Summary
يتم تقديم بروتوكول لاستخراج المحتوى الكلي للدهون من جدار الخلية من مجموعة واسعة من البكتيريا الفطرية. وعلاوة على ذلك، يتم عرض بروتوكولات استخراج وتحليل أنواع مختلفة من الأحماض الميكوليك. كما يتم توفير بروتوكول كروماتوغرافي طبقة رقيقة لرصد هذه المركبات البكتيرية mycobacterial.
Abstract
يمكن أن تختلف أنواع البكتيريا الفطرية عن بعضها البعض في معدل النمو ، ووجود التصبغ ، ومورفولوجيا المستعمرة المعروضة على الوسائط الصلبة ، بالإضافة إلى الخصائص الظاهرية الأخرى. ومع ذلك ، لديهم جميعا في الطابع المشترك الأكثر صلة من البكتيريا الفطرية : جدار الخلية فريدة من نوعها ومائية للغاية. تحتوي أنواع الميكوباكتيريا على مركب مرتبط بالغشاء التكافؤي يتضمن الأرابينوغالاكتان والببتيدوغليكان والسلاسل الطويلة من الأحماض الميكوليكية مع أنواع تختلف بين أنواع البكتيريا الفطرية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنتج البكتيريا الفطرية أيضا الدهون الموجودة، غير المرتبطة بشكل مشترك، على أسطح خلاياها، مثل phthiocerol dimycocerosates (PDIM)، الجليكوليبيدات الفينولية (PGL)، glycopeptidolipids (GPL)، أسيلترهالوس (AT)، أو المانوسيدات فوسفاتيل-إينوزيتول (PIM)، من بين أمور أخرى. ويعتبر بعضها عوامل الفوعة في البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض، أو الدهون المضادة للجينات الحرجة في التفاعل بين البكتيريا الفطرية المضيفة. لهذه الأسباب ، هناك اهتمام كبير في دراسة الدهون الفطرية بسبب تطبيقها في العديد من المجالات ، من فهم دورها في مسببات الأمراض في عدوى البكتيريا الفطرية ، إلى تأثير محتمل كعوامل مناعية لعلاج الأمراض المعدية وغيرها من الأمراض مثل السرطان. هنا ، يتم تقديم نهج بسيط لاستخراج وتحليل محتوى الدهون الكلي وتكوين حمض الميكوليك لخلايا البكتريا التي تزرع في وسط صلب باستخدام خليط من المذيبات العضوية. بمجرد الحصول على مستخلصات الدهون ، يتم إجراء الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC) لمراقبة المركبات المستخرجة. يتم إجراء تجربة المثال مع أربعة بكتيريا مختلفة: بروماي Mycolicibacterium البيئية سريعة النمو و Mycolicibacterium fortuitum ، و Mycobacterium bovis Calmillus-Guérin (BCG) ، ومسبب الأمراض الانتهازي سريع النمو Mycobacterium abscessus ، مما يدل على أن الأساليب الموضحة في البروتوكول الحالي يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من البكتيريا الفطرية.
Introduction
Mycobacterium هو جنس الذي يضم الأنواع المسببة للأمراض وغير المسببة للأمراض، تتميز وجود جدار الخلية مسعور للغاية وغير منفذة التي شكلتها الدهون غريبة. على وجه التحديد، جدار الخلية الفطرية يحتوي على الأحماض الميكوليكية، وهي α الألكيل والأحماض الدهنية β هيدروكسي، التي α فرع ثابت في جميع الأحماض الميكوليكية (باستثناء طول) وسلسلة β، ودعا سلسلة meromycolate، هي سلسلة طويلة اليفيتكي التي قد تحتوي على مجموعات كيميائية وظيفية مختلفة وصفها جنبا إلى جنب مع الأدب (α، α،، ميثوكسي، κ-، الايبوكسي،، كاربوكسي-، وω-1-ميثوكسي-ميكولات)، وبالتالي إنتاج سبعة أنواع من الأحماض الميكوليك (I-VII)1. وعلاوة على ذلك، الدهون الأخرى ذات أهمية لا يرقى إليها الشك موجودة أيضا في جدار الخلية من الأنواع المتفطرة. الأنواع المسببة للأمراض مثل Mycobacterium tuberculosis, العامل المسبب لمرض السل2 إنتاج عوامل محددة للفوعة القائمة على الدهون مثل ديميكوسيروسات phthiocerol (PDIMs)، الجليكوليبيد الفينولية (PGL)، دي، ثلاثي، وبينتا أسيلترهالوس (DAT، TAT، وبات)، أو sulfolipids، من بين أمور أخرى3. وقد ارتبط وجودها على سطح البكتيريا الفطرية مع القدرة على تعديل الاستجابة المناعية المضيف، وبالتالي، تطور واستمرار البكتيريا الفطرية داخل المضيف4. على سبيل المثال ، ارتبط وجود triacylglycerols (TAG) مع النمط الظاهري المفرط للفيروسات من النسب الفرعي 2 - بكين من M. tuberculosis, ربما بسبب قدرتها على توهين الاستجابة المناعية المضيف5,6. الدهون الأخرى ذات الصلة هي lipooligosaccharides (LOSs) موجودة في البكتيريا الفطرية السل وغير المسببة للركل. في حالة Mycobacterium marinum، يرتبط وجود LOSs في جدار الخلية الخاص به بحركية انزلاقية والقدرة على تشكيل الأغشية الحيوية ويتداخل مع التعرف عليه من قبل مستقبلات التعرف على نمط الضامة ، مما يؤثر على امتصاص والقضاء على البكتيريا عن طريق الخلايا الفواجية المضيفة7,8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن غياب أو وجود بعض الدهون يسمح لأعضاء من نفس النوع بتصنيفهم إلى أنواع مورفوتية مختلفة مع ملامح خبيثة أو مخففة عند التفاعل مع الخلايا المضيفة. على سبيل المثال، غياب الجليكوبيدوليبيدات (GPL) في شكل مورفو نوع الخام من Mycobacterium abscessus وقد ارتبط مع القدرة على الحث على تحمض داخل الphagosomal، وبالتالي موت الخلايا المبرمج9، على عكس النمط المورفوتيب السلس الذي يمتلك ال جي بي ال في سطحه. وعلاوة على ذلك، يرتبط محتوى الدهون من جدار الخلية البكتيرية إلى القدرة على تعديل الاستجابة المناعية في المضيف. هذا هو ذات الصلة في سياق استخدام بعض البكتيريا الفطرية لتحريك ملف المناعة واقية ضد أمراض مختلفة10,11,12,13. وقد ثبت، على سبيل المثال، أن Mycolicibacterium vaccae، و mycobacterium saprophytic ، الذي هو حاليا في المرحلة الثالثة التجارب السريرية كلقاح العلاج المناعي لمرض السل ، وعرض اثنين من الأنواع المورفولوجية الاستعمارية. في حين أن النمط الظاهري السلس ، الذي يحتوي على البوليستر في سطحه ، يؤدي إلى استجابة Th2 ، فإن النمط الظاهري الخام الخالي من البوليستر يمكن أن يحفز ملف Th1 عندما يتفاعل مع الخلايا المناعية المضيفة14. ذخيرة من الدهون الموجودة في الخلية الفطرية لا يعتمد فقط على الأنواع المتفطرة، ولكن أيضا على ظروف الثقافات الفطرية: وقت الحضانة15,16 أو تكوين الوسط الثقافي17,18. في الواقع ، تؤثر التغيرات في التركيبة المتوسطة للثقافة على النشاط المضاد للمناعة والمناعة M. bovis BCG و Mycolicibacterium brumae in vitro17. وعلاوة على ذلك، فإن الشخصية المناعية الواقية الناجمة عن M. bovis BCG ضد M. tuberculosis التحدي في نماذج الفئران يعتمد أيضا على وسائل الإعلام الثقافية التي M. bovis BCG ينمو17. ويمكن بعد ذلك أن تكون هذه ذات صلة لتكوين الدهون من البكتيريا الفطرية في كل حالة الثقافة. لجميع هذه الأسباب ، فإن دراسة محتوى الدهون من البكتيريا الفطرية ذات الصلة. يتم تقديم إجراء بصري لاستخراج وتحليل تكوين الدهون من جدار الخلية البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. استخراج مجموع الدهون غير المرتبطة بالتساهم من البكتيريا الفطرية (الشكل 1)
- خدش 0.2 غرام من البكتيريا الفطرية من وسائل الإعلام الصلبة وإضافة إلى أنبوب زجاجي مع قبعات بوليتيترافلورويثلين (PTFE) بطانة المسمار. إضافة محلول يتكون من 5 مل من الكلوروفورم و 10 مل من الميثانول (الكلوروفورم: الميثانول، 1:2).
ملاحظة: عند استخدام المذيبات العضوية، يجب استخدام متلقي الزجاج فقط. لا يسمح بحاويات بلاستيكية. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى قبعات PTFE بطانة المسمار للزجاجات.
تنبيه: الكلوروفورم مادة يحتمل أن تكون سامة وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: الميثانول مادة قد تكون سامة وخطرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل). - اترك الأنبوب في إثارة مستمرة بين عشية وضحاها لاستخراج الدهون غير المرتبطة بالتساهمية من سطح الخلية البكتيرية mycobacterial.
ملاحظة: إذا لم تتوفر منصة اهتزاز مدارية، يمكن استبدال التحريك المستمر بالتحريك اليدوي الدوري قدر الإمكان. - قم بتغطية قمع زجاجي بورق فلتر، وتصفية المذيبات العضوية، وجمعها في أنبوب زجاجي.
- استخدام تدفق غاز النيتروجين لتتبخر المرحلة السائلة في الأنبوب. ملء أنبوب مع غاز النيتروجين، وتغطي وتخزينه في 4 °C.
ملاحظة: توصيل ماصة باستور الزجاج إلى تيار من غاز النيتروجين لتتبخر على وجه التحديد الأنبوب المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، الحفاظ على أنبوب داخل سخان كتلة جافة للأنابيب في 37 درجة مئوية. عندما يتبخر المذيب، املأ الأنبوب بغاز النيتروجين قبل إغلاقه. - إضافة 15 مل من محلول الكلوروفورم:الميثانول (2:1) إلى الحطام الخلوي. اترك الأنبوب في إثارة مستمرة بين عشية وضحاها لاستخراج الدهون غير المرتبطة بالتساهمية من سطح الخلية البكتيرية mycobacterial.
ملاحظة: إذا لم تتوفر منصة اهتزاز مدارية، يمكن استبدال التحريك المستمر بالتحريك اليدوي الدوري قدر الإمكان. - دع الخليط يستريح لمدة ساعة واحدة. مع ماصة باستور، واستعادة المذيبات العضوية. قم بتغطية قمع زجاجي بورق فلتر وتصفية المذيبات العضوية وجمعها في نفس الأنبوب الزجاجي المستخدم سابقا في الخطوة 1.3. استخدام تدفق غاز النيتروجين لتتبخر المرحلة السائلة في الأنبوب. ملء أنبوب مع غاز النيتروجين، وإغلاقه وتخزينه مرة أخرى في 4 °C.
2. استخراج حمض الميكوليك بواسطة الميثانول الحمضي (الشكل 2A)
- إضافة 2-5 مل من حل استيرifying في أنبوب زجاجي محكم مع غطاء المسمار بطانة PTFE. إضافة 0.2 غرام من الكتلة الحيوية mycobacteria في أنبوب زجاجي.
ملاحظة: يتم تشكيل محلول استيرينغ عن طريق خلط 30 مل من الميثانول، و 15 مل من التولوين، و 1 مل من حمض الكبريتيك. يمكن أخذ خلايا البكتريا الفطرية من الثقافات الصلبة أو، حتى من الخلايا الهذيانية بعد إجراء استخراج إجمالي الدهون غير المرتبطة بالتساهمية من البكتيريا الفطرية (الخلايا المتبقية بعد التصفية في الخطوة 1.6).
تنبيه: الولوين مادة قابلة للاشتعال وخطرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: حمض الكبريتيك مادة مسببة للتآكل وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل). - امزج المحتوى عن طريق الدوامة. دع الخليط يقف داخل حمام جاف عند 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- السماح للأنبوب لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة ومن ثم إضافة 2 مل من n-hexane إلى الأنبوب. امزج المحتويات عن طريق الدوامة لمدة 30 s واترك الأنبوب يستقر حتى تظهر مرحلتان واضحتان.
تنبيه: n-hexane هو مادة قابلة للاشتعال ومهيجة ومدمرة بيئيا وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل). - استعادة المرحلة العليا المقابلة لمرحلة n-hexane. نقلها إلى أنبوب جديد.
- كرر الخطوة 2.3. استعادة المرحلة العليا مرة أخرى ونقله إلى نفس الأنبوب المستخدمة في الخطوة 2.4.
- تتبخر محتويات الأنبوب باستخدام تدفق غاز النيتروجين. ملء أنبوب مع غاز النيتروجين، وإغلاقه، وتخزينه في 4 درجة مئوية.
3. استخراج حمض الميكوليك عن طريق النسغ والمثيلة (الشكل 2B)
- خدش 0.2 غرام من البكتيريا الفطرية من وسائل الإعلام الصلبة وإضافة إلى أنبوب زجاجي مع غطاء المسمار PTFE.
- أضف 2 مل من محلول الميثانول والبنزين (80:20) الذي يحتوي على هيدروكسيد البوتاسيوم بنسبة 5٪. خلط محتويات دوامة. سخني الخليط لمدة 3 ح عند 100 درجة مئوية.
تنبيه: البنزين مادة قابلة للاشتعال ومسرطنة وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل). - السماح للأنبوب لتبرد لدرجة حرارة الغرفة. إضافة 20٪ حمض الكبريتيك لتحمض العينات لتحقيق درجة الحموضة = 1.
- إضافة 3 مل من الأثير ديثيل. مزيج بلطف محتويات دوامة.
- دع المرحلتين تتشكلان عن طريق التسوية. استعادة مرحلة الأثير ديثيل ونقل إلى أنبوب جديد. كرر خطوة الغسيل لما مجموعه ثلاث مرات.
- غسل استخراج الأثير diethyl مع 2 مل من الماء المقطر ونقل الجزء العلوي المقابلة الأثير diethyl إلى أنبوب جديد. كرر خطوة الغسيل لما مجموعه ثلاث مرات.
- إضافة 2 غرام من كبريتات الصوديوم اللامائية على استخراج الأثير diethyl لتجفيفه.
- تصفية التعليق. تبخر المحتوى باستخدام تدفق غاز النيتروجين.
- لتنفيذ خطوة الميثيل، حل 3 غرام من اليوريا N-نيتروسو-ن-ميثيل في محلول مبرد مسبقا شكلتها 45 مل من الأثير ديثيل و 9 مل من 40٪ KOH في الماء المقطر.
تنبيه: N-نيتروسو-N-ميثيل يوريا مادة سامة، مهيجة، مسرطنة، وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل). - نقل supernatant (diazomethane) إلى قارورة جديدة تبريدها في الثلج التي تحتوي على حبيبات هيدروكسيد البوتاسيوم (حوالي 30 غرام).
ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الناسخة الفائقة على الفور، يمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية بحد أقصى 1 ساعة.
تنبيه: الكريات هيدروكسيد البوتاسيوم هي مادة مهيجة وتآكل. يجب استخدام هذه المواد في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تحذير: ديازوميثان شديد السمية ويحتمل أن يكون متفجرا. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح مع زجاج الأمان ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل). - إضافة 2 مل من محلول الأثير التي تحتوي على diazomethane, التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.10, في استخراج الأثير ديثيل المجففة التي تحتوي على الأحماض الميكوليك, التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.8. حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تبخر التعليق عند 40 درجة مئوية. ملء أنبوب مع غاز النيتروجين، وإغلاقه، وتخزين الدهون الميثيلية في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تبخر الديازوميثان من محلول الأثير تحت غطاء تدفق صفح، حتى يفقد الأثير اللون الأصفر.
4. طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا (TLC) تحليل
- تشبع غرفة TLC الزجاج. للقيام بذلك، قم بتغطية أحد جدران غرفة TLC بقطعة من ورق التصفية والسماح لها بالتواصل مع المرحلة المتنقلة المكونة من خليط المذيبات. ضع الحجم المتبقي للمذيب في الجزء السفلي من غرفة TLC.
ملاحظة: يجب تغطية الجزء السفلي من غرفة TLC بما لا يقل عن 1 سم من مرحلة التنقل. وفي التجارب الحالية، استخدمت مراحل متنقلة مختلفة لتطوير مراكز TLCs. وتألفت من 85 مل من n-hexane بالإضافة إلى 15 مل من الأثير diethyl; 100 مل من ثنائي كلورو الميثان؛ 90 مل من الكلوروفورم و10 مل من الميثانول و1 مل من الماء؛ 30 مل من الكلوروفورم، بالإضافة إلى 8 مل من الميثانول، و1 مل من الماء؛ 60 مل من الكلوروفورم، بالإضافة إلى 35 مل من الميثانول، و8 مل من الماء؛ 95 مل كلوروفورم زائد 5 مل من الميثانول؛ و 90 مل من الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية) بالإضافة إلى 10 مل من الأثير ديثيل.
ملاحظة: في TLC ثنائي الأبعاد، استخدم n-hexane:acetone (95:5) في الاتجاه الأول ثلاث مرات، واستخدم تطورا واحدا مع toluene:acetone (97:3) في الاتجاه الثاني لتحليل تكوين حمض الميكوليك. لتحليل PIMs، استخدم الكلوروفورم:الميثانول:الماء (60:30:6) في الاتجاه الأول مرة واحدة، واستخدام الكلوروفورم:حمض الخليك: الميثانول: الماء (40:25:3:6) في الاتجاه الثاني. لتحليل PDIM وAG، استخدم الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية): خلات الإيثيل (98:2) في الاتجاه الأول ثلاث مرات، واستخدم تطورا واحدا مع الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية): الأسيتون (98:2) في الاتجاه الثاني.
تنبيه: الأثير Diethyl هو مادة سامة وخطرة محتملة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: ثنائي كلورو الميثان مادة سامة وخطرة محتملة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: الأثير البترولي هو مادة قابلة للاشتعال وضارة بالبيئة وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: حمض الخليك هو مادة قابلة للاشتعال والتآكل المحتملة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: خلات الإيثيل هي مادة قابلة للاشتعال وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: الأسيتون مادة قابلة للاشتعال وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل). - أغلق غرفة TLC لتشبعها لمدة 20 دقيقة على الأقل. وفي الوقت نفسه، حل الدهون الموجودة في أنبوب زجاجي في 0.2-1 مل من الكلوروفورم.
ملاحظة: يمكن تعديل الحجم المستخدم لإذابة الدهون اعتمادا على التركيز المطلوب أو المتوقع للعينة. - تطبيق 10 ميكرولتر من كل تعليق باستخدام أنبوب زجاجي الشعرية مباشرة على لوحة TLC والسماح للعينة الجافة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب تطبيق عينات في الجزء السفلي من لوحة ترك 1 سم على كل جانب. يجب فصل العينات عن الأخرى لمدة 0.5 سم على الأقل. بمجرد تطبيق العينة على اللوحة ، يمكن تبخر الأنابيب مرة أخرى مع غاز النيتروجين وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمزيد من الاستخدام. - أدخل اللوحة في غرفة TLC المشبعة التي تحتوي على المرحلة المتنقلة. السماح لمرحلة المحمول لتشغيل من خلال TLC.
ملاحظة: أي حركة تطبق على غرفة TLC يؤثر على المذيبات قيد التشغيل على لوحة ويؤثر على حركة الدهون. وفي حالة أداء TLC ثنائي الأبعاد، يلزم وجود غرفتين من غرف TLC لاحتواء نظامي elution. - قم بإزالة اللوحة من غرفة TLC عندما يصل المذيب إلى مسافة 1 سم من الطرف العلوي من اللوحة. اترك الطبق تحت تدفق الصفيحة حتى يجف السيليكا تماما.
ملاحظة: في حالة تحليل تكوين حمض الميكوليك، باستخدام n-hexane و diethyl-ether (85:15)، كرر الخطوتين 4.4 و 4.5 مرتين أكثر، حتى تشغيل المرحلة المتنقلة ثلاث مرات على لوحة TLC. - كشف لوحة مع وصمة عار المطلوبة. سخني اللوحة إذا لزم الأمر.
ملاحظة: في هذه التجربة، استخدمت 15-20 مل من الحلول التالية لرش لوحات TLC: 10٪ هيدرات حمض موليبداتوفوسفوريك في الإيثانول حتى تصبح اللوحة صفراء زاهية، تليها تسخين اللوحة عند 120 درجة مئوية. 5٪ في الإيثانول من 20٪ α-النفثول في حمض الكبريتيك تليها تسخين لوحة في 120 درجة مئوية. الموليبدينوم الأزرق الكاشف (1.3٪ أكسيد الموليبدينوم في 4.2 M حمض الكبريتيك) حتى ظهرت عصابات الفوسفات أو 1٪ من الأثرون في حمض الكبريتيك.
تنبيه: هيدرات حمض موليبداتوفوسفوريك هي مادة قابلة للاشتعال والتآكل. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: الإيثانول مادة قابلة للاشتعال وخطرة محتملة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: 1-نابثول مادة قابلة للاشتعال، تآكل، وخطرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
تنبيه: موليبدنوم الأزرق رذاذ الكاشف هو مادة تآكل، سامة، وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بهدف إظهار مجموعة واسعة من الدهون الموجودة في أنواع مختلفة من البكتيريا الفطرية ، تم اختيار M. bovis BCG لأنها بكتيريا صغيرة خشنة وبطيئة النمو. وأضيفت الخام وسريعة النمو M. الحصون و M. brumae في الإجراء، وأخيرا، تم تضمين مورفوتيب سلس من خراج م. أيضا. تسمح لنا هذه الأنواع الأربعة بتصور طيف واسع من الدهون المشتقة من الميككوباتريا مثل acyltrehaloses (AT) و GPLs و PDIM و PGL و PIM و TDM و TMM. وعلاوة على ذلك، فإن جميع الأنواع الأربعة لديها أنماط حمض الميكوليك المختلفة.
بعد تنفيذ بروتوكولات استخراج حمض الميكوليك، تم تحليل مقتطفات الدهون من خلال تحليل 1D-TLC باستخدام نظامين مختلفين، صالحين بنفس القدر، elution (الشكل 3A، B). المرحلة الأولى من الهاتف المحمول(الشكل 3A)كانت تتألف من n-hexane و diethyl-ether (85:15)، وتم تشغيل اللوحة ثلاث مرات. وتألفت المرحلة المتنقلة الثانية من 100٪ من ثنائي كلورو الميثان، وكان مطلي مرة واحدة(الشكل 3B). في كل من نظم elution، وتقع الأحماض الميكوليك تقريبا في منتصف لوحة TLC من أصل تطبيق العينة. وكما يبين الشكل 3، فإن م. بروماي لا يملك سوى أحماض الميكوليك من النوع الأول، وهو حمض ميكوليك موجود في جميع أنواع البكتريا. م. بوفيس BCG لديه نوع الأول والرابع، M. من نوع الحصوت الأول والخامس، و M. خراج،نوع الأول والثاني ملامح الأحماض الميكوليك. يسمح لنا إجراء نوعين من إجراءات الميثيل بتأكيد وجود حمض الميكوليك من النوع الخامس لأن حمض الميكوليك من النوع الخامس مشقوق أثناء إجراء الميثانول الحمضي. وكما يبين الشكل 3، لم يلاحظ إلا بعد إجراء التشجير البقعة المقابلة لحامض الميكوليك من النوع الخامس. بعد الميثانول، أظهرت TLC المركبات المشتقة من نوع V الانقسام التي هاجرت بالقرب من نقطة التطبيق19. للباحثين neophyte، 2D-TLC يمكن أن تسمح لطريقة تكميلية لتحديد كل نوع حمض الميكوليك(الشكل 3C،D). يجب تشغيل مستخلصات حمض الميكوليك أولا في نظام elution الذي تشكله الأثير النفطي (60-80 درجة مئوية) والأسيتون (95:5) ثلاث مرات. ثم، يجب تشغيل لوحة في الاتجاه الثاني مع مرحلة متنقلة شكلتها toluene والأسيتون (97:3). 2D-TLC جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي (MS) وقد استخدمت لتحديد وتوصيف كيميائيا المجموعات الوظيفية من الأحماض الميكوليك واستخدمت على نطاق واسع لتوصيف الأحماض الميكوليك20,21,22. لذلك ، فإن نمط حمض الميكوليك هو واحد من السمات الكيميائية الحيوية للقيمة في التقييم المنهجي للبكتيريا الميكوبكتيرية بالاقتران مع التحليلات الأخرى بسبب أنماط حمض الميكوليك المشتركة بين الأنواع المختلفة.
بعد إجراء الإجراء المذكور أعلاه لاستخراج الدهون المرتبطة غير التساهمية ، تم اختيار أنظمة elution مختلفة في وظيفة قطبية وحجم الملف الشخصي للدهون الموجودة في خلايا البكتيريا الفطرية. وينبغي أن مزيج مثالي من المذيبات في نظم elution تمكين تصور الدهون المطلوبة في المنطقة الوسطى من لوحة TLC لتسهيل تنقية مزيد من، إذا رغبت في ذلك. في الشكل 4، يتم طلب لوحات TLC من نظام الغيض الذي يسمح بمراقبة الدهون الأكثر قطبية(الشكل 4A)إلى نظام elution الذي يسمح بتصور معظم الدهون القطبية(الشكل 4E).
أسيل glycerols (AG) وPDIMs هما من أكثر الدهون القطبية الموجودة في جدار الخلية البكتيرية ويتم تصورها بسهولة من خلال تحليلات 1D-TLC باستخدام مرحلة متنقلة شكلتها الأثير البترولية: الأثير ديثيل (90:10). ويبين الشكل 4 ألف أن مجموعات AGs كانت موجودة في M. bovis BCG، M. فورتيوم و M. brumae ولكن ليس في مورفوتيبي السلس من M. خراج. على الرغم من أن 1D-TLC اقترح وجود PDIM في M. bovis BCG و M. الحصوت ،إلا أنه تم تأكيده فقط في M. bovis BCG عندما تم إجراء تحليل 2D-TLC(الشكل 4B). وإجمالا، تبين هذه النتائج أهمية تأكيد وجود مركب بكتيري من قبل نظامين مختلفين على الأقل من نظم الإلتواء. آخر الدهون مثيرة للاهتمام لتحليل في تكوين البكتيريا الفطرية هو PGL. في البكتريا المختارة ، PGL موجود فقط في M. bovis BCG ، ومن الملاحظ عندما يتم إلوتيد TLC مع نظام elution يتكون من الكلوروفورم والميثانول (95:5) (الشكل 4C). بعد فكرة تصور المزيد من المكونات القطبية ، تم استخدام نظام الغبطة المكون من خليط 90:10:1 (الكلوروفورم: الميثانول: الماء) لرصد وجود GPLs (الشكل 4D) ، والتي توجد فقط في M. خراج المورفوتايب السلس. في نفس TLC: PGL، تريهالوز ديميكولات (TDM)، أسيل تريهالوس (AT)، وتريهالوز مونوميكولات (TMM)، ويمكن أيضا أن يلاحظ. PGL، GPLs، TDM، AT لوحظ أيضا في الجزء العلوي من لوحة عندما يتكون نظام elution من 30:8:1 (الكلوروفورم:الميثانول:الماء) (الشكل 4E). يقع TMM في منتصف لوحة. تم التعبير بوضوح عن TDM و TMM في جميع البكتيريا الفطرية التي تمت دراستها. على الرغم من الفوسفاتيديل-إينوزيتول mannosides (PIMs) لوحظ في الجزء السفلي من لوحة, أفضل نظام elution لتحليل PIMs هو 60:35:8 (الكلوروفورم:الميثانول:الماء) كما هو مبين في الشكل 5A,B. في حين يتم الكشف عن جميع الدهون المحتوية على السكر مع anthrone (الشكل 5A)، PIMs تحتوي على مجموعات الفوسفات التي يتم الكشف عنها على وجه التحديد مع المسكرات الأزرق الموليبدينوم (الشكل 5B). على غرار الأحماض الميكوليكية، AG، وPDIMs، يمكن أيضا تصور PIMs بسهولة من خلال تحليلات 2D-TLC(الشكل 5C). وعلاوة على ذلك، في حالة تحليل البكتيريا الفطرية التي هي قادرة على توليف LOSS، سيتم تمييز PIMs وLOSS باستخدام نفس نظامelution 2D، كما هو مفصل في رين وآخرون.
الشكل 1: مخطط الإجراء لاستخراج محتوى الدهون من البكتيريا الفطرية نمت على وسائل الإعلام الصلبة. الخطوات الرئيسية لفك الدهون الموجودة على خلايا البكتيريا الفطرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط الإجراء لاستخراج محتوى حمض الميكوليك من البكتيريا الفطرية نمت على وسائل الإعلام الصلبة. الخطوات الرئيسية لفك الأحماض الميكوليك موجودة على خلايا البكتريا باستخدام إما (أ) الميثانول الحمضي أو (ب) السابونيشن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج التمثيلية لاستخراج الدهون من البكتيريا الفطرية. تحليل الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC) من الأحماض الميكوليك المتقدمة في (A) 85 مل من n-hexane، بالإضافة إلى 15 مل من الأثير ديثيل (ثلاثة أشواط)، و (ب) 100 مل من ثنائي كلورو الميثان. (ج)تحليل ثنائي الأبعاد TLC من الأحماض الميكوليك المستخرجة من الميثانول الحمضي وضعت في 95:5 (ن هيكسان: الأسيتون) (ثلاثة أشواط) في الاتجاه الأول و 97:3 (تولوين: الأسيتون) في الاتجاه الثاني. (د)تحليل ثنائي الأبعاد TLC من الأحماض الميكوليك من M. الحصونية المستخرجة من السابونيشن وضعت في 95:5 (ن هيكسان: الأسيتون) (ثلاثة أشواط) في الاتجاه الأول و 97:3 (toluene:الأسيتون) في الاتجاه الثاني. تم الكشف عن TLCs مع 10٪ هيدرات حمض الموليبداتوفوسفوريك في الإيثانول تليها تسخين لوحة في 120 درجة مئوية م. بوفيس BCG كونوت (الخط 1 و 1')؛ م. الحصوت (الخطان 2 و2')؛ م. خراج المورفوتايب السلس (الخط 3 و3') و M. brumae (الخط 4 و 4'). 1-4 الأحماض الميكوليك التي تم الحصول عليها عن طريق حمض الميثانول و 1'-4'الأحماض الميكوليك التي تم الحصول عليها عن طريق التصب. أنا، α- المايكولات. ثانيا، α'- mycolates؛ IV, كيتوميكولات; V، الايبوكسيميكولات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية لاستخراج الدهون من البكتيريا الفطرية. (A) تحليل TLC من acylglycerols (AG) وphthiocerol dimycocerosates (PDIMs) وضعت في 90:10 (الأثير البترول (60-80 درجة مئوية) :d أثير إيثيل). (ب)تحليل ثنائي الأبعاد TLC من PDIMs وAG وضعت في 98:2 (الأثير البترول (60-80 درجة مئوية): خلات الإيثيل) (ثلاثة أشواط) في الاتجاه الأول و 98:2 (الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية): الأسيتون) في الاتجاه الثاني. (ج)تحليل TLC من الجليكوليبيد الفينولية (PGL) وضعت في 95:5 (الكلوروفورم:الميثانول). (د)تحليلات TLC وضعت في 90:10:1 (الكلوروفورم:الميثانول:الماء) من PGL, جليكوبيبتيدوليبويدس (GPL), تريهالوز ديميكولات (TDM), أسيل تريهالوس (AT), وtrehalose monomycolate (TMM). (ه) تحليل TLC من PGL، GPL، AT، TMM، وفوسفاتيديل إينوزيتول mannosides (PIMs) وضعت في 30:8:1 (الكلوروفورم:الميثانول:الماء). أ-ب-C تم الكشف عن 10٪ هيدرات حمض الموليبداتوفوسفوريك في الإيثانول تليها تسخين لوحة في 120 درجة مئوية-تم الكشف عنE مع 5٪ في الإيثانول من 20٪ α-النفثول في حمض الكبريتيك وتسخينها عند 120 درجة مئوية. السطر 1: م. بوفيس BCG كونوت؛ الخط الثاني: م. من البديهيات؛ خط 3: M. خراج المورفوتايب السلس; الخط 4: م. بروماي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية ل PIMs من البكتيريا الفطرية. (A-B) تحليل TLC من PIMs وضعت في 60:35:8 (الكلوروفورم:الميثانول:الماء). (ج)تحليل ثنائي الأبعاد TLC من PIMs وضعت في 60:30:6 (الكلوروفورم:الميثانول:الماء) في الاتجاه الأول و 40:25:3:6 (الكلوروفورم:حمض الخليك:الميثانول:الماء) في الاتجاه الثاني. A-تم الكشف عنC مع 1٪ من الترون في حمض الكبريتيك تليها تسخين لوحة في 120 درجة مئوية B تم الكشف عنها مع كاشف الأزرق موليبدنوم حتى ظهرت عصابات الفوسفات. السطر 1: م. بوفيس BCG كونوت؛ الخط الثاني: م. من البديهيات؛ خط 3: M. خراج المورفوتايب السلس; الخط 4: م. بروماي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تقديم بروتوكول بسيط يعتبر الطريقة القياسية الذهبية لاستخراج مركبات الدهون غير المرتبطة بشكل غير مكافئ من جدار الخلية البكتيرية mycobacterial. يظهر مزيد من التصور من قبل TLCs أحادية واثنين الأبعاد من الدهون المستخرجة من أربعة بكتيريا مختلفة.
خليطين متتاليين من الكلوروفورم والميثانول لاستعادة المحتوى الدهني للخلايا الميكوبكتيرية هو خليط المذيبات الأكثر استخداما على نطاق واسع23،24،25،26،27،28،29. يسمح هذا الخليط باستعادة مجموعة واسعة من الدهون القطبية والقطبية من الخلايا. ومع ذلك، فقد وصفت بعض الأساليب الأخرى في الأدب لاستخراج الدهون الميكوبكتيرية الكلية أو المحددة،والتي تم مراجعتها مؤخرا من قبل حميد وآخرون. على سبيل المثال ، فإن طريقة Folch هي واحدة من البروتوكولات الأكثر استخداما التي تم تطويرها لاستعادة إجمالي الدهون البكتيرية من الأنسجة30 وتم تكييفها أيضا مع الثقافات البكتيرية النقية. وهو يتألف من تعليق الخلايا البكتيرية في الكلوروفورم: الميثانول (1:2)، تليها الطرد المركزي وإضافة الكلوروفورم للحصول على نسبة 1:1. وأخيرا، يستخدم KCl لإزالة المكونات غير الليبيد من استخراج31. وبالتوازي مع ذلك، تم تطوير بروتوكولات أخرى لاستخراج دهون محددة. Slayden وآخرون. بالإجمال, تستند الأساليب المنشورة على تعريض الخلايا البكتيرية إلى تركيزات مختلفة من المذيبات, الكلوروفورم أساسا والميثانول. وبالمثل، يتم إضافة بعض الأملاح في بعض الأحيان لتجاهل مكونات الخلايا الأخرى الموجودة على العينة.
بالإضافة إلى الدهون غير المرتبطة بشكل غير التكافؤي ، يظهر أيضا استخراج حمض الميكوليك من خلال إجراءين مختلفين. في حين يسمح الميثانول الحمضي باستخراج سهل للأحماض الميكوليكية مع الكواشف الأقل خطورة ، يحافظ إجراء ال saponification على بنية جميع أنواع حمض الميكوليك ، بما في ذلك حمض الميكوليك من النوع الخامس ، والذي يتم شقه أثناء إجراءات الميثانول. بمجرد استخراج الدهون ، 1D - أو TLC 2D هي الطرق القياسية لرصدها ، والمقايسة المستخدمة يختلف تبعا للخصائص الفيزيائية الكيميائية للدهون. سوف القطبية وحجم كل جزيء تحديد اختيار نظام الغبطة اللازمة، مما يسمح لتحديد الدهون التي تشكل جزءا من البكتيريا الفطرية. يمكن اختيار TLC أحادي الأبعاد عندما تكون عوامل الاحتفاظ (Rf) بين الدهون البكتيرية الميكوتيرية مختلفة ، في حين أن 2D-TLC تسهل التصور عندما تشترك الدهون المختلفة في الوزن الجزيئي وخصائص القطبية. لتسهيل تحديد الهوية، ينبغي تشغيل الدهون المنقى بالتوازي مع العينة المستخرجة لمقارنة RF مماثلة. يمكن تحديد الدهون عندما يعمل بنفس التردد الذي يتم به التحكم المنقى المعروف على الأقل في نظامين TLC (مرحلتان متنقلتان مختلفتان). يمكن الحصول على الدهون النقية من الموردين التجاريين أو من مختبرات البحوث البكتيرية mycobacterial. وأخيرا، فإن الطبيعة الكيميائية الحيوية للجزيء تشير إلى البقعة التي يمكن استخدامها للكشف عن لوحات TLC. هناك طرق تلطيخ عالمية ، مثل حمض فوسفوموليبديك الذي يمكن من تصور أي مكون عضوي لأنه يرتبط بروابط الكربون. في حين أن البعض الآخر مثل النفثول أو النذير توفر ألوان محددة لمخلفات السكر، يرتبط الأزرق الموليبدينوم على وجه التحديد بمخلفات الفوسفات.
الاعتبار الأكثر أهمية لتحليل محتوى الدهون من البكتيريا الفطرية هو تجنب استخدام المواد البلاستيكية في جميع أنحاء الإجراءات منذ اتصال المذيبات العضوية مع البلاستيك يمكن أن تلوث العينات ويمكن ملاحظتها في لوحات TLC. ومن المهم أيضا أن تنظر في أن التركيبة المتوسطة الثقافة المستخدمة لزراعة البكتيريا الفطرية، فضلا عن درجة الحرارة أو أيام الحضانة، يمكن تعديل نمط الدهون من كل البكتيريا الفطرية، كما وصف سابقا16. يمكن استخدام البكتيريا الفطرية التي تزرع على وسائل الإعلام السائلة والصلبة لاستخراج الدهون غير التساهمية المرتبطة أو الأحماض الميكوليكية. عند الحصول على خلايا من الاستزراع السائل، يجب تصفيتها وتجفيفها بشكل كاف لتجنب وجود وسائط سائلة في العينة. وعلاوة على ذلك، عند استخدام البكتيريا الفطرية من وسائل الإعلام السائلة، يجب أن تزرع البكتيريا بشكل صحيح وعلى قدم المساواة بين التجارب من أجل الحصول على نتائج قابلة للاستنساخ مع مرور الوقت. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تزرع الخلايا الميكوبكتيرية على pellicles17،33،34،35،36، والتي يمكن استردادها من الدهون الأكثر خارجية باستخدام المذيبات العضوية ورصدها من قبل TLC، كما أظهرنا في هذه المقالة.
القيد الرئيسي لإجراءات استخراج الدهون البكتيرية يبقى استخدام المذيبات السامة في ظل ظروف آمنة. إجراء TLC أقل حساسية من التقنيات الأخرى، مثل الكروماتوغرافيا الغازية أو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء. وعلاوة على ذلك، لا تسمح TLC بتحديد كمية العينات، ويلزم تطبيق تقنيات أخرى لتحديد هيكل المركبات المستخرجة. فعلى سبيل المثال، يجب إجراء الرنين المغناطيسي النووي للتمييز بين أيزومرات الدهون. ومن الجدير بالذكر أن لوصف بنية الدهون الميكوبكتيرية للمرة الأولى، مطلوب قياس الطيف الكتلي أو الطيف بالأشعة تحت الحمراء. وهكذا، فإن التحليل الكمي والنوعي لفئات الدهون يتطلب عادة مجموعات من مختلف أساليب الاستخراج والإشتقاق واللونية والكشف، مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية أو فائقة الأداء جنبا إلى جنب الطيف الكتلي والطيف بالرنين المغناطيسي النووي37،38،39،40. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن استخدام خطوة واحدة رقيقة طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا اللهب تقنية الكشف عن التأين يسمح للقياس الكمي والفحص الأولي للأحماض الميكوليك في Actinobacteria41. ومع ذلك ، TLC هو مفيد للغاية ، وتكبيد الوقت ، وتقنية رخيصة لفحص وتقييم تكوين الدهون من البكتيريا الفطرية. بشكل عام ، فإن الإجراءات المعروضة هنا متعددة الاستخدامات للغاية لتوفير الأدوات الأساسية لتحليل الميزة الأكثر صلة بخلايا البكتريا: جدار الخلية المعقد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية (RTI2018-098777-B-I00) وصناديق FEDER و Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). ساندرا غوالار غاريدو حاصلة على عقد دكتوراه من جنرال كاتالونيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M.
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E.
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
