Summary
Er wordt een protocol gepresenteerd om het totale lipidegehalte van de celwand van een breed scala aan mycobacteriën te extraheren. Bovendien worden extractie- en analyseprotocollen van de verschillende soorten mycolzuren getoond. Een dunne-laag chromatografisch protocol om deze mycobacteriële verbindingen te controleren is ook aanwezig.
Abstract
Mycobacteriënsoorten kunnen van elkaar verschillen in de groeisnelheid, aanwezigheid van pigmentatie, de koloniemorfologie weergegeven op vaste media, evenals andere fenotypische kenmerken. Ze hebben echter allemaal het meest relevante karakter van mycobacteriën gemeen: de unieke en zeer hydrofobe celwand. Mycobacteriën soorten bevatten een membraan-covalent gekoppeld complex dat arabinogalactan, peptidoglycan en lange ketens van mycolische zuren omvat met soorten die verschillen tussen mycobacteriën soorten. Bovendien kunnen mycobacteriën ook lipiden produceren die zich bevinden, niet-covalent gekoppeld, op hun celoppervlakken, zoals phthiocerol dimycocerosaten (PDIM), fenolglycoliden (PGL), glycopeptidolipiden (GPL), acyltrehalosen (AT) of fosfatidil-inositol mannosides (PIM), onder anderen. Sommigen van hen worden beschouwd als virulentiefactoren in pathogene mycobacteriën, of kritische antigene lipiden in gastheer-mycobacteriën interactie. Om deze redenen is er een aanzienlijke interesse in de studie van mycobacteriële lipiden vanwege hun toepassing op verschillende gebieden, van het begrijpen van hun rol in de pathogeniciteit van mycobacteriën-infecties, tot een mogelijke implicatie als immunomodulerende middelen voor de behandeling van infectieziekten en andere pathologieën zoals kanker. Hier wordt een eenvoudige benadering gepresenteerd om het totale lipidengehalte en de mycolzuursamenstelling van mycobacteriëncellen gekweekt in een vast medium met behulp van mengsels van organische oplosmiddelen te extraheren en te analyseren. Zodra de lipide-extracten zijn verkregen, wordt dunnelaagchromatografie (TLC) uitgevoerd om de geëxtraheerde verbindingen te controleren. Het voorbeeldexperiment wordt uitgevoerd met vier verschillende mycobacteriën: de in het milieu snelgroeiende Mycolicibacterium brumae en Mycolicibacterium fortuitum, de verzwakte langzaam groeiende Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) en de opportunistische pathogeen snelgroeiende Mycobacterium abccessus, wat aantoont dat methoden die in het huidige protocol worden getoond, kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan mycobacteriën.
Introduction
Mycobacterium is een geslacht dat pathogene en niet-pathogene soorten omvat, gekenmerkt door een zeer hydrofobe en ondoordringbare celwand gevormd door hun eigenaardige lipiden. In het bijzonder bevat de mycobacteriële celwand mycolzuren, die α-alkyl- en β-hydroxy-vetzuren zijn, waarbij de α-tak constant is in alle mycolzuren (behalve de lengte) en de β-keten, de meromycoladeketen genoemd, een lange alifatische keten is die verschillende functionele chemische groepen kan bevatten die samen met de literatuur worden beschreven (α-, α'-, methoxy-, κ-, epoxy-, carboxy- en ω-1-methoxy-mycolaten), waardoor zeven soorten mycolzuren (I-VII) worden geproduceerd1. Bovendien zijn andere lipiden met onbetwistbaar belang ook aanwezig in de celwand van mycobacteriënsoorten. Pathogene soorten zoals Mycobacterium tuberculosis, de veroorzaker van tuberculose2 produceren specifieke lipide-gebaseerde virulentiefactoren zoals phthiocerol dimycocerosates (PDIMs), fenolglycollipide (PGL), di-, tri- en penta-acyltrehalosen (DAT, TAT en PAT), of sulfolipiden, onder anderen3. Hun aanwezigheid op het mycobacteriële oppervlak is in verband gebracht met het vermogen om de immuunrespons van de gastheer te wijzigen en daarom de evolutie en persistentie van de mycobacterium in de gastheer4. De aanwezigheid van triacylglycerolen (TAG) is bijvoorbeeld geassocieerd met het hypervirulente fenotype van lineage 2-Beijing sublijn van M. tuberculosis, mogelijk vanwege het vermogen om de immuunrespons van de gastheer te verzwakken5,6. Andere relevante lipiden zijn lipooligosacchariden (LOSs) die aanwezig zijn in tuberculeuze en niet-tuberculeuze mycobacteriën. In het geval van Mycobacterium marinum, de aanwezigheid van LOSs in de celwand is gerelateerd aan glijdende beweeglijkheid en het vermogen om biofilms te vormen en interfereert met herkenning door macrofaagpatroonherkenningsreceptoren, waardoor de opname en eliminatie van de bacteriën door gastheerfagocyten wordt beïnvloed7,8. Bovendien maakt de afwezigheid of aanwezigheid van sommige lipiden het mogelijk om leden van dezelfde soort in te delen in verschillende morfotypen met virulente of verzachtende profielen bij interactie met gastheercellen. Bijvoorbeeld de afwezigheid van glycopeptidolipiden (GPL) in het ruwe morfotype van Mycobacterium abscessus is in verband gebracht met het vermogen om intrafagosomale verzuring en bijgevolg celapoptose te induceren9, in tegenstelling tot het gladde morfotype dat GPL's in hun oppervlak bezit. Bovendien is het lipidegehalte van de mycobacteriële celwand gerelateerd aan het vermogen om de immuunrespons in de gastheer te wijzigen. Dit is relevant in de context van het gebruik van sommige mycobacteriën om een beschermend immuunprofiel tegen verschillende pathologieën te activeren10,11,12,13. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat Mycolicibacterium vaccae, een saprofytische mycobacterie, die zich momenteel in fase III klinische studies bevindt als immunotherapeutisch vaccin voor tuberculose, vertoont twee koloniale morfotypen. Terwijl het gladde fenotype, dat een polyester in het oppervlak bevat, een Th2-respons veroorzaakt, kan het ruwe fenotype zonder polyester een Th1-profiel induceren wanneer het interageert met immuuncellen van de gastheer14. Het repertoire van lipiden aanwezig in de mycobacteriële cel hangt niet alleen af van mycobacteriënsoorten, maar ook van de omstandigheden van mycobacteriële culturen: incubatietijd15,16 of samenstelling van het kweekmedium17,18. In feite beïnvloeden veranderingen in de samenstelling van het kweekmedium de antitumor- en immunostimulerende activiteit van M. bovis BCG en Mycolicibacterium brumae in vitro17. Bovendien wordt het beschermende immuunprofiel veroorzaakt door M. bovis BCG tegen M. tuberculosis uitdaging in muizenmodellen hangt ook af van de cultuurmedia waarin M. bovis BCG groeit17. Deze kunnen dan worden gerelateerd aan de lipidesamenstelling van de mycobacteriën in elke kweekconditie. Om al deze redenen is de studie van het lipidengehalte van mycobacteriën relevant. Een visuele procedure om de lipidesamenstelling van de mycobacteriële celwand te extraheren en te analyseren, wordt gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Extractie van de totale niet-covalente lipiden uit mycobacteriën (Figuur 1)
- Kras 0,2 g mycobacteriën uit een vast medium en voeg toe aan een glazen buis met een polytetrafluorethleen (PTFE) schroefdoppen. Voeg een oplossing toe bestaande uit 5 ml chloroform en 10 ml methanol (chloroform:methanol, 1:2).
OPMERKING: Wanneer organische oplosmiddelen worden gebruikt, mag alleen de glasontvanger worden gebruikt. Plastic containers zijn niet toegestaan. Bovendien zijn PTFE liner schroefdoppen voor flessen nodig.
LET OP: Chloroform is een potentieel giftige en uiterst gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Methanol is een potentieel giftige en uiterst gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen). - Laat de buis 's nachts constant roeren om niet-covalente lipiden uit het mycobacteriële celoppervlak te extraheren.
OPMERKING: Als er geen orbitaal schudplatform beschikbaar is, kan constant roeren worden vervangen door periodiek handmatig roeren zo vaak mogelijk. - Bedek een glazen trechter met een filterpapier, filtreer de organische oplosmiddelen en verzamel ze in een glazen buis.
- Gebruik een stikstofgasflux om de vloeibare fase in de buis te verdampen. Vul de buis met stikstofgas, dek af en bewaar deze bij 4 °C.
OPMERKING: Sluit een glazen Pasteur pipet aan op de stroom stikstofgas om specifiek de gewenste buis te verdampen. Houd de buis bovendien in een droge blokverwarmer voor buizen op 37 °C. Wanneer het oplosmiddel verdampt, vult u de buis met stikstofgas voordat u deze sluit. - Voeg 15 ml van een oplossing van chloroform:methanol (2:1) toe aan het cellulaire afval. Laat de buis 's nachts constant roeren om niet-covalente lipiden uit het mycobacteriële celoppervlak te extraheren.
OPMERKING: Als er geen orbitaal schudplatform beschikbaar is, kan constant roeren worden vervangen door periodiek handmatig roeren zo vaak mogelijk. - Laat het mengsel 1 uur rusten. Met een Pasteur pipet, recupereer de organische oplosmiddelen. Bedek een glazen trechter met een filtreerpapier en filtreer de organische oplosmiddelen en verzamel ze in dezelfde glazen buis die eerder in stap 1.3 werd gebruikt. Gebruik een stikstofgasflux om de vloeibare fase in de buis te verdampen. Vul de buis met stikstofgas, sluit hem en bewaar hem opnieuw bij 4 °C.
2. Mycolzuurextractie door zure methanolysis (Figuur 2A)
- Voeg 2-5 ml veresterende oplossing toe aan een hermetische glazen buis met een PTFE-schroefdop. Voeg 0,2 g mycobacteriënbiomassa toe aan de glazen buis.
OPMERKING: Veresterende oplossing wordt gevormd door 30 ml methanol, 15 ml tolueen en 1 ml zwavelzuur te mengen. Mycobacteriëncellen kunnen worden genomen uit vaste culturen of zelfs uit gedelipide cellen na het uitvoeren van extractie van totale niet-covalente lipiden uit mycobacteriën (resterende cellen na filtering in stap 1.6).
LET OP: Tolueen is een ontvlambare en uiterst gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Zwavelzuur is een bijtende en gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen). - Meng de inhoud door te vortexen. Laat het mengsel een nacht in een droog bad bij 80 °C staan.
- Laat de buis afkoelen totdat deze op kamertemperatuur is en voeg vervolgens 2 ml n-hexaan toe aan de buis. Meng de inhoud door 30 s te vortexen en laat de buis bezinken totdat er twee heldere fasen verschijnen.
LET OP: n-hexaan is een potentieel ontvlambare, irriterende, milieubelastende en uiterst gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen). - Herstel de bovenste fase die overeenkomt met de n-hexaanfase. Breng het over naar een nieuwe buis.
- Herhaal stap 2.3. Herstel de bovenste fase opnieuw en breng deze over naar dezelfde buis die in stap 2.4 is gebruikt.
- Verdamp de inhoud van de buis met behulp van een stikstofgasflux. Vul de buis met stikstofgas, sluit deze en bewaar deze bij 4 °C.
3. Mycolzuurextractie door verzeping en methylering (figuur 2B)
- Kras 0,2 g mycobacteriën uit een vast medium en voeg toe aan een glazen buis met een PTFE-schroefdop.
- Voeg 2 ml methanol-benzeenoplossing (80:20) toe die 5% kaliumhydroxide bevat. Meng de inhoud door vortexing. Verwarm het mengsel gedurende 3 uur bij 100 °C.
LET OP: Benzeen is een ontvlambare, kankerverwekkende en gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen). - Laat de buis afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 20% zwavelzuur toe om de monsters te verzuren om een pH = 1 te bereiken.
- Voeg 3 ml diethylether toe. Meng de inhoud voorzichtig door te vortexen.
- Laat de twee fasen zich vormen door te bezinken. Herstel de diethyletherfase en breng over naar een nieuwe buis. Herhaal de wasstap in totaal drie keer.
- Was het diethyletherextract met 2 ml gedestilleerd water en breng het bovenste deel dat overeenkomt met het diethylether over in een nieuwe buis. Herhaal de wasstap in totaal drie keer.
- Voeg 2 g watervrij natriumsulfaat toe aan het diethyletherextract om het te drogen.
- Filter de suspensie. Verdamp het gehalte met behulp van een stikstofgasflux.
- Om de methyleringsstap uit te voeren, lost u 3 g N-nitroso-N-methylureum op in een voorgekoelde oplossing gevormd door 45 ml diethylether en 9 ml 40% KOH in gedestilleerd water.
LET OP: N-nitroso-N-methylurea is een giftige, irriterende, kankerverwekkende en gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen). - Breng het supernatant (diazomethaan) over in een nieuwe kolf, afgekoeld in ijs met kaliumhydroxidekorrels (ongeveer 30 g).
OPMERKING: Als het supernatant niet onmiddellijk wordt gebruikt, kan het maximaal 1 uur bij -20 °C worden bewaard.
LET OP: Kaliumhydroxidekorrels zijn een irriterende en bijtende stof. Dit materiaal moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Diazomethaan is zeer giftig en potentieel explosief. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met veiligheidsglas met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen). - Voeg 2 ml van de etheroplossing die diazomethaan bevat, verkregen in stap 3.10, toe aan het gedroogde diethyletherextract dat mycolzuren bevat, verkregen in stap 3.8. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdamp de suspensie bij 40 °C. Vul de buis met stikstofgas, sluit deze en bewaar de gemethyleerde lipiden bij 4 °C.
OPMERKING: Verdamp het diazomethaan uit de etheroplossing onder de laminaire stroomkap, totdat de ether de gele kleur verliest.
4. Dunne laag chromatografie (TLC) analyse
- Verzadig de glazen TLC-kamer. Om dit te doen, bedekt u een van de wanden van de TLC-kamer met een stuk filterpapier en laat u het in contact komen met de mobiele fase die bestaat uit het mengsel van oplosmiddelen. Plaats het resterende volume van het oplosmiddel op de bodem van de TLC-kamer.
OPMERKING: De bodem van de TLC-kamer moet ten minste 1 cm van de mobiele fase worden bedekt. In de huidige experimenten werden verschillende mobiele fasen gebruikt om de TLC's te ontwikkelen. Ze bestonden uit 85 ml n-hexaan plus 15 ml diethylether; 100 ml dichloormethaan; 90 ml chloroform, 10 ml methanol en 1 ml water; 30 ml chloroform, plus 8 ml methanol en 1 ml water; 60 ml chloroform, plus 35 ml methanol en 8 ml water; 95 ml chloroform plus 5 ml methanol; en 90 ml petroleumether (60-80 °C) plus 10 ml diethylether.
OPMERKING: Gebruik in de tweedimensionale TLC drie keer n-hexaan:aceton (95:5) in de eerste richting en gebruik een enkele ontwikkeling met tolueen:aceton (97:3) in de tweede richting om de samenstelling van mycolzuur te analyseren. Om PIMs te analyseren, gebruik chloroform:methanol:water (60:30:6) eenmaal in de eerste richting en gebruik chloroform:azijnzuur:methanol:water (40:25:3:6) in de tweede richting. Om PDIM en AG te analyseren, gebruikt u petroleumether (60-80 °C): ethylacetaat (98:2) drie keer in de eerste richting en gebruikt u een enkele ontwikkeling met petroleumether (60-80 °C): aceton (98:2) in de tweede richting.
LET OP: Diethylether is een potentieel giftige en gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Dichloormethaan is een potentieel giftige en gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Petroleumether is een potentieel ontvlambare, milieubelastende en uiterst gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Azijnzuur is een potentieel ontvlambare en bijtende stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Ethylacetaat is een ontvlambare en gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Aceton is een ontvlambare en gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen). - Sluit de TLC-kamer om deze gedurende ten minste 20 minuten te verzadigen. Los ondertussen de lipiden in de glazen buis op in 0,2-1 ml chloroform.
OPMERKING: Het volume dat wordt gebruikt om de lipiden op te lossen, kan worden gewijzigd afhankelijk van de gewenste of verwachte concentratie van het monster. - Breng 10 μL van elke suspensie aan met behulp van een capillaire glazen buis direct op de TLC-plaat en laat het monster gedurende 5 minuten drogen bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Monsters moeten worden aangebracht op het onderste deel van de plaat, waardoor 1 cm aan elke kant overblijft. Monsters moeten gedurende ten minste 0,5 cm van elkaar worden gescheiden. Zodra het monster op de plaat is aangebracht, kunnen buizen opnieuw worden verdampt met stikstofgas en bij 4 °C worden opgeslagen voor verder gebruik. - Plaats de plaat in de verzadigde TLC-kamer met de mobiele fase. Laat de mobiele fase door de TLC lopen.
OPMERKING: Elke beweging die op de TLC-kamer wordt toegepast, beïnvloedt het actieve oplosmiddel op de plaat en beïnvloedt de lipidenmobiliteit. In het geval van het uitvoeren van tweedimensionale TLC zijn twee TLC-kamers vereist om beide elutiesystemen te bevatten. - Verwijder de plaat uit de TLC-kamer wanneer het oplosmiddel 1 cm afstand van het bovenste uiteinde van de plaat bereikt. Laat de plaat onder laminaire flux totdat het silica volledig is opgedroogd.
OPMERKING: In het geval van het analyseren van de mycolzuursamenstelling, met behulp van n-hexaan en diethylether (85:15), herhaalt u stap 4.4 en 4.5 twee keer meer, totdat de mobiele fase drie keer over de TLC-plaat wordt uitgevoerd. - Onthul de plaat met de vereiste vlek; verwarm de plaat indien nodig.
OPMERKING: In het huidige experiment werd 15-20 ml van de volgende oplossingen gebruikt om de TLC-platen te spuiten: 10% molybdatofosforzuurhydraat in ethanol totdat de plaat heldergeel is, gevolgd door verwarming van de plaat bij 120 °C; 5% ethanol van 20% α-naftol in zwavelzuur, gevolgd door verhitting van de plaat bij 120 °C; Molybdeenblauw reagens (1,3% molybdeenoxide in 4,2 M zwavelzuur) totdat fosfaatbanden verschenen of 1% anthrone in zwavelzuur.
LET OP: Molybdatofosforzuurhydraat is een ontvlambare en bijtende stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Ethanol is een potentieel ontvlambare en gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: 1-Naftol is een ontvlambare, bijtende en uiterst gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
LET OP: Molybdeen Blue Spray Reagens is een bijtende, giftige en uiterst gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire stroomkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, beschermende brillen en nitrilhandschoenen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met het doel om een breed scala aan lipiden te laten zien die aanwezig zijn in verschillende mycobacteriënsoorten, werd M. bovis BCG geselecteerd omdat het ruwe en langzaam groeiende mycobacteriën zijn. De ruwe en snelgroeiende M. fortuitum en M. brumae werden toegevoegd aan de procedure en ten slotte werd ook het gladde morfotype van M. abcesus opgenomen. Deze vier soorten stellen ons in staat om een breed spectrum van van mycobacteriën afgeleide lipiden te visualiseren, zoals acyltrehaloses (AT), GPL's, PDIM, PGL, PIM, TDM en TMM. Bovendien hebben alle vier de soorten verschillende mycolzuurpatronen.
Na het uitvoeren van de mycolzuurextractieprotocollen werden lipide-extracten geanalyseerd door middel van 1D-TLC-analyse met behulp van twee verschillende, even geldige, elutiesystemen(Figuur 3A,B). De eerste mobiele fase (Figuur 3A) was samengesteld uit n-hexaan en diethylether (85:15), en de plaat werd drie keer uitgevoerd. De tweede mobiele fase bestond voor 100% uit dichloormethaan en de plaat werd eenmaal ge elueerd (figuur 3B). In beide elutiesystemen bevinden mycolzuren zich ongeveer in het midden van de TLC-plaat vanaf de oorsprong van de monstertoepassing. Zoals figuur 3 laat zien, bezit M. brumae alleen type I mycolische zuren, een mycolzuur dat aanwezig is in alle mycobacteriënsoorten. M. bovis BCG heeft type I en IV, M. fortuitum type I en V, en M. abces,type I en II mycolische zuren profielen. Het uitvoeren van twee soorten methylatieprocedures stelt ons in staat om de aanwezigheid van type V mycolzuur te bevestigen, aangezien type V mycolzuur wordt gesplitst tijdens de zure methanolysisprocedure. Zoals figuur 3 laat zien, werd pas na de verzepingsprocedure de vlek waargenomen die overeenkomt met type V mycolzuur. Na methanolysis toonde TLC de afgeleide verbindingen van type V-splitsing die in de buurt van het toepassingspunt19migreerden. Voor neofietonderzoekers kan 2D-TLC een aanvullende methode mogelijk maken om elk mycolzuurtype te identificeren(Figuur 3C,D). Mycolzuurextracten moeten eerst driemaal worden uitgevoerd in een elutiesysteem gevormd door petroleumether (60-80 °C) en aceton (95:5). Vervolgens moet de plaat in de tweede richting worden geleid met een mobiele fase gevormd door tolueen en aceton (97:3). 2D-TLC in combinatie met massaspectrometrie (MS) is gebruikt om de functionele groepen van mycolzuren te identificeren en chemisch te karakteriseren en is op grote schaal gebruikt om mycolzuren te karakteriseren20,21,22. Daarom is het mycolzuurpatroon een van de biochemische kenmerken van waarde in systematische mycobacteriële evaluatie in combinatie met andere analyses als gevolg van gedeelde mycolzuurpatronen tussen verschillende soorten.
Na het uitvoeren van de bovengenoemde procedure om de niet-covalente gekoppelde lipiden te extraheren, werden verschillende elutiesystemen geselecteerd in functie van de polariteit en grootte van het lipidenprofiel in mycobacteriëncellen. De ideale combinatie van oplosmiddelen in de elutiesystemen moet het mogelijk maken om de gewenste lipiden in de middelste zone van de TLC-plaat te visualiseren om hun verdere zuivering, indien gewenst, te vergemakkelijken. In figuur 4worden TLC-platen geordend van het elutiesysteem waarmee de meest apolaire lipiden kunnen worden gecontroleerd (figuur 4A) tot het elutiesysteem waarmee de meest polaire lipiden kunnen worden gevisualiseerd (figuur 4E).
Acylglycerolen (AG) en PDIMs zijn twee van de meest apolaire lipiden die aanwezig zijn in de mycobacteriële celwand en worden gemakkelijk gevisualiseerd door 1D-TLC-analyses met behulp van een mobiele fase gevormd door petroleumether: diethylether (90:10). Figuur 4A laat zien dat IG's aanwezig waren in M. bovis BCG, M. fortuitum en M. brumae, maar niet in het gladde morfotype van M. abcesus. Hoewel 1D-TLC de aanwezigheid van PDIM in M. bovis BCG en M. fortuitumsuggereerde, werd het alleen bevestigd in M. bovis BCG wanneer 2D-TLC-analyse werd uitgevoerd (Figuur 4B). Al met al tonen deze resultaten het belang aan van het bevestigen van de aanwezigheid van een mycobacteriële verbinding door ten minste twee verschillende elutiesystemen. Een ander interessant lipide om te analyseren in de samenstelling van mycobacteriën is PGL. In de gekozen mycobacteriën is PGL alleen aanwezig in M. bovis BCG, en het is merkbaar wanneer TLC wordt ge elueerd met het elutiesysteem bestaande uit chloroform en methanol (95:5) (Figuur 4C). Naar aanleiding van het idee om meer polaire componenten te visualiseren, werd het elutiesysteem bestaande uit het mengsel van 90:10:1 (chloroform:methanol:water) gebruikt om de aanwezigheid van GPL's te controleren (Figuur 4D), die alleen aanwezig zijn in M. abces glad morfotype. In dezelfde TLC: PGL kunnen ook trehalose dimycolate (TDM), acyl trehalosen (AT) en trehalose monomycolate (TMM) worden waargenomen. PGL, GPL's, TDM, AT werden ook waargenomen aan de bovenkant van de plaat wanneer het elutiesysteem bestond uit 30:8:1 (chloroform:methanol:water) (Figuur 4E). TMM bevindt zich in het midden van de plaat. TDM en TMM kwamen duidelijk tot uiting in alle onderzochte mycobacteriën. Ondanks dat fosfatidyl-inositol mannosides (PIMs) worden waargenomen aan de onderkant van de plaat, is het beste elutiesysteem om PIMs te analyseren 60:35:8 (chloroform:methanol:water) zoals weergegeven in Figuur 5A,B. Terwijl alle suikerhoudende lipiden worden onthuld met anthrone(Figuur 5A),bevatten PIMs fosfaatgroepen die specifiek worden onthuld met MolybdeenBlauw reagens(Figuur 5B). Net als bij mycolzuren, AG en PDIMs, kunnen PIMs ook gemakkelijk worden gevisualiseerd door middel van 2D-TLC-analyses(Figuur 5C). Bovendien, in het geval van het analyseren van mycobacteriën die in staat zijn om LOSs te synthetiseren, pims en LOSs zouden worden gedifferentieerd met behulp van hetzelfde 2D-elutiesysteem, zoals beschreven in Ren et al.8.
Figuur 1: Schema van de procedure voor het extraheren van lipidegehalte van mycobacteriën gekweekt op vaste media. Belangrijkste stappen om lipiden te ontcijferen die aanwezig zijn op mycobacteriëncellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van de procedure voor het extraheren van het mycolzuurgehalte van mycobacteriën gekweekt op vaste media. Belangrijkste stappen om mycolzuren op mycobacteriëncellen te ontcijferen met behulp van (A) zure methanolysis of (B) verzeping. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van lipide-extractie uit mycobacteriën. Dunnelaagchromatografie (TLC) analyse van mycolzuren ontwikkeld in (A) 85 ml n-hexaan, plus 15 ml diethylether (drie runs) en (B) 100 ml dichloormethaan. (C)Tweedimensionale TLC-analyse van mycolzuren geëxtraheerd door zure methanolysis ontwikkeld in 95:5 (n-hexaan:aceton) (drie runs) in de eerste richting en 97:3 (tolueen:aceton) in de tweede richting. (D) Tweedimensionale TLC-analyse van mycolzuren uit M. fortuitum geëxtraheerd door verzeping ontwikkeld in 95:5 (n-hexaan:aceton) (drie runs) in de eerste richting en 97:3 (tolueen:aceton) in de tweede richting. TLC's werden onthuld met 10% molybdatofosforzuurhydraat in ethanol, gevolgd door verhitting van de plaat bij 120 °C. M. bovis BCG Connaught (lijn 1 en 1'); M. fortuitum (lijn 2 en 2'); M. abcessus glad morfotype (lijn 3 en 3') en M. brumae (lijn 4 en 4'). 1-4 mycolische zuren verkregen door zure methanolysis en 1'-4' mycolische zuren verkregen door verzeping. Ik, α-mycolaten; II, α'-mycolaten; IV, ketomycolaten; V, epoxymycolaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van lipide-extractie uit mycobacteriën. (A) TLC-analyse van acylglycerolen (AG) en phthiocerol dimycocerosaten (PDIMs) ontwikkeld in 90:10 (petroleumether (60-80 °C) :d iethylether). (B) Tweedimensionale TLC-analyse van PDIMs en AG ontwikkeld in 98:2 (petroleumether (60-80 °C):ethylacetaat) (drie runs) in de eerste richting en 98:2 (petroleumether (60-80 °C):aceton) in de tweede richting. (C)TLC-analyse van fenolglycollipide (PGL) ontwikkeld in 95:5 (chloroform:methanol). (D) TLC-analyses ontwikkeld in 90:10:1 (chloroform:methanol:water) van PGL, glycopeptidolipiden (GPL), trehalose dimycolate (TDM), acyl trehalosen (AT) en trehalose monomycolate (TMM). (E)TLC-analyse van PGL, GPL, AT, TMM en fosfatidyl-inositol mannosides (PIMs) ontwikkeld in 30:8:1 (chloroform:methanol:water). A-B-C werden onthuld met 10% molybdatofosforzuurhydraat in ethanol gevolgd door verhitting van de plaat bij 120 °C. D-E werden onthuld met 5% in ethanol van 20% α-naftol in zwavelzuur en verwarmd bij 120 °C. Lijn 1: M. bovis BCG Connaught; Lijn 2: M. fortuitum; Regel 3: M. abces glad morfotype; Lijn 4: M. brumae. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van PIMs van mycobacteriën. ( A-B ) TLC-analyse van PIMs ontwikkeld in 60:35:8 (chloroform:methanol:water). (C) Tweedimensionale TLC-analyse van PIMs ontwikkeld in 60:30:6 (chloroform:methanol:water) in de eerste richting en 40:25:3:6 (chloroform:azijnzuur:methanol:water) in de tweede richting. A-C werden onthuld met 1% anthrone in zwavelzuur gevolgd door verhitting van de plaat bij 120 °C. B werd onthuld met MolybdeenBlauw reagens totdat fosfaatbanden verschenen. Lijn 1: M. bovis BCG Connaught; Lijn 2: M. fortuitum; Regel 3: M. abces glad morfotype; Lijn 4: M. brumae. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een eenvoudig protocol dat wordt beschouwd als de gouden standaardmethode voor de extractie van niet-covalent gekoppelde lipideverbindingen uit de mycobacteriële celwand wordt gepresenteerd. Verdere visualisatie door een- en tweedimensionale TLC's uit de geëxtraheerde lipiden van vier verschillende mycobacteriën wordt getoond.
Twee opeenvolgende gecombineerde mengsels van chloroform en methanol om het lipidegehalte van mycobacteriële cellen terug te winnen, is het meest gebruikte oplosmiddelmengsel23,24,25,26,27,28,29. Dit mengsel maakt herstel van een breed scala aan apolaire en polaire lipiden uit de cellen mogelijk. Niettemin zijn er enkele andere methoden beschreven in de literatuur om totale of specifieke mycobacteriële lipiden te extraheren, die onlangs zijn beoordeeld door Hameed et al.29. De Folch-methode is bijvoorbeeld een van de meest gebruikte protocollen die zijn ontwikkeld om de totale mycobacteriële lipiden uit weefsels30 te herstellen en is ook aangepast aan pure mycobacteriële culturen. Het bestaat uit het opschorten van mycobacteriële cellen in chloroform:methanol (1:2), gevolgd door centrifugering en de toevoeging van chloroform om een verhouding van 1:1 te verkrijgen. Ten slotte wordt KCl gebruikt om antilipide componenten uit het extract31te verwijderen. Tegelijkertijd zijn er andere protocollen ontwikkeld om specifieke lipiden te extraheren. Slayden etal. gebruikten een mengsel van chloroform:methanol plus aceton om specifiek glycolipiden zoals TDM of TMM32terug te winnen. Al met al zijn gepubliceerde methoden gebaseerd op het blootstellen van mycobacteriële cellen aan verschillende concentraties oplosmiddelen, voornamelijk chloroform en methanol. Evenzo worden sommige zouten af en toe toegevoegd om andere celcomponenten die op het monster aanwezig zijn, weg te gooien.
Naast niet-covalent gekoppelde lipiden wordt ook mycolzuurextractie door twee verschillende procedures getoond. Terwijl zure methanolysis de gemakkelijke extractie van mycolzuren met minder gevaarlijke reagentia mogelijk maakt, behoudt de verzepingsprocedure de structuur van alle mycolische zuurtypen, inclusief type V mycolzuur, dat wordt gesplitst tijdens de methanolysisprocedures. Zodra de lipiden zijn geëxtraheerd, zijn 1D- of 2D-TLC standaardmethoden om ze te controleren, en de gebruikte test varieert afhankelijk van de fysisch-chemische kenmerken van de lipiden. De polariteit en grootte van elk molecuul bepalen de selectie van het benodigde elutiesysteem, waardoor de lipiden die deel uitmaken van de mycobacterium kunnen worden bepaald. Eendimensionale TLC kan worden gekozen wanneer de retentiefactoren (Rf) tussen mycobacteriële lipiden verschillend zijn, terwijl 2D-TLC visualisatie vergemakkelijkt wanneer verschillende lipiden moleculair gewicht en polariteitskenmerken delen. Om de identificatie te vergemakkelijken, moeten gezuiverde lipiden parallel aan het geëxtraheerde monster worden uitgevoerd om vergelijkbare Rf te vergelijken. De identificatie van een lipide kan worden bereikt wanneer het met dezelfde Rf loopt als die van de bekende gezuiverde controle ten minste in twee TLC-systemen (twee verschillende mobiele fasen). Gezuiverde lipiden kunnen worden verkregen bij commerciële leveranciers of bij mycobacteriële onderzoekslaboratoria. Ten slotte geeft de biochemische aard van het molecuul aan welke kleuring kan worden gebruikt om TLC-platen te onthullen. Er zijn universele kleuringsmethoden, zoals fosfolybdisch zuur, waarmee de visualisatie van elke organische component kan worden gevisualiseerd terwijl deze zich bindt aan koolstofbindingen. Terwijl anderen zoals a-naftol of anthrone specifieke kleuren geven aan suikerresten, bindt molybdeenblauw zich specifiek aan fosfaatresiduen.
De belangrijkste overweging om het lipidengehalte van mycobacteriën te analyseren, is om het gebruik van plastic materiaal tijdens de procedures te vermijden, omdat het contact van organische oplosmiddelen met plastic de monsters kan verontreinigen en kan worden waargenomen in de TLC-platen. Het is ook relevant om te overwegen dat de samenstelling van het kweekmedium die wordt gebruikt voor de teelt van mycobacteriën, evenals de temperatuur of dagen van incubatie, het lipidenpatroon van elke mycobacterium kan wijzigen, zoals eerder beschreven16. Mycobacteriën gekweekt op vloeibare en vaste media kunnen worden gebruikt om de niet-covalente gekoppelde lipiden of mycolzuren te extraheren. Bij het verkrijgen van cellen uit vloeibare cultuur moeten ze voldoende worden gefilterd en gedroogd om de aanwezigheid van vloeibare media in het monster te voorkomen. Bovendien moeten bacteriën bij het gebruik van mycobacteriën uit vloeibare media goed en gelijkmatig worden gekweekt tussen experimenten om in de loop van de tijd reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Bovendien kunnen mycobacteriële cellen ook worden gekweekt op pellicles17,33,34,35,36, waaruit de meest buitenste lipiden kunnen worden teruggewonnen met behulp van organische oplosmiddelen en gecontroleerd door TLC, zoals we in dit artikel hebben aangetoond.
De belangrijkste beperking van mycobacteriële lipide-extractieprocedures blijft het gebruik van toxische oplosmiddelen onder veilige omstandigheden. De TLC-procedure is minder gevoelig dan andere technieken, zoals gaschromatografie of high-performance vloeistofchromatografie. Bovendien staat TLC de kwantificering van monsters niet toe en moeten verdere technieken worden toegepast om de structuur van de geëxtraheerde verbindingen te identificeren. Nucleaire magnetische resonantie moet bijvoorbeeld worden uitgevoerd om lipide-isomeren te onderscheiden. Het is opmerkelijk dat voor het beschrijven van de structuur van een mycobacteriële lipide voor de eerste keer massaspectrometrie of infraroodspectroscopie vereist zijn. Kwantitatieve en kwalitatieve analyse van lipideklassen vereist dus normaal gesproken combinaties van verschillende extractie-, derivatisatie-, chromatografische en detectiemethoden, zoals high- of ultra-performance vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantiespectroscopie37,38,39,40. Recente studies hebben aangetoond dat het gebruik van een eenstaps dunnelaag chromatografie-vlam ionisatie detectietechniek de kwantificering en voorlopige screening van mycolische zuren in Actinobacteriën41mogelijk maakt . Niettemin is TLC een uiterst nuttige, tijdbesparende en goedkope techniek om de lipidesamenstelling van mycobacteriën te screenen en te evalueren. Over het algemeen zijn de hier gepresenteerde procedures zeer veelzijdig en bieden ze basishulpmiddelen om het meest relevante kenmerk van mycobacteriëncellen te analyseren: de complexe celwand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten (RTI2018-098777-B-I00), de FEDER-fondsen en de Generalitat van Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido is de ontvanger van een PhD contract (FI) van de Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M.
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E.
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
