deslizamiento seda los numerosos accesorios de la vena porta entre el lóbulo ventral y el intestino (Figura 2B), y es necesario para eliminar limpiamente el lóbulo ventral. Repita este proceso hasta que se hayan cortado todas las conexiones portales entre el hígado y el intestino.
- Desprenda el lóbulo ventral del intestino usando fórceps finos y corte el lóbulo ventral libre del resto del hígado (Figura 1I).
- Este procedimiento da como resultado una hepatectomía parcial de un tercio(Figura 1J).
3. Recuperación
- Retire cuidadosamente el pez de la esponja y colóquelo en un tanque de agua del sistema.
- Sistema de pipetas de agua sobre las branquias durante unos minutos hasta que el pez está nadando por su cuenta (Figura 1K).
- Monitoree los peces durante 2-4 horas antes de colocarlos de nuevo en el sistema. No alimente a los peces durante 24 h después de la cirugía.
- Monitoree los peces diariamente durante la duración del experimento.
- Con el tiempo, la incisión en la pared del cuerpo se curará naturalmente sin necesidad de suturas(Figura 1L,2C).
4. Análisis del lóbulo ventral a la longitud del intestino
- Eutanasiar a todos los animales destinados a ser analysisados en agua helada durante 10 min hasta que cesen todos los movimientos operculares.
- Retire el pez del agua helada y colóquelo del lado ventral hacia arriba en el surco de una esponja.
- Usando tijeras con resorte, haga una incisión en la pared del cuerpo ventral en la posición anterior-posterior del corazón. Luego haga dos incisiones más que se ejecutan a lo largo del eje anterior-posterior desde la primera incisión hasta las aletas pélvicas. (Figura 2A).
- Despegar la piel y el músculo para revelar los órganos viscerales (Figura 2A).
- Adquiera imágenes fluorescentes y de campo brillante de los órganos viscerales usando un microscopio de epifluorescencia. Este campo de visión incluirá el área donde se resecaron el lóbulo ventral. Debido a que los animales son eutanasiados antes del análisis, este tipo de análisis impide la obtención de imágenes a largo plazo de los mismos peces.
5. Análisis de la relación hígado/peso corporal
- Eutanasiar a todos los animales destinados a ser analysisados en agua helada durante 10 min hasta que cesen todos los movimientos operculares.
- Coloque los peces en un tubo cónico de 50 mL.
- Añadir 25 mL de paraformadehído al 4% en 1x PBS y 0,3% de interpolación al tubo.
PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico, y las soluciones que contienen formaldehído siempre deben procesarse en una campana química. - Nutate durante 48 h a 4 °C.
- Realice cuatro lavados de 10 min en 1x PBS y 0.3% Tween.
- Recupere el pescado con las pez con las pezón de la fuerza, y seque en una toalla de papel.
- Registre el peso de todo el pescado.
- Usando tijeras con resorte, haga una incisión en la pared del cuerpo ventral en la posición anterior-posterior del corazón. Luego, haga dos incisiones más que se ejecuten a lo largo del eje anterior-posterior desde la primera incisión hasta las aletas pélvicas. (Figura 2A).
- Despegar la piel y el músculo para revelar los órganos viscerales (Figura 2A).
- Adquiera imágenes de campo brillante del hígado usando un microscopio de epifluorescencia.
- Diseccione el hígado, colocando los trozos de hígado en un bote de pesaje.
- Registre el peso del hígado.
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Representative Results
Con el fin de examinar el potencial regenerativo del hígado de pez cebra adulto, se realizó hepatectomía parcial (PHX) en el pez cebra adulto. En general, se seleccionaron adultos grandes (30-40 mm de longitud), variando de 1,5-2,5 años. Dentro de los experimentos individuales, los animales fueron seleccionados del mismo tanque, y fueron igualados por edad y tamaño. Como control apropiado, utilizamos las cirugías falsas en las cuales anestesiaron y recibieron al animal una incisión grande en la pared ventral del cuerpo pero fueron recuperados sin quitar ningún tejido. Las tasas de supervivencia para los controles simulados oscilaron entre el 90% y el 100% tanto para el pez cebra macho como para la hembra. Las tasas de supervivencia para los animales PHX se extendió a partir de la 60%-75% para el pez cebra masculino y el 60%-90% para el pez cebra femenino, con todas las muertes ocurriendo en los primeros 24 h que seguían la cirugía.
El patrón oro para cuantificar la recuperación del hígado después de PHX es la relación hígado a peso corporal, o LBR. Este ensayo se ha utilizado tanto para la medición de la recuperación de masa hepática tanto en mamíferos11 como en modelos de pez cebra8. Para cuantificar de forma fiable el peso del hígado, se realizaron mediciones de peso en animales fijos, como se describió anteriormente8. Realizamos mediciones de LBR en el tipo salvaje, pez cebra no herido, y encontramos que como se informó anteriormente8,el pez cebra hembra tenía casi el doble de LBR en comparación con el pez cebra macho (3,3% para el pez cebra hembra y 1,8% para el pez cebra macho)(Figura 3A). Realizamos tanto simulacro como PHX en peces cebra adultos de ambos sexos y analizamos la LBR a los 0 y 7 días después de la lesión (dpi)(Figura 3B). A 0 dpi, los animales simulados tenían un lóbulo ventral claramente visible, mientras que en los animales PHX el lóbulo ventral estaba completamente ausente (Figura 3C). En particular, esto dio lugar a una reducción significativa de la LBR (reducción del 30% en los peces machos, reducción del 20% en los peces hembra) (Figura 3D). En la cohorte de peces analizados a 7 dpi, encontramos que el lóbulo ventral no se había regenerado(Figura 3E),y sin embargo la LBR de PHX y los controles simulados fueron comparables(Figura 3F). Estas mediciones indican que a los 7 dpi, el hígado ha recuperado masa en relación con los controles simulados, presumiblemente por regeneración compensatoria en los lóbulos dorsales, de acuerdo con los informes anteriores8,9.
Decidimos investigar si, dado bastante tiempo, el lóbulo ventral del hígado era capaz de la regeneración. Adulto Tg (fabp10a: CFP-NTR) peces fueron seleccionados para la experimentación, ya que estos peces expresan CFP en hepatocitos, lo que permite la visualización del hígado utilizando microscopía de fluorescencia. Una cohorte de animales fue sujetada al protocolo completo del hepatectomy parcial de un tercio. Los animales fueron analizados a 1 o 36 dpi (Figura 4A). Para cada animal, se midió la relación entre la longitud del lóbulo ventral y el intestino (Figura 4B).
Los animales sometidos a cirugías simuladas tenían un lóbulo ventral prominente que ocupaba el 50%-100% de la longitud del intestino, mientras que los animales sometidos a un tercio de hepatectomía parcial tenían un lóbulo ventral gravemente reducido. Sorprendentemente, muchos animales de hepatectomía parcial a 36 dpi tenían un aumento de la relación entre el lóbulo ventral y el intestino en comparación con los animales de hepatectomía parcial a 1 dpi(Figura 4C). No había aumento en el tamaño del lóbulo ventral en controles del impostor; sin embargo, se observó un aumento estadísticamente significativo en el tamaño del lóbulo ventral después de la recuperación de la hepatectomía parcial (Figura 4D). Observamos que hubo una amplia variación en la respuesta a la cirugía, con algunos animales que no mostraron regeneración, y otros claramente regenerando un lóbulo ventral bien definido (Figura 4E). Estos resultados demuestran que el lóbulo ventral es capaz de regenerar de la resección quirúrgica del hígado en el pez cebra adulto. En conjunto, nuestro trabajo indica que el hígado de pez cebra es capaz de regeneración epimórfica y compensatoria.
Figura 1:El protocolo de hepatectomía parcial. (A)Diagrama de un pez cebra adulto, con los ejes anterior-posterior y dorsal-ventral anotados. (B) Después de la anestesia, un animal se incrusta en una esponja (que se muestra en azul) de modo que está ventral hacia arriba. Las pinzas finas se utilizan para pellizcar la piel justo después del corazón. La esponja no se muestra en los paneles posteriores para mayor claridad. (C) Las tijeras se utilizan para romper la piel justo después del corazón. (D-E) Las tijeras se utilizan en la herida ahora abierta para hacer una incisión de 3-4 mm que va de la anterior a la posterior, terminando justo antes de las aletas pélvicas. (F) Apretar los lados de la esponja hace que los órganos viscerales salgan de la herida más grande. (G) Los fórceps finos con ambos dientes tocando se deslizan entre el lóbulo ventral del hígado y el intestino. (H) Los fórceps están relajados, haciendo que rompan los accesorios de la vena porta entre el hígado y el intestino. Este proceso se repite a lo largo de la longitud del lóbulo ventral. (I-J) El lóbulo ventral se extrae de su extremo posterior, mientras que las tijeras se utilizan para cortar el lóbulo ventral del resto del hígado. (K) El animal se coloca en una cámara de recuperación con agua del sistema, donde recupera la conciencia y se derechos a sí mismo. (L) Con el tiempo, las vísceras se tiran de nuevo en la cavidad corporal y la herida se cura. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Anatomía del pez cebra y recuperación de la hepatectomía parcial. (A) Para el análisis de los órganos viscerales, los animales son eutanasiados y colocados en el lado ventral sobre una esponja. En primer lugar, se realiza una incisión en la posición anterior-posterior del corazón (línea roja). Luego, se generan dos incisiones que recorren el eje anterior-posterior hasta las aletas pélvicas (línea azul). Luego, la piel y los músculos se pelan hacia atrás, revelando los órganos viscerales. Etiquetados son el intestino, el lóbulo ventral del hígado y la vena central en ese lóbulo. (B) Imagen viva de una vista ventral de un pez cebra preparado para el análisis de los órganos viscerales. El lóbulo ventral del hígado está delineado con una línea blanca punteada. El cuadro amarillo en la imagen 2x indica la ubicación de la imagen 8x. Las puntas de flecha blancas indican conexiones de la vena porta entre el intestino y el hígado. (C)Vista ventral de la herida generada por el procedimiento de hepatectomía parcial en los momentos indicados. Con el tiempo, la incisión se cura por completo. Barras de escala, 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:Regeneración compensatoria después de la hepatectomía parcial. (A)Se midieron las proporciones de hígado a peso corporal (LBR) para el pez cebra de tipo salvaje no lesionado. Las hembras de pez cebra tienen casi el doble de LBR en comparación con el pez cebra macho. Los animales femeninos fueron comparados a los animales masculinos usando una prueba de la suma espesa de Wilcoxon, ****p < 0,0001. (B) Esquemático que indica que el pez cebra de tipo salvaje se utilizó para este experimento. Los animales fueron sometidos a hepatectomía simulada o parcial (PHX), y luego se fijaron en 0 o 7 días después de la lesión (dpi). Los animales fijos fueron foto fotodos y sometidos a las medidas de LBR. c,e) Se muestran imágenes representativas de animales sometidos a simulacro o PHX a 0 dpi(C)y 7 dpi(E). Nótese la ausencia completa de los lóbulos ventrales en los animales PHX. Para todas las imágenes, se muestra una vista ventral de los órganos viscerales. Las imágenes son imágenes de campo brillante. El lóbulo ventral del hígado está delineado en blanco. Barras de escala, 500 μm. (D,F) Gráficos de barras del hígado a las proporciones de peso corporal para el pez cebra macho y hembra después de cirugías simuladas y PHX a 0 dpi(D)y 7 dpi(F). La altura de la barra es el valor medio, y las barras de error representan SEM. Mientras que hay una reducción en LBR después de la hepatectomía parcial a 0 dpi, no hay diferencia significativa entre PHX y animales simulados a 7 dpi, lo que indica la restauración de LBR. Las muestras parciales del hepatectomy fueron comparadas a los controles del impostor usando una prueba espesa de la suma de Wilcoxon, ns = no significativo, *p < 0,05, **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:El pez cebra puede regenerar sus lóbulos ventrales después de la hepatectomía parcial. (A) Esquema que indica que Tg (fabp10a: CFP-NTR) se utilizaron para este experimento. La cirugía y el análisis por proyección de imagen fueron realizados en los timepoints indicados. (B)Una imagen de ejemplo para demostrar cómo se analizaron los animales. Los animales se cuantificaron midiendo la longitud del lóbulo ventral (en rojo), la longitud del intestino (en amarillo) y calculando el porcentaje del intestino que ocupa el lóbulo ventral (en blanco). (C)Se muestra una imagen representativa de animales sometidos a hepatectomía simulada o parcial (PHX) a los 1 y 36 días después de la lesión (dpi). (D) Gráficas de violín de la relación entre la longitud del lóbulo ventral y la longitud del intestino para los animales sometidos a hepatectomía simulada o parcial a 1 y 36 ppp. Cada punto representa el valor de un solo pez. Los valores para los peces machos están en azul, los peces hembra en rojo. Las muestras parciales del hepatectomy fueron comparadas a los controles del impostor usando una prueba espesa de la suma de Wilcoxon, ns = no significativo, *p < 0,05. (E)Se muestran dos ejemplos de animales hepatectomía parcial a 36 dpi que no se regeneraron, y dos ejemplos que sí se regeneraron. Para todas las imágenes, se muestra una vista ventral de los órganos viscerales. Las imágenes son una fusión de una imagen de fluorescencia CFP y una imagen de campo brillante. La fluorescencia CFP sólo está presente en el hígado. El lóbulo ventral del hígado está delineado en rojo. El porcentaje del intestino que ocupa el lóbulo ventral está en blanco. Barras de escala, 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
Las diferencias anatómicas entre el pez cebra y los modelos de mamíferos para la regeneración hepática presentan desafíos únicos para la resección hepática. El hígado en el pez cebra está muy cerca del corazón y el intestino; inadvertidamente dañando cualquier órgano da lugar a mortalidad creciente. El hígado del pez cebra no está encapsulado, por lo que es más difícil separarse del intestino. El hígado recibe sangre rica en nutrientes del intestino a través de las venas porta. En los mamíferos, las venas que salen del intestino convergen en una vena porta primaria que luego se divide a medida que entra en el hígado12. En contraste, el hígado del pez cebra recibe la circulación portal de una serie de pequeños vasos que se mueven directamente desde el intestino hacia el hígado (Figura 2B). Por lo tanto, cada lóbulo del hígado, aplanado sobre el intestino, está firmemente unido al intestino por estos vasos. Intentar extirpar el lóbulo ventral sin antes cortar las venas porta a menudo puede resultar en una resección incompleta (datos que no se muestran). Algunos de los protocolos iniciales describen la extracción del lóbulo ventral a través de una incisión relativamente menor, lo que no permite cortar estos accesorios del portal5,6.
El protocolo descrito aquí se diseña para dirigir estos desafíos para permitir retiro constante del lóbulo ventral. Los peces cebra anestesiados se colocan cómodamente en el surco de la esponja para mantener sus branquias húmedas y sus cuerpos inmóviles durante la duración del procedimiento. Pellizcar la piel justo después del corazón permite colocar una incisión en la piel sin dañar ninguno de los órganos internos. La apertura de una incisión grande (3-4 mm) hace que la extracción del hígado y la evaluación del grado de extracción sean sencillas (Figura 2C). Es importante destacar que el pez cebra puede recuperarse y, en última instancia, curar una herida de este tamaño sin ningún cierre de herida primaria. Al apretar la esponja y comprimir la pared del cuerpo, los órganos viscerales se vuelven más accesibles y es posible deslizar los dientes de un tórceps entre el hígado y el intestino. Los desórceps se pueden utilizar para cortar las conexiones porta entre el hígado y el intestino. Una vez que esto se ha logrado, se pueden usar pórceps finos para pelar el lóbulo ventral para que se pueda separar del resto del hígado.
Medimos el hígado a los ratios del peso corporal (LBR) de los animales sujetados a las cirugías del impostor y de PHX. Encontramos que por 7 dpi, el LBR de los animales PHX era comparable a los controles (Figura 3F). Dado que el lóbulo ventral no se había regenerado en este punto(Figura 3E),se dedujo que la regeneración se produjo mediante compensación en los lóbulos dorsales. Para abordar la cuestión de si el lóbulo ventral puede regenerarse en última instancia en el pez cebra, realizamos PHX y examinamos el re-crecimiento del hígado. En promedio, la relación entre la longitud del lóbulo ventral y el intestino fue mayor a 36 dpi que a 1 dpi, lo que indica la regeneración del lóbulo ventral (Figura 4C-D). Existe una amplia variación en la respuesta animal a las lesiones, con algunos animales experimentando muy poco crecimiento y otros experimentando una recuperación sustancial del lóbulo ventral (Figura 4E). Concluimos que el hígado puede regenerarse con una mezcla de regeneración epimórfica del lóbulo ventral y regeneración compensatoria en los lóbulos dorsales, aunque en diferentes escalas de tiempo. Como estudios previos han utilizado hepatectomies parciales para ensayar el papel de los genes individuales5,7,9 y las vías de señalización6,8,10 después de la resección, anticipamos que este protocolo avanzará nuestra comprensión de los mecanismos moleculares y celulares de la regeneración hepática en un vertebrado adulto.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
I.M.O. es compatible con el NIAAA (F32AA027135). W.G. cuenta con el apoyo de R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 y el Programa Claudia Adams Barr para la Excelencia en la Investigación del Cáncer. W.G. es un Pew Scholar en Ciencias Biomédicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
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