Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse af Lipid sammensætning af mycobacteria af tyndt lag kromatografi

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62368
Automatic Translation
1, 1, 1
1Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

Summary

En protokol præsenteres for at udtrække det samlede lipidindhold i cellevæggen i en bred vifte af mykobakterier. Desuden er ekstraktion og analytiske protokoller af de forskellige typer mykolic syrer vist. En tynd-lag kromatografisk protokol til overvågning af disse mykobakterielle forbindelser er også forudsat.

Abstract

Mycobacteria arter kan afvige fra hinanden i vækstraten, tilstedeværelsen af pigmentering, koloni morfologi vises på faste medier, samt andre fænotypiske egenskaber. Men de har alle til fælles den mest relevante karakter af mycobacteria: dens unikke og meget hydrofobiske cellevæg. Mycobacteria arter indeholder en membran-kovalent forbundet kompleks, der omfatter arabinogalactan, peptidoglycan, og lange kæder af mykolic syrer med typer, der adskiller sig mellem mycobacteria arter. Derudover kan mycobacteria også producere lipider, der er placeret, ikke-kovalent forbundet, på deres celleoverflader, såsom phthiocerol dimycocerosates (PDIM), phenol glycolipider (PGL), glycopeptidolipids (GPL), acyltrehaloses (AT) eller fosphatidil-inositol mannosider (PIM), blandt andre. Nogle af dem betragtes virulensfaktorer i patogen mykobakteri eller kritiske antigene lipider i værts-mykobakterier interaktion. Af disse grunde er der en betydelig interesse i studiet af mykobakterielle lipider på grund af deres anvendelse på flere områder, fra at forstå deres rolle i patogeneligheden af mykobakterier til en mulig implikation som immunmodulerende midler til behandling af smitsomme sygdomme og andre patologier som kræft. Her præsenteres en simpel tilgang til at udtrække og analysere det samlede lipidindhold og mykolicsyresammensætningen af mykobakterier, der dyrkes i et solidt medium ved hjælp af blandinger af organiske opløsningsmidler. Når lipidekstrakterne er opnået, udføres tyndt lag kromatografi (TLC) for at overvåge de ekstraherede forbindelser. Eksemplet eksperiment udføres med fire forskellige mycobacteria: de miljømæssige hurtigt voksende Mycolicibacterium brumae og Mycolicibacterium fortuitum, den svækkede langsomt voksende Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), og den opportunistiske patogen hurtigt voksende Mycobacterium byld, der viser, at metoder vist i den nuværende protokol kan bruges til en bred vifte af mycobacteria.

Introduction

Mycobacterium er en slægt, der omfatter patogene og ikke-patogene arter, karakteriseret ved at have en meget hydrofobisk og uigennemtrængelig cellevæg dannet af deres ejendommelige lipider. Specifikt indeholder mykobakterielle cellevæg mykolicsyrer, som er α-alkyl og β-hydroxy fedtsyrer, hvor α-grenen er konstant i alle mykolicsyrer (undtagen længden) og β-kæden, kaldet meromycolatekæden, er en lang alifatisk kæde, der kan indeholde forskellige funktionelle kemiske grupper beskrevet sammen med litteraturen (α-, α'-, methoxy-, κ-, epoxy-, carboxy-, og ω-1-methoxy-mykolater), derfor producerer syv typer mykossyrer (I-VII)1. Desuden er andre lipider med ubestridelig betydning også til stede i cellevæggen af mycobacteria arter. Patogene arter som f.eks. Mycobacterium tuberculosis, det forårsagende middel til tuberkulose2 producere specifikke lipidbaserede virulensfaktorer såsom phthiocerol dimycocerosater (PDIMs), phenol glycolipid (PGL), di-, tri-og penta-acyltrehaloses (DAT, TAT og PAT) eller sulfolipider, bl.a.3. Deres tilstedeværelse på den mykobakterielle overflade har været forbundet med evnen til at ændre værten immunrespons og derfor udviklingen og persistensen af mycobacterium inde i værten4. For eksempel har tilstedeværelsen af triacylglyceroler (TAG) været forbundet med hypervirulent fænotypen Lineage 2-Beijing underlinje af M. tuberculosis, muligvis på grund af dets evne til at svække værtsens immunrespons5,6. Andre relevante lipider er lipooligosaccharider (LOS'er), der er til stede i tuberkulose og ikke-jernholdige mykobakterier. I tilfælde af Mycobacterium marinum, er tilstedeværelsen af LOS'er i cellevæggen relateret til glidende motilitet og evnen til at danne biofilm og forstyrrer genkendelse af makrofagsmønstergenkendelsesreceptorer, der påvirker optagelsen og elimineringen af bakterierne ved værtsfocytter7,8. Derudover gør fraværet eller tilstedeværelsen af nogle lipider det muligt for medlemmer af samme art at blive klassificeret i forskellige morfotyper med virulent eller svækkede profiler, når de interagerer med værtsceller. F.eks. er fraværet af glycopeptidolipids (GPL) i den grove morphotype af Mycobacterium abscessus har været forbundet med evnen til at fremkalde intraphagosomal forsuring, og dermed celleapokaptose9, i modsætning til den glatte morphotype, der besidder GPLs i deres overflade. Desuden er lipidindholdet i mykobakterielle cellevæg relateret til evnen til at ændre immunresponset hos værten. Dette er relevant i forbindelse med brug af nogle mycobacteria til at udløse en beskyttende immunprofil mod forskellige patologier10,11,12,13. Det er f.eks. blevet påvist, at Mycolicibacterium vaccae, viser et saprofitisk mycobacterium, som i øjeblikket er i fase III kliniske forsøg som immunterapeutisk vaccine mod tuberkulose, to koloniale morfotyper. Mens den glatte fænotype, der indeholder en polyester i overfladen, udløser en Th2 svar, den ru fænotype blottet for polyester kan fremkalde en Th1 profil, når den interagerer med værtsimmunitetceller14. Repertoiret af lipider, der er til stede i mykobaktercellen, afhænger ikke kun af mykobakterier, men også af betingelserne for mykobakterielle kulturer: inkubationstid15,16 eller sammensætningen af kulturmediet17,18. Faktisk påvirker ændringer i kulturmediesammensætningen antitumor- og immunstimulerende aktivitet i M. bovis BCG og Mycolicibacterium brumae in vitro17. Desuden er den beskyttende immunprofil udløst af M. bovis BCG mod M. tuberculosis udfordring i musemodeller afhænger også af de kulturmedier, hvor M. bovis BCG vokser17. Disse kunne derefter være relateret til lipid sammensætning af mycobacteria i hver kultur tilstand. Af alle disse grunde er undersøgelsen af lipidindholdet i mykobakterier relevant. En visuel procedure til at udtrække og analysere lipidsammensætningen af den mykobakterielle cellevæg præsenteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udvinding af de samlede ikke-kovalente lipider fra mykobakterier (figur 1)

  1. Scratch 0,2 g mycobacteria fra et solidt medie og tilføje til et glasrør med en polytetrafluoroethlen (PTFE) liner skrue hætter. Der tilsættes en opløsning bestående af 5 mL kloroform og 10 mL methanol (chloroform:methanol, 1:2).
    BEMÆRK: Når der anvendes organiske opløsningsmidler, må der kun anvendes glasmodtagere. Ingen plastbeholdere er tilladt. Desuden er PTFE liner skrue hætter til flasker er nødvendige.
    FORSIGTIG: Kloroform er et potentielt giftigt og ekstremt farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Methanol er et potentielt giftigt og ekstremt farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
  2. Lad røret blive under konstant omrøring natten over for at udtrække ikke-kovalent-forbundne lipider fra den mykobakterielle celleoverflade.
    BEMÆRK: Hvis der ikke er en orbital rysteplatform til rådighed, kan konstant omrøring erstattes af periodisk manuel omrøring så ofte som muligt.
  3. Dæk en glastragt med et filterpapir, filtrer de organiske opløsningsmidler, og saml dem i et glasrør.
  4. Brug en nitrogengasstrøm til at fordampe væskefasen i røret. Fyld røret med nitrogengas, dæksel og opbevar det ved 4 °C.
    BEMÆRK: Tilslut et glas Pasteur pipette til strømmen af nitrogengas for specifikt at fordampe det ønskede rør. Derudover skal røret inde i en tør blokvarmer til rør ved 37 °C. Når opløsningsmidlet fordamper, fyldes røret med nitrogengas, før det lukkes.
  5. Der tilsættes 15 mL af en opløsning af chloroform:methanol (2:1) til celleaffaldet. Lad røret blive under konstant omrøring natten over for at udtrække ikke-kovalent-forbundne lipider fra den mykobakterielle celleoverflade.
    BEMÆRK: Hvis der ikke er en orbital rysteplatform til rådighed, kan konstant omrøring erstattes af periodisk manuel omrøring så ofte som muligt.
  6. Lad blandingen hvile i 1 time. Med en Pasteur pipette genvindes de organiske opløsningsmidler. Dæk en glastragt med et filterpapir, og filtrer de organiske opløsningsmidler, og saml dem i det samme glasrør, der tidligere blev brugt i trin 1.3. Brug en nitrogengasstrøm til at fordampe væskefasen i røret. Fyld røret med nitrogengas, luk det og opbevar det igen ved 4 °C.

2. Mykolsyreudvinding ved syre methanolyse (Figur 2A)

  1. Tilsæt 2-5 mL esterificerende opløsning i et hermetisk glasrør med en PTFE liner skruel. Der tilsættes 0,2 g mycobacteriabiomasse i glasrøret.
    BEMÆRK: Esterificerende opløsning dannes ved blanding af 30 mL methanol, 15 mL toluen og 1 mL svovlsyre. Mycobacteriaceller kan tages fra faste kulturer eller, selv fra delipiderede celler efter at have udført ekstraktion af totale ikke-kovalente lipider fra mykobakterier (resterende celler efter filtrering i trin 1.6).
    FORSIGTIG: Toluen er et brandfarligt og ekstremt farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Svovlsyre er et ætsende og farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
  2. Bland indholdet ved at hvirvler. Lad blandingen stå inde i et tørt bad ved 80 °C natten over.
  3. Lad røret køle af, indtil det når stuetemperaturen, og tilsæt derefter 2 mL n-hexan til røret. Bland indholdet ved at hvirvle i 30 s og lad røret afregne, indtil to klare faser vises.
    FORSIGTIG: n-hexan er et potentielt brandfarligt, irriterende, miljøskadeligt og ekstremt farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
  4. Gendan den øverste fase svarende til n-hexanfasen. Overfør det til et nyt rør.
  5. Gentag trin 2.3. Den øverste fase genvindes igen, og det overføres til det samme rør, der blev brugt i trin 2.4.
  6. Fordampe indholdet af røret ved hjælp af en nitrogen gas flux. Fyld røret med nitrogengas, luk det, og opbevar det ved 4 °C.

3. Mykolsyreudvinding ved forstning og methylering (figur 2B)

  1. Scratch 0,2 g mycobacteria fra et solidt medie og tilføje til et glasrør med en PTFE skruelåg.
  2. Der tilsættes 2 ml methanolbenzenopløsning (80:20), der indeholder 5% kaliumhydroxid. Bland indholdet ved at hvirvler. Blandingen opvarmes i 3 timer ved 100 °C.
    FORSIGTIG: Benzen er et brandfarligt, kræftfremkaldende og farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
  3. Lad røret køle af til stuetemperatur. Tilsæt 20% svovlsyre for at forsuring prøverne for at opnå pH = 1.
  4. Tilsæt 3 mL diethyl ether. Bland forsigtigt indholdet ved at hvirvler.
  5. Lad de to faser dannes ved at afregne. Genvind diethyletherfasen og overfør til et nyt rør. Gentag vasketrinnet i alt tre gange.
  6. Vask diethyletherekstraktet med 2 mL destilleret vand, og overfør den øverste del svarende til diethyletheren til et nyt rør. Gentag vasketrinnet i alt tre gange.
  7. Tilsæt 2 g vandfri natriumsulfat over diethyletherekstraktet for at tørre det.
  8. Filtrer affjedringen. Fordampe indholdet ved hjælp af en nitrogengasstrøm.
  9. For at udføre methyleringstrinnet opløses 3 g N-nitroso-N-methylstof i en forkogt opløsning dannet af 45 mL diethylether og 9 mL på 40% KOH i destilleret vand.
    FORSIGTIG: N-nitroso-N-methylurea er et giftigt, irriterende, kræftfremkaldende og farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
  10. Supernatanten (diazomethan) overføres til en ny kolbe afkølet i is, der indeholder kaliumhydroxidpiller (ca. 30 g).
    BEMÆRK: Hvis supernatanten ikke anvendes umiddelbart, kan den opbevares ved -20 °C i højst 1 time.
    FORSIGTIG: Kaliumhydroxidpiller er et irriterende og ætsende stof. Dette materiale skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Diazomethan er meget giftig og potentielt eksplosiv. Det skal anvendes i en laminar flow hætte med sikkerhedsglas iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
  11. Der tilsættes 2 mL af æteropløsningen, der indeholder diazomethan, som er opnået i trin 3.10, i det tørrede diethyletherekstrakt, der indeholder mykolicsyrer, der er opnået i trin 3.8. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
  12. Affjedringen fordampes ved 40 °C. Fyld røret med nitrogengas, luk det, og opbevar de methylerede lipider ved 4 °C.
    BEMÆRK: Fordampe diazomethanen fra æteropløsningen under laminar flowhætten, indtil æteren mister den gule farve.

4. Analyse af tyndt lagkromatografi (TLC)

  1. Mætte glasset TLC kammer. For at gøre dette skal du dække en af væggene i TLC-kammeret med et stykke filterpapir og lade det være i kontakt med den mobile fase sammensat af blandingen af opløsningsmidler. Læg den resterende volumen af opløsningsmidlet på bunden af TLC-kammeret.
    BEMÆRK: Bunden af TLC-kammeret skal være dækket af mindst 1 cm af den mobile fase. I de nuværende eksperimenter blev forskellige mobile faser brugt til at udvikle TLC'erne. De bestod af 85 mL n-hexan plus 15 mL diethylether; 100 mL dichlormethan; 90 mL kloroform, 10 mL methanol og 1 mL vand 30 mL kloroform, plus 8 mL methanol og 1 mL vand 60 mL kloroform samt 35 mL methanol og 8 mL vand 95 mL chloroform plus 5 mL methanol; og 90 mL petroleumsether (60-80 °C) plus 10 mL diethylether.
    BEMÆRK: I den todimensionelle TLC skal du bruge n-hexan:acetone (95:5) i den første retning tre gange og bruge en enkelt udvikling med toluen:acetone (97:3) i anden retning til at analysere mykolicsyresammensætningen. Hvis du vil analysere PIMs, skal du bruge chloroform:methanol:vand (60:30:6) i den første retning én gang og bruge chloroform:eddikesyre:methanol:vand (40:25:3:6) i den anden retning. For at analysere PDIM og AG skal du bruge petroleumsetater (60-80 °C):ethylacetat (98:2) i den første retning tre gange og bruge en enkelt udvikling med petroleumsetaher (60-80 °C):acetone (98:2) i anden retning.
    FORSIGTIG: Diethyl æter er et potentielt giftigt og farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Dichlormethan er et potentielt giftigt og farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    ADVARSEL: Petroleumsether er et potentielt brandfarligt, miljøskadeligt og ekstremt farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Eddikesyre er et potentielt brandfarligt og ætsende stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Ethylacetat er et brandfarligt og farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Acetone er et brandfarligt og farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
  2. Luk TLC-kammeret for at mætte det i mindst 20 min. I mellemtiden opløses lipider til stede i glasrøret i 0,2-1 mL kloroform.
    BEMÆRK: Det volumen, der bruges til at opløse lipiderne, kan ændres afhængigt af den ønskede eller forventede koncentration af prøven.
  3. Påfør 10 μL af hver affjedring ved hjælp af et kapillært glasrør direkte på TLC-pladen, og lad prøven tørre i 5 min ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Prøver skal påføres i den nederste del af pladen, der efterlader 1 cm på hver side. Prøverne skal adskilles fra hinanden i mindst 0,5 cm. Når prøven er påført på pladen, kan rørene fordampes igen med nitrogengas og opbevares ved 4 °C til videre brug.
  4. Sæt pladen ind i det mættede TLC-kammer, der indeholder den mobile fase. Lad mobilfasen løbe gennem TLC'en.
    BEMÆRK: Enhver bevægelse, der påføres TLC-kammeret, påvirker det kørende opløsningsmiddel på pladen og påvirker lipidmobiliteten. I tilfælde af udførelse af todimensionel TLC kræves der to TLC-kamre for at indeholde begge elutionssystemer.
  5. Fjern pladen fra TLC-kammeret, når opløsningsmidlet når 1 cm afstand fra den øverste ende af pladen. Lad pladen være under laminar flux, indtil silica er helt tørret.
    BEMÆRK: I tilfælde af analyse af mykolicsyresammensætningen ved hjælp af n-hexan og diethyl-æter (85:15) gentages trin 4.4 og 4.5 to gange mere, indtil du kører mobilfasen tre gange over TLC-pladen.
  6. Afslør pladen med den nødvendige plet; opvarme pladen, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: I dette forsøg blev 15-20 mL af følgende opløsninger anvendt til at sprøjte TLC-pladerne: 10% Molybdatophosphoric acid hydrat i ethanol, indtil pladen er lysegul, efterfulgt af opvarmning af pladen ved 120 °C; 5 % i ethanol på 20 % α-naphthol i svovlsyre efterfulgt af opvarmning af pladen ved 120 °C Molybdæn Blåt reagens (1,3% molybdænoxid i 4,2 M svovlsyre), indtil fosfatbånd dukkede op eller 1% anthron i svovlsyre.
    FORSIGTIG: Molybdatophosphoric syrehydrat er et brandfarligt og ætsende stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Ethanol er et potentielt brandfarligt og farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: 1-Naphthol er et brandfarligt, ætsende og ekstremt farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).
    FORSIGTIG: Molybdæn Blue Spray Reagens er et ætsende, giftigt og ekstremt farligt stof. Det skal anvendes i en laminar flow hætte iført passende personlige værnemidler (laboratoriefrakke, beskyttende briller, og nitril handsker).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med det formål at vise en bred vifte af lipider til stede i forskellige mycobacteria arter, M. bovis BCG blev valgt, da det er ru og langsomt voksende mykobakterier. Den ru og hurtigt voksende M. fortuitum og M. brumae blev tilføjet i proceduren, og endelig var den glatte morphotype af M. byld også inkluderet. Disse fire arter giver os mulighed for at visualisere et bredt spektrum af mycobacteria-afledt lipider som acyltrehaloses (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM og TMM. Desuden har alle fire arter forskellige mykolsyremønstre.

Efter at have udført mykolsyreudvindingsprotokollerne blev lipidekstrakter analyseret gennem 1D-TLC-analyse ved hjælp af to forskellige, lige gyldige elutionssystemer (Figur 3A, B). Den første mobile fase (Figur 3A) blev komponeret af n-hexan og diethyl-æter (85:15), og pladen blev kørt tre gange. Den anden mobile fase bestod af 100 % dichlormethan, og pladen blev eluteret én gang (figur 3B). I begge elutionssystemer er mykolicsyrer placeret ca. midt på TLC-pladen fra prøveudbringningens oprindelse. Som figur 3 viser, besidder M. brumae kun type I mykolicsyrer, en mykolicsyre til stede i alle mykobakterier. M. bovis BCG har type I og IV, M. fortuitum type I og V, og M. byld, type I og II mykolsyrer profiler. Udførelse af to typer af methyleringsprocedurer giver os mulighed for at bekræfte tilstedeværelsen af type V mykolicsyre, da type V mykolicsyre spaltes under syre methanolyseproceduren. Som figur 3 viser, var det sted, der svarede til type V-mykossyre, først efter forsaftningsproceduren. Efter methanolyse viste TLC de afledte forbindelser fra type V-kavalergang, der migrerede nær ansøgningspunktet19. For neophyte forskere, 2D-TLC kan give mulighed for en supplerende metode til at identificere hver mykossyre type (Figur 3C, D). Mykolsyreekstrakter skal først køres i et fortyndingssystem dannet af petroleumsether (60-80 °C) og acetone (95:5) tre gange. Derefter skal pladen køres i anden retning med en mobil fase dannet af toluen og acetone (97:3). 2D-TLC kombineret med massespektrometri (MS) er blevet brugt til at identificere og kemisk karakterisere de funktionelle grupper af mykolicsyrer og er blevet brugt i vid udstrækning til at karakterisere mykolicsyrer20,21,22. Derfor er mykolicsyremønsteret et af de biokemiske egenskaber ved værdi i systematisk mykobakteriel evaluering i kombination med andre analyser på grund af fælles mykolsyremønstre blandt forskellige arter.

Efter at have udført ovennævnte procedure for at udtrække de ikke-kovalente forbundne lipider blev forskellige elutionssystemer valgt i funktion af polariteten og størrelsen af lipidprofilen, der findes i mykobakterier. Den ideelle kombination af opløsningsmidler i elutionssystemerne skal gøre det muligt at visualisere de ønskede lipider i TLC-pladens midterste zone for at lette deres videre rensning, hvis det ønskes. I figur 4bestilles TLC-plader fra det fortyndingssystem, der gør det muligt at overvåge de mest apolare lipider (Figur 4A) til det fortyndingssystem, der gør det muligt at visualisere de mest polære lipider (Figur 4E).

Acyl glyceroler (AG) og PDIMs er to af de mest apolare lipider til stede i mykobakterielle cellevæg og visualiseres let gennem 1D-TLC-analyser ved hjælp af en mobil fase dannet af petroleumsetater: diethyl æter (90:10). Figur 4A viser, at AG'er var til stede i M. bovis BCG, M. fortuitum og M. brumae, men ikke i den glatte morphotype af M. byld. Selv om 1D-TLC antydede tilstedeværelsen af PDIM i M. bovis BCG og M. fortuitum, blev det kun bekræftet i M. bovis BCG, da 2D-TLC-analysen blev udført (Figur 4B). Alt i alt viser disse resultater vigtigheden af at bekræfte tilstedeværelsen af en mykobakteriel forbindelse med mindst to forskellige fortyndingssystemer. En anden interessant lipid at analysere i mycobacteria sammensætning er PGL. I det valgte mycobacteria er PGL kun til stede i M. bovis BCG, og det er mærkbart, når TLC eluteres med elutionssystemet bestående af chloroform og methanol (95:5) (Figur 4C). Efter ideen om at visualisere mere polære komponenter blev elutionssystemet bestående af blandingen af 90:10:1 (chloroform:methanol:vand) brugt til at overvåge tilstedeværelsen af GPLs (Figur 4D), som kun er til stede i M. byldsus glat morphotype. I samme TLC: PGL, trehalose dimycolat (TDM), acyl trehaloses (AT) og trehalose monomycolat (TMM), kan også observeres. PGL, GPLs, TDM, AT blev også observeret øverst på pladen, når elutionssystemet bestod af 30:8:1 (chloroform:methanol:vand) (Figur 4E). TMM er placeret i midten af pladen. TDM og TMM var tydeligt udtrykt i alle mycobacteria undersøgt. På trods af fosfatyl-inositol mannosider (PIMs) observeres i bunden af pladen, er det bedste elutionssystem til analyse af PIMs 60:35:8 (chloroform:methanol:vand) som vist i figur 5A,B. Mens alle sukkerholdige lipider afsløres med anthron (Figur 5A), indeholder PIMs fosfatgrupper, der specifikt afsløres med Molybdæn Blue reagens (Figur 5B). I lighed med mykolicsyrer, AG og PDIMs kan PIMs også let visualiseres gennem 2D-TLC-analyser (Figur 5C). Desuden, i tilfælde af at analysere mycobacteria, der er i stand til at syntetisere LOSs, PIMs og LOSs ville blive differentieret ved hjælp af samme 2D elution system, som beskrevet i Ren et al.8.

Figure 1
Figur 1: Ordningen for udvinding af lipidindholdet i mykobakterier, der dyrkes på faste medier. Vigtigste skridt til at dechifrere lipider til stede på mycobacteria celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ordningen for udvinding af mykolicsyreindhold i mykobakterier, der dyrkes på faste medier. Vigtigste skridt til at dechifrere mykolic syrer til stede på mykobakterier celler ved hjælp af enten (A) syre methanolyse eller (B)safsining. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative resultater af lipidudvinding fra mykobakterier. Tyndtlagskromatografi (TLC) analyse af mykolicsyrer udviklet i (A)85 mL n-hexan, plus 15 mL diethyl ether (tre kørsler) og (B) 100 mL dichlormethan. (C) Todimensionel TLC-analyse af mykossyrer udvundet af syre methanolyse udviklet i 95:5 (n-hexan:acetone) (tre kørsler) i den første retning og 97:3 (toluen:acetone) i den anden retning. (D) Todimensionel TLC-analyse af mykossyrer fra M. fortuitum ekstraheret ved forstning udviklet i 95:5 (n-hexan:acetone) (tre kørsler) i den første retning og 97:3 (toluen:acetone) i den anden retning. TLC'er blev afsløret med 10% molybdatophosphoric syrehydrat i ethanol efterfulgt af opvarmning af pladen ved 120 °C. M. bovis BCG Connaught (Linje 1 og 1'); M. fortuitum (linje 2 og 2«); M. byld glat morphotype (linje 3 og 3') og M. brumae (linje 4 og 4'). 1-4 mykolsyrer fremstillet ved syre methanolyse og 1'-4' mykossyrer opnået ved forstning. Jeg, α-mycolates; II, α'-mycolates; IV, ketomykolater; V, epoxymycolates. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater af lipidudvinding fra mykobakterier. (A) TLC-analyse af acylglyceroler (AG) og phthiocerol dimycocerosatter (PDIMs) udviklet i 90:10 (petroleumsetier (60-80 °C):d iethylther). (B) Todimensionel TLC-analyse af PDIMs og AG udviklet i 98:2 (petroleumsether (60-80 °C):ethylacetat) (tre kørsler) i den første retning og 98:2 (petroleumsether (60-80 °C):acetone) i anden retning. (C) TLC-analyse af phenolglycolipid (PGL) udviklet i punkt 95:5 (chloroform:methanol). (D) TLC-analyser, der er udviklet i punkt 90:10:1 (chloroform:methanol:vand) af PGL, glycopeptidolipids (GPL), trehalose dimycolat (TDM), acyl trehaloses (AT) og trehalosemonmykolat (TMM). (E) TLC-analyse af PGL, GPL, AT, TMM og fosphatidyl-inositol mannosider (PIMs) udviklet i 30:8:1 (chloroform:methanol:vand). A-B-C blev afsløret med 10% molybdatophosphoric syrehydrat i ethanol efterfulgt af opvarmning af pladen ved 120 °C. D-E blev afsløret med 5% i ethanol på 20% α-naphthol i svovlsyre og opvarmet ved 120 °C. Linje 1: M. bovis BCG Connaught; Linje 2: M. fortuitum; Linje 3: M. byld glat morphotype; Linje 4: M. brumae. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater af PIMs fra mycobacteria. (A-B) TLC-analyse af PIMs udviklet i punkt 60:35:8 (chloroform:methanol:vand). (C) Todimensionel TLC-analyse af PIMs udviklet i 60:30:6 (chloroform:methanol:vand) i den første retning og 40:25:3:6 (chloroform:eddikesyre:methanol:vand) i anden retning. A-C blev afsløret med 1% anthron i svovlsyre efterfulgt af opvarmning af pladen ved 120 °C. B blev afsløret med Molybdnum Blue reagens, indtil fosfatbånd dukkede op. Linje 1: M. bovis BCG Connaught; Linje 2: M. fortuitum; Linje 3: M. byld glat morphotype; Linje 4: M. brumae. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En simpel protokol betragtes som guldstandardmetoden til udvinding af noncovalently linked lipidforbindelser fra mykobakterielle cellevæg præsenteres. Yderligere visualisering af en- og todimensionelle TLC'er fra de ekstraherede lipider af fire forskellige mykobakterier vises.

To på hinanden følgende kombinerede blandinger af chloroform og methanol til genfinding af lipidicindholdet i mykobakterielle celler er den mest udbredte opløsningsmiddelblanding23,24,25,26,27,28,29. Denne blanding tillader inddrivelse af en bred vifte af apolare og polære lipider fra cellerne. Ikke desto mindre er nogle andre metoder blevet beskrevet i litteraturen til at udtrække samlede eller specifikke mykobakterielle lipider, som for nylig er blevet gennemgået af Hameed et al.29. For eksempel er Folch-metoden en af de mest anvendte protokoller udviklet til at gendanne de samlede mykobakterielle lipider fra væv30 og er også blevet tilpasset rene mykobakterielle kulturer. Den består i at suspendere mykobakterielle celler i chloroform:methanol (1:2), efterfulgt af centrifugering og tilsætning af chloroform for at opnå et forhold på 1:1. Endelig bruges KCl til at fjerne ikke-lipid komponenter fraekstraktet 31. Parallelt, andre protokoller er blevet udviklet til at udtrække specifikke lipider. Slayden et al. anvendte en blanding af chloroform:methanol plus acetone til specifikt at genvinde glycolipider som TDM eller TMM32. Alt i alt er offentliggjorte metoder baseret på at udsætte mykobakterielle celler for forskellige koncentrationer af opløsningsmidler, hovedsagelig chloroform og methanol. Ligeledes tilsættes nogle salte lejlighedsvis for at kassere andre cellekomponenter, der er til stede på prøven.

Ud over noncovalently forbundet lipider, mykolsyre udvinding ved to forskellige procedurer er også vist. Mens sur methanolyse tillader nem udvinding af mykossyrer med mindre farlige reagenser, bevarer forsuringsproceduren strukturen af alle mykolicsyretyper, herunder type V mykolicsyre, som spaltes under methanolyseprocedurerne. Når lipider er ekstraheret, 1D- eller 2D-TLC er standard metoder til at overvåge dem, og analysen udnyttet varierer afhængigt af de fysisk-kemiske egenskaber af lipider. Polariteten og størrelsen af hvert molekyle vil bestemme udvælgelsen af det elutionssystem, der er nødvendigt, hvilket giver mulighed for bestemmelse af lipider, der udgør en del af mycobacterium. Endimensionel TLC kan vælges, når fastholdelsesfaktorerne (Rf) mellem mykobakterielle lipider er forskellige, mens 2D-TLC letter visualisering, når forskellige lipider deler molekylvægt og polaritetsegenskaber. For at lette identifikationen skal rensede lipider køres parallelt med den ekstraherede prøve for at sammenligne lignende Rf. Identifikationen af en lipid kan opnås, når den kører med den samme Rf som den kendte rensede kontrol mindst i to TLC-systemer (to forskellige mobile faser). Rensede lipider kan fås hos kommercielle leverandører eller fra mykobakterielle forskningslaboratorier. Endelig angiver molekylets biokemiske karakter, hvilken plet der kan bruges til at afsløre TLC-plader. Der er universelle farvningsmetoder, såsom fosfomolybsyre, som gør det muligt at visualisere visualiseringen af enhver organisk komponent, da den binder sig til kulstofbindinger. Mens andre såsom a-naphthol eller anthron giver specifikke farver til sukkerrester, molybdæn blå specifikt binder sig til fosfat rester.

Den vigtigste overvejelse at analysere lipidindholdet i mykobakterier er at undgå brug af plastmateriale under hele procedurerne, da kontakt af organiske opløsningsmidler med plast kan forurene prøverne og kan observeres i TLC-pladerne. Det er også relevant at overveje, at den kulturmediumsammensætning, der anvendes til mycobacteria dyrkning, samt temperatur eller inkubationsdag, kan ændre lipidmønsteret for hvert mycobacterium, som tidligere beskrevet16. Mycobacteria dyrket på enten flydende og faste medier kan bruges til at udtrække de ikke-kovalente forbundne lipider eller mykolicsyrer. Når celler opnås fra flydende kultur, skal de filtreres og tørres tilstrækkeligt for at undgå tilstedeværelsen af flydende medier i prøven. Desuden skal bakterier, når der anvendes mykobakterier fra flydende medier, dyrkes korrekt og ligeligt mellem forsøg for at opnå reproducerbare resultater over tid. Desuden kan mykobakterielle celler også dyrkes på pellicles17,33,34,35,36, hvorfra de mest yderste lipider kan genvindes ved hjælp af organiske opløsningsmidler og overvåges af TLC, som vi viste i denne artikel.

Den vigtigste begrænsning af mykobakterielle lipidudvindingsprocedurer forbliver udnyttelsen af giftige opløsningsmidler under sikre forhold. TLC-proceduren er mindre følsom end andre teknikker, såsom gaskromatografi eller højtydende flydende kromatografi. Desuden tillader TLC ikke kvantificering af prøver, og der skal anvendes yderligere teknikker til at identificere strukturen af de udvundne forbindelser. For eksempel skal nuklear magnetisk resonans udføres for at skelne lipid isomerer. Det er bemærkelsesværdigt, at for at beskrive strukturen af en mykobakteriel lipid for første gang, massespektrometri eller infrarød spektroskopi er påkrævet. Kvantitativ og kvalitativ analyse af lipidklasser kræver således normalt kombinationer af forskellige ekstraktions-, derivatiserings-, kromatografiske og detektionsmetoder, såsom høj- eller ultratydende flydende kromatografi tandem massespektrometri og nuklear magnetisk resonansspektroskopi37,38,39,40. Nylige undersøgelser har vist, at ved hjælp af en enkelt-trins tyndt lag kromatografi-flamme ionisering detektion teknik tillader kvantificering og indledende screening af mykossyrer i Actinobacteria41. Ikke desto mindre er TLC en yderst nyttig, tidsbesparende og billig teknik til at screene og evaluere den lipidiske sammensætning af mycobacteria. Samlet set er de procedurer, der præsenteres her, meget alsidige, der giver grundlæggende værktøjer til at analysere det mest relevante træk ved mycobacteriaceller: dens komplekse cellevæg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev finansieret af det spanske ministerium for videnskab, innovation og universiteter (RTI2018-098777-B-I00), FEDER-fondene og Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido modtager en ph.d.-kontrakt (FI) fra Generalitat de Catalunya.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Merck 100063 CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Acetone Carlo Erba 400971N CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
Anthrone Merck 8014610010 Anthrone for synthesis.
Benzene Carlo Erba 426113 CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l
Capillary glass tube Merck BR708709 BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
Chloroform Carlo Erba 412653 CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heater J.P. Selecta 7471200
Dicloromethane Carlo Erba 412622 CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl ether Carlo Erba 412672 CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L
Ethyl Acetate Panreac 1313181211 CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol Absolute Carlo Erba 4146072 CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glass funnel VidraFOC DURA.2133148 1217/1
Glass tube VidraFOC VFOC.45066A-16125 Glass tube with PTFE recovered cap
Methanol Carlo Erba 412722 CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrate Merck 51429-74-4 CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% Sigma M1942-100ML CAUTION.
n-hexane Carlo Erba 446903 CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylurea Sigma N4766 CAUTION
Orbital shaking platform DDBiolab 995018 NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC) Carlo Erba 427003 CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L
Sprayer VidraFOC 712/1
Sodium sulphate anhydrous Merck 238597
Sulfuric acid 95-97% Merck 1007311000 CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamber Merck Z204226-1EA Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plate Merck 1057210001 TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate Heater CAMAG 223306 CAMAG TLC Plat Heater III
Toluene Carlo Erba 488551 CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
Vortex Fisher Scientific 10132562 IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphthol Sigma-Aldrich 102269427 CAUTION.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
  2. Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
  3. Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
  4. Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
  5. Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
  6. Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
  7. Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
  8. Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
  9. Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
  10. Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
  11. Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
  12. Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
  13. Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
  14. Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
  15. Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  16. Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
  17. Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
  18. Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
  19. Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
  20. Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
  21. Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
  22. Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
  23. Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
  24. Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
  25. Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
  26. Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
  27. Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
  28. Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
  29. Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
  32. Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
  33. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
  34. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
  35. Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
  36. Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  37. Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
  38. Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
  39. Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
  40. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
  41. Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).

Tags

Immunologi og infektion Udgave 170 glycopeptidolipids phenol glycolipider phthiocerol dimycocerosates M. bovis BCG M. brumae M. fortuitum M. byld,mykolic syrer total lipid ekstraktion trehalose-holdige lipider fosfatil-inositol mannosiders
Analyse af Lipid sammensætning af mycobacteria af tyndt lag kromatografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guallar-Garrido, S., Luquin, M.,… More

Guallar-Garrido, S., Luquin, M., Julián, E. Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (170), e62368, doi:10.3791/62368 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter