Summary
提出一个协议，以提取各种分枝杆菌细胞壁的总脂质含量。此外，还显示了不同类型的肌酸的萃取和分析协议。还提供了一个薄层色谱协议来监测这些分形化合物。
Abstract
分枝杆菌物种在生长速度、色素递迫存在、固体介质上显示的群落形态以及其他表型特征方面可能各不相同。然而，它们都有一个共同的分枝杆菌最相关的特征：它独特的高度疏水细胞壁。分枝杆菌物种含有一种膜-共价连结复合物，包括阿拉比诺甘丹、多肽和长链的支肠酸，其类型不同于分枝杆菌物种。此外， 肌菌还可以在其细胞表面产生位于非共价链接的脂质，如邻苯二甲酸二酯（PDIM）、酚甘油脂（PGL）、甘油脂（GPL）、乙酰三聚醇（AT）或磷脂二恶英（PIM）等。其中一些被认为是致病性分枝杆菌的毒性因素，或宿主-分枝杆菌相互作用中的关键抗原脂。由于这些原因，对支点血脂的研究有着极大的兴趣，因为这种脂质在几个领域得到应用，从了解它们在分枝杆菌感染致病性中的作用，到可能暗示它们是治疗传染病和其他疾病（如癌症）的免疫调节剂。在这里，提出了一个简单的方法来提取和分析总脂质含量和用有机溶剂混合物生长在固体介质中的分枝杆菌细胞的肌酸成分。获得脂质提取物后，将执行薄层色谱 （TLC） 来监测提取的化合物。该示例实验采用四种不同的分枝杆菌进行：环境快速增长的肌 杆菌布鲁马和支原体杆菌， 生长缓慢的 肌杆菌博维斯 杆菌Calmette-Guérin（BCG）和机会型病原体快速生长的分 枝杆菌脓肿， 表明本协议中显示的方法可用于广泛的分枝杆菌。
Introduction
Mycobacterium 属包括致病性物种和非致病性物种，其特点是具有由其特有的脂质形成的高度疏水性和不透水性细胞壁。具体来说，分枝杆菌细胞壁含有霉菌酸， 这是α-烷基和β-羟基脂肪酸，其中α分支是恒定的所有肌酸（长度除外）和β链，称为中分子链，是一个长的碱性链，可能包含不同的功能化学组描述与文献（α，α'-，甲氧基， [-，环氧树脂，卡盒-和+-1-甲氧-肌酸），因此产生七种类型的肌酸（I-VII）1.此外，其他具有毫无疑问重要性的脂质也存在于分枝杆菌物种的细胞壁中。致病物种，如 Mycobacterium tuberculosis, 结核病的致病剂2 产生特定的脂基毒性因子，如邻苯二甲酸二甲酸酯 （PDIM）、酚类糖脂 （PGL）、二、三和五氯乙酰丙烯酸酯 （DAT、TAT 和 PAT） 或硫化物等3.它们在分不育表面的存在与改变宿主免疫反应的能力有关，因此，宿主内部的分不分母的进化和持久性4.例如，三乙基甘油 （TAG） 的存在与血统 2- 北京子谱的超病毒表型有关 M. tuberculosis, 可能是因为它能够减弱宿主的免疫反应5,6.其他相关的脂质是结块状和非结管分枝杆菌中的脂糖（LOSs）。在 Mycobacterium marinum，LOS在其细胞壁的存在与滑动运动和形成生物膜的能力有关，并干扰巨噬细胞模式识别受体的识别，影响宿主噬细胞吸收和消灭细菌7,8.此外，一些脂质的缺失或存在允许同一物种的成员在与宿主细胞相互作用时，被分为具有毒性或衰减型的不同体型。例如，在粗糙的太平间类型中缺少糖镜（GPL） Mycobacterium abscessus 已与诱导噬细胞内酸化的能力有关，因此细胞凋亡9，不像光滑的太平型，拥有GPL在他们的表面。此外，分机细胞壁的脂质含量与改变宿主免疫反应的能力有关。这在使用一些分枝杆菌触发针对不同病理的保护性免疫特征的背景下是相关的10,11,12,13. 例如，已经证明这一点 Mycolicibacterium vaccae，一种作为结核病免疫治疗疫苗进行第三阶段临床试验的沙氏杆菌，显示两种殖民的死型。虽然光滑的表型，其中含有聚酯在其表面，触发Th2反应，粗糙的表型没有聚酯可以诱导Th1配置文件时，它与宿主免疫细胞相互作用14.分枝杆菌细胞中存在的脂质的种类不仅取决于分枝杆菌物种，还取决于分枝杆菌培养的条件：孵化时间15,16 或文化媒介的构成17,18.事实上，培养媒介成分的变化影响着抗肿瘤和免疫刺激活性的 M. bovis BCG 和 Mycolicibacterium brumae in vitro17.此外，保护性免疫剖面触发 M. bovis BCG 反对 M. tuberculosis 小鼠模型的挑战也取决于文化媒介 M. bovis BCG 增长17.然后，这些可能与每个培养条件下的分枝杆菌的脂质组成有关。由于所有这些原因，对分枝杆菌脂质含量的研究是相关的。提出了提取和分析支点细胞壁脂质成分的视觉程序。
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Protocol
1. 从分枝杆菌中提取总非同价相关脂质（图1）
- 从固体介质中划出 0.2 克分枝杆菌，并加入带多氟乙烯 （PTFE） 衬里螺丝帽的玻璃管。添加由 5 mL 氯仿和 10 mL 甲醇（氯仿：甲醇，1：2）组成的溶液。
注：使用有机溶剂时，只应使用玻璃接收器。不允许使用塑料容器。此外，需要为瓶子的PTFE衬里螺丝帽。
警告：氯仿是一种潜在的有毒和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：甲醇是一种潜在的有毒和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。 - 将管子在持续搅拌中过夜，从分不育细胞表面提取非共价相关脂质。
注：如果没有轨道摇晃平台，可以尽可能频繁地用周期性手动搅拌取代恒定搅拌。 - 用滤纸盖住玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并将其收集在玻璃管中。
- 使用氮气通量蒸发管中的液相。在管子中填充氮气，盖上盖子，将其储存在 4 °C 下。
注：将玻璃巴斯德移液器连接到氮气流中，以专门蒸发所需的管子。此外，在 37 °C 的干块加热器内保持管子。 当溶剂蒸发时，在关闭管子之前，先用氮气填充管子。 - 在细胞碎屑中加入 15 mL 的氯仿溶液：甲醇 （2：1）。将管子在持续搅拌中过夜，从分不育细胞表面提取非共价相关脂质。
注：如果没有轨道摇晃平台，可以尽可能频繁地用周期性手动搅拌取代恒定搅拌。 - 让混合物休息1小时。用巴斯德移液器，回收有机溶剂。用滤纸盖住玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并将其收集到以前用于第 1.3 步的同一个玻璃管中。使用氮气通量蒸发管中的液相。用氮气填充管子，关闭它，并在4°C下再次储存。
2. 酸甲酸溶解提取的肌酸 （图2A）
- 将 2-5 毫升的酯化溶液加入带有 PTFE 衬里螺丝盖的密封玻璃管中。在玻璃管中加入0.2克分枝杆菌生物量。
注：酯化溶液通过混合30mL甲醇、15mL甲苯和1mL硫酸形成。分枝杆菌细胞可以取自固体培养物，甚至从熟食细胞中提取完全非共价相关脂质（在步骤 1.6 中过滤后剩余的细胞）。
警告：甲苯是一种易燃和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：硫酸是一种腐蚀性和危险性物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。 - 通过漩涡混合内容。让混合物在 80 °C 的干燥浴缸中过夜。
- 让管冷却，直到达到室温，然后加入2mL的n-六烷管。通过涡旋将内容混合 30s，让管子沉淀，直到出现两个清晰的阶段。
警告：n-六烷是一种潜在的易燃、刺激性、环境破坏和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。 - 恢复与 n-六烷相对应的上相。将其转移到新管子中。
- 重复步骤 2.3。再次恢复上相，并将其转移到步骤 2.4 中使用的同一管中。
- 使用氮气通量蒸发管子中的内容。将管子装满氮气，关闭管子，将其储存在 4 °C 下。
3. 通过皂化和甲基化提取的肌酸 （图2B）
- 从固体介质中划出 0.2 克分枝杆菌，并添加到带 PTFE 螺丝帽的玻璃管中。
- 加入2mL甲醇苯溶液（80：20），含5%氢氧化钾。通过漩涡混合内容。在 100 °C 下加热混合物 3 小时。
警告：苯是一种易燃、致癌和有害物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。 - 让管子冷却到室温。加入 20% 硫酸，使样品酸化，达到 pH = 1。
- 加入3兆瓦的二乙醚。通过漩涡轻轻混合内容。
- 通过结算让两个阶段形成。恢复二乙醚相，并转移到一个新的管。重复洗涤步骤共三次。
- 用2mL蒸馏水清洗二乙醚提取物，并将与二乙醚对应的上部转移到新管中。重复洗涤步骤共三次。
- 在二乙醚提取物上加入2克无水硫酸钠，使其干燥。
- 过滤悬架。使用氮气通量蒸发含量。
- 要执行甲基化步骤，在蒸馏水中溶解由 45 mL 二乙醚和 9 mL 40% KOH 形成的预制溶液中的 3 克 N 硝基-N-甲基尿素。
警告：N-硝基-N-甲基尿素是一种有毒、刺激性、致癌性和危险性物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。 - 将超高氨酸（二甲基甲烷）转移到冰中冷却的新烧瓶中，其中含有氢氧化钾颗粒（约30克）。
注意：如果不立即使用超高音量，则可以在 -20 °C 下存储，最高可达 1 小时。
警告：氢氧化钾颗粒是一种刺激性和腐蚀性物质。这种材料必须使用在层压流罩上，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：二甲苯具有剧毒性和潜在的爆炸性。它必须用于带安全玻璃的层压流动罩，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。 - 将含有二甲烷的乙醚溶液（在第 3.10 步获得）添加到含有肌酸的干燥二乙醚提取物中，该提取物在步骤 3.8 中获得。在室温下孵育15分钟。
- 在 40 °C 下蒸发悬浮。 用氮气填充管子，关闭它，并将甲基化脂质储存在4°C。
注：从层压流罩下的乙醚溶液蒸发二甲烷，直到乙醚失去黄色。
4. 薄层色谱 （TLC） 分析
- 饱和玻璃 TLC 室。为此，请用一张滤纸覆盖 TLC 室的墙壁，并允许它与溶剂混合物组成的移动相接触。将溶剂的剩余体积放在 TLC 室的底部。
注：TLC 室的底部必须覆盖至少 1 厘米的移动相。在目前的实验中，不同的移动阶段被用来开发TLC。它们由85兆L的n-六烷加15mL的二乙醚组成;100mL二氯甲烷;90 mL 氯仿、10 mL 甲醇和 1 mL 水;30 mL 氯仿，外加8mL甲醇和1mL水：60 mL 氯仿，外加35mL甲醇和8mL水：95 mL 氯仿加5mL甲醇;和 90 mL 的石油乙醚 （60-80 °C） 加上 10 mL 的二乙醚。
注：在二维TLC中，在第一方向使用n-六烷：丙酮（95：5），并在第二个方向使用单个开发与甲苯：丙酮（97：3）来分析肌酸成分。要分析 PIM，请在第一个方向使用氯仿：甲醇：水（60：30：6），在第二个方向使用氯仿：醋酸：甲醇：水（40：25：3：6）。要分析 PDIM 和 AG，请使用石油乙醚（60-80 °C）：乙酸乙酸乙酯 （98：2） 在第一个方向上三次，并在第二个方向使用单个开发与石油乙醚 （60-80 °C）：丙酮 （98：2） 在第二个方向。
警告：二乙醚是一种潜在的有毒和危险物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：二氯甲烷是一种潜在的有毒和危险物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：石油乙醚是一种潜在的易燃、环境破坏和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：醋酸是一种潜在的易燃和腐蚀性物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：乙酸乙酸乙酯是一种易燃和有害物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：丙酮是一种易燃和有害物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。 - 关闭 TLC 室使其饱和至少 20 分钟。同时，将玻璃管中的脂质溶解在 0.2-1 mL 的氯仿中。
注：用于溶解脂质的体积可根据样品的预期或预期浓度进行修改。 - 使用直接在 TLC 板上的毛细管将每个悬架的 10 μL 涂抹，让样品在室温下干燥 5 分钟。
注：样品必须涂在板的底部，每侧留下1厘米。样品必须彼此分离至少 0.5 厘米。样品在板上应用后，管子可以再次用氮气蒸发，储存在4°C下供进一步使用。 - 将板插入包含移动相的饱和 TLC 室。允许移动阶段通过 TLC 运行。
注：适用于 TLC 腔室的任何运动都会影响板上的运行溶剂，并影响脂质移动性。在执行二维 TLC 时，需要两个 TLC 室来包含两个放逐系统。 - 当溶剂距离板的上端达到 1 厘米时，从 TLC 腔室中取出板。将板放在层压通量下，直到二氧化硅完全干燥。
注：在分析肌酸成分的情况下，使用 n-六烷和二乙醚 （85：15），重复步骤 4.4 和 4.5 两次以上，直到运行移动阶段三次在 TLC 板。 - 用所需的污渍露出盘子;如果需要，加热盘子。
注：在本实验中，15-20 mL 的以下溶液用于喷洒 TLC 板：乙醇中 10% 的莫利布达托磷酸水合物，直到板状亮黄色，然后在 120 °C 加热板：5% 的乙醇 20% α -石脑油硫酸，然后加热板在 120 °C;在磷酸盐带出现或硫酸中出现1%的氮氧化物之前，蓝色试剂（420万硫酸中氧化物的1.3%）。
警告：甲基磷酸水合物是一种易燃腐蚀性物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：乙醇是一种潜在的易燃和危险物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：1-纳普特霍尔是一种易燃、腐蚀性和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
警告：甲基蓝喷雾试剂是一种腐蚀性、有毒和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
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Representative Results
为了显示不同分枝杆菌物种中的各种脂质 ，M. bovis BCG 被选中，因为它是粗糙和生长缓慢的分枝杆菌。在手术中增加了粗糙和快速增长的 M.偶然 和 M.布鲁马 ，最后，也包括 了M.脓肿 的光滑的死型。这四个物种使我们能够可视化广泛的分枝杆菌衍生脂质，如乙酰链球菌（AT）、GPL、PDIM、PGL、PIM、TDM和TMM。此外，所有四个物种都有不同的肌酸模式。
在执行肌酸提取协议后，通过两种不同、同样有效的脱脂系统（图3A，B）通过1D-TLC分析脂质提取物进行分析。第一个移动相（图3A）由n-六烷和二乙醚（85：15）组成，板运行三次。第二个移动相由100%的二氯甲烷组成，板块被拉起一次（图3B）。在这两个系统中，从样品应用的起源出发，肌酸大约位于 TLC 板的中间。图3显示，M.布鲁马只拥有I型肌酸，一种存在于所有分枝杆菌物种中的肌酸。M. 博维斯BCG有I型和IV型，M.偶然型I型和V型，M.脓肿，I型和II型肌酸配置文件。执行两种类型的甲基化程序使我们能够确认V型肌酸的存在，因为V型肌酸在酸甲酸溶解过程中被切开。图3显示，只有在皂化程序之后，才观察到与V型肌酸对应的斑点。甲硫化后， TLC 显示从 V 型中提取的化合物，这些化合物在应用点19附近迁移。对于新植物研究人员来说，2D-TLC可以采用一种补充方法来识别每个肌酸类型（图3C，D）。霉菌酸提取物必须首先在由石油乙醚（60-80°C）和丙酮（95：5）形成的脱液系统中运行三次。然后，板必须运行在第二个方向与甲苯和丙酮形成的移动相（97：3）。2D-TLC结合质谱（MS）已用于识别和化学特征的肌酸的功能组，并已广泛用于表征肌酸20，21，22。因此，由于不同物种之间共享的肌酸模式，肌酸模式是系统分代评价中具有价值的生化特征之一。
在执行上述提取非共价连结脂的程序后，根据分枝杆菌细胞中脂质的极性和大小的功能选择了不同的精炼系统。溶剂在脱液系统中的理想组合应能可视化 TLC 板中间区域所需的脂质，以便在需要时促进其进一步净化。在图4中，TLC板从允许监测最极性脂质的洗礼系统（图4A）订购到允许将最极地脂质可视化的洗礼系统（图4E）。
乙酰甘油（AG）和PDIM是分代细胞壁中两种最极性的脂质，使用石油乙醚形成的移动相：二乙醚（90：10）的移动相，通过1D-TLC分析很容易可视化。图4A显示，AGs在M.bovisBCG，M.偶然和M.布鲁马存在，但不是在M.脓肿的光滑的死气沉沉。虽然1D-TLC建议在M.bovisBCG和M.偶然存在PDIM，但它只有在进行2D-TLC分析时才在M.bovisBCG得到证实（图4B）。总之，这些结果表明，至少两个不同的系统证实了支离体化合物的存在的重要性。在分枝杆菌成分中分析的另一个有趣的脂质是PGL。在选定的分枝杆菌中，PGL 仅存在于M. bovis BCG 中，当 TLC 与氯仿和甲醇 （95：5） （图 4C）组成的脱毛系统相形见色时，它就显而易见了。按照可视化更多极性组件的想法，由 90：10：1（氯仿：甲醇：水）混合物组成的脱毛系统用于监测 GPL （图 4D）的存在，这些 GPL 仅存在于M. 脓肿平滑太平型中。在同一TLC中：还可以观察到三卤素二甲基酸酯（TDM）、乙基三卤素（AT）和三卤素单肌酸（TMM）。PGL，GPL，TDM，AT也观察到在板的顶部，当洗脱系统包括30：8：1（氯仿：甲醇：水）（图4E）。TMM 位于板的中间。TDM 和 TMM 在所研究的所有分枝杆菌中都得到了明确的表达。尽管在板的底部观察到磷脂二醇（PIN），但分析PIM的最佳洗脱系统是60：35：8（氯仿：甲醇：水），如图5A，B所示。虽然所有含糖脂质都与苯丙胺（图5A）一起暴露，但PIM含有磷酸盐组，这些磷酸盐组是专门用莫利布德努姆蓝色试剂（图5B）揭示的。与肌酸、AG 和 PDIM 类似，PIM 也可以通过 2D-TLC 分析（图 5C）轻松可视化。此外，在分析能够合成LOS、PIM和LOS的分枝杆菌的情况下，将采用相同的二维脱口而入系统进行区分，如Ren等人所详述的。
图1：在固体介质上生长的分枝杆菌脂含量提取程序方案。破译分枝杆菌细胞中存在的脂质的主要步骤。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在固体介质上生长的分枝杆菌提取肌酸含量的程序方案。使用（A） 酸甲酸解析或（B） 皂化来破译分枝杆菌细胞上存在的肌酸的主要步骤。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：从分枝杆菌中提取脂质的代表性结果。 薄层色谱 （TLC） 分析在（A） 85 mL n-六烷中开发的肌酸，外加 15 mL 的二乙醚 （三次运行） 和（B） 100 mL 的二氯甲烷。（C） 酸甲酸分析提取的二维TLC分析在第一方向以95：5（n-六烷：丙酮）（三次运行）在第一方向，97：3（甲苯：丙酮）在第二方向发展。（D） 从皂化提取的 M.偶然 提取的甲酸的二维TLC分析在第一个方向（n-六烷：丙酮）（三次运行）和第二个方向97：3（甲苯：丙酮）中发展。TLCs在乙醇中暴露出10%的甲基磷酸水合物，然后在 120°M.M.bovis BCG康诺特（第1行和第1线）加热板材： M. 偶然（ 第2行和第2线）： M. 脓肿 光滑的太平型（第3行和第3行）和 M.布鲁马 （第4和第4行）。1-4 酸甲酸解析获得的肌酸和盐化获得的 1'-4' 肌酸。我，α-我的可乐;二、α-肌胶：四、酮肌细胞;V，环氧甲酸。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：从分枝杆菌中提取脂质的代表结果。（A ）TLC分析乙酰甘油（AG）和二乙二醇二聚氰胺（PDIMs）于90：10（石油乙醚（60-80°C）:d乙醚）开发。（B） 二维TLC分析PDIM和AG开发在98：2（石油乙醚（60-80°C）：乙酸乙酸乙酯）（三运行）在第一个方向和98：2（石油乙醚（60-80°C）：丙酮）在第二个方向。（C） TLC 分析 95：5 （氯仿：甲醇） 中开发的酚甘油 （PGL）。（D） TLC 分析在 90：10：1 （氯仿：甲醇：水） 中开发的 PGL、糖多肽 （GPL）、三聚二甲酸酯 （TDM）、乙基三聚醇 （AT） 和三卤素单肌酸酯 （TMM） 。（E） TLC 分析 PGL、GPL、AT、TMM 和磷脂二醇曼诺赛德 （PIM） 以 30：8：1 （氯仿：甲醇：水） 发展。A-B-C在乙醇中显示 10% 的甲基磷酸水合物，然后在 120 °C 加热板。 D-E在硫酸中 20% α-石脑醇的乙醇中显示 5%，在 120 °C 下加热。 第1行：M. 博维斯BCG康诺特;2号线：M.偶然：第3行：M.脓肿光滑太平型：4号线：布鲁马。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：在60：35：8（氯仿：甲醇：水）发展起来的对PIM的PIM（A-B）TLC分析的代表结果。（C） 在第一方向以60：30：6（氯仿：甲醇：水）和40：25：3：6（氯仿：醋酸：甲醇：水）在第二方向发展成的双维TLC分析。A-C在硫酸中显示 1% 的苯丙胺，然后在 120 °C 下加热板。 B被揭示为莫利布德努姆蓝色试剂，直到磷酸盐带出现。第1行：M. 博维斯BCG康诺特;2号线：M.偶然：第3行：M.脓肿光滑太平型：4号线：布鲁马。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
提出了一个简单的协议，被认为是从分不育细胞壁中提取非高血脂化合物的黄金标准方法。显示从四种不同分枝杆菌提取的脂质中，一维和二维 TLC 的进一步可视化。
氯仿和甲醇连续两次结合混合物来恢复支核细胞的脂质含量，是使用最广泛的溶剂混合物23、24、25、26、27、28、29。这种混合物允许从细胞中恢复广泛的极性和极性脂质。然而，文献中还描述了提取全部或特定的分体脂质的其他方法，哈米德等人最近对此进行了审查。例如，Folch 方法是开发用于从组织 30中恢复总分分节血脂的最广泛使用的方案之一，并且也已适应纯分菌培养。它包括暂停叶绿素中的分细菌细胞：甲醇（1：2），然后是离心和添加氯仿，以获得1：1的比例。最后，KCl 用于从提取物31中去除非脂成分。同时，还制定了其他协议来提取特定的脂质。斯莱登等人使用氯仿：甲醇加丙酮的混合物来特别回收乙酰脂，如TDM或TMM32。总之，已发表的方法基于将分代细胞暴露在不同浓度溶剂中，主要是氯仿和甲醇。同样，偶尔添加一些盐来丢弃样品上的其他细胞成分。
除了非高血脂外，还显示了通过两种不同程序提取的肌酸。虽然酸性甲酸化物允许使用危险性较小的试剂轻松提取肌酸，但皂化过程保留了所有肌酸类型的结构，包括在甲基甲酸溶解过程中裂开的V型肌酸。提取脂质后，1D 或 2D-TLC 是监测脂质的标准方法，所使用的检测方法因脂质的物理化学特性而异。每个分子的极性和大小将决定所需的洗脱系统的选择，从而确定构成分枝杆菌一部分的脂质。当分代脂质之间的保留因子 （Rf） 不同时，可以选择一维 TLC，而当不同的脂质共享分子量和极性特性时，2D-TLC 可促进可视化。为了便于识别，纯化脂质应与提取的样品同时运行，以比较类似的 Rf。当脂质的运行与已知纯化控制相同的 Rf 运行时，至少可以在两个 TLC 系统（两个不同的移动阶段）中实现脂质的识别。纯化脂质可从商业供应商或分体研究实验室获得。最后，分子的生化性质表明哪些污渍可用于揭示TLC板。有通用的染色方法，如磷酸，它使任何有机成分的可视化可视化，因为它与碳键结合。而其他如石脑或雄胺为糖残留物提供特定的颜色，而蓝色桉糖则特别与磷酸盐残留物结合。
分析分枝杆菌脂质含量的最重要考虑因素是在整个过程中避免使用塑料材料，因为有机溶剂与塑料的接触会污染样品，并且可以在 TLC 板中观察到。还应考虑用于分枝杆菌培养的文化介质成分，以及温度或孵化天数，可以改变每个分枝杆菌的脂质模式，如前所述16。生长在液体和固体介质上的分枝杆菌可用于提取非同价相关脂质或肌酸。当从液体培养中获取细胞时，应充分过滤和干燥它们，以避免样品中存在液体介质。此外，在使用液体介质的分枝杆菌时，必须在实验之间适当和均等地生长细菌，以便随着时间的推移获得可重复的结果。此外，分代细胞也可以生长在17，33，34，35，36的颗粒上，从中可以回收最外层的脂质使用有机溶剂和TLC监测，正如我们在本文中显示的。
分子菌脂提取程序的主要限制仍然是在安全条件下使用有毒溶剂。TLC 程序比其他技术（如气相色谱或高性能液相色谱）的敏感度较低。此外，TLC 不允许对样品进行量化，还需要应用进一步技术来识别提取化合物的结构。例如，需要进行核磁共振来区分脂质同位素。值得注意的是，要首次描述支点血脂的结构，需要质谱或红外光谱。因此，脂质类的定量和定性分析通常需要不同的提取、分化、色谱和检测方法的组合，如高性能或超性能液相色谱串联质谱和核磁共振光谱37、38、39、40。最近的研究表明，使用单步薄层色谱火焰电离子检测技术，可以量化和初步筛选Actino菌41中的肌酸。然而，TLC 是一种极其有用、省时和廉价的技术，用于筛选和评估支原体的脂质成分。总的来说，这里介绍的程序是高度多才多艺的，提供基本工具来分析分枝杆菌细胞的最相关特征：其复杂的细胞壁。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由西班牙科学、创新和大学部（RTI2018-098777-B-I00）、联邦基金和加泰罗尼亚总务局（2017SGR-229）资助。桑德拉·瓜拉尔-加里多是加泰罗尼亚总务部的博士学位合同（FI）的接受者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
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