Summary
Un protocole est présenté pour extraire la teneur totale en lipides de la paroi cellulaire d’un large éventail de mycobactéries. De plus, les protocoles d’extraction et d’analyse des différents types d’acides mycoliques sont présentés. Un protocole chromatographique sur couche mince pour surveiller ces composés mycobactériens est également fourni.
Abstract
Les espèces de mycobactéries peuvent différer les unes des autres par le taux de croissance, la présence de pigmentation, la morphologie de la colonie affichée sur les milieux solides, ainsi que d’autres caractéristiques phénotypiques. Cependant, ils ont tous en commun le caractère le plus pertinent des mycobactéries: sa paroi cellulaire unique et hautement hydrophobe. Les espèces de mycobactéries contiennent un complexe membranaire-covalent qui comprend l’arabinogalactane, le peptidoglycane et de longues chaînes d’acides mycoliques avec des types qui diffèrent entre les espèces de mycobactéries. En outre, les mycobactéries peuvent également produire des lipides situés, non liés de manière covalente, à la surface de leurs cellules, tels que les dimycocérosates de phtiocérol (PDIM), les glycolipides phénoliques (PGL), les glycopeptidolipides (GPL), les acyltréhaloses (AT) ou les mannosides de phosphatidil-inositol (PIM), entre autres. Certains d’entre eux sont considérés comme des facteurs de virulence dans les mycobactéries pathogènes, ou des lipides antigéniques critiques dans l’interaction hôte-mycobactéries. Pour ces raisons, il existe un intérêt significatif pour l’étude des lipides mycobactériens en raison de leur application dans plusieurs domaines, de la compréhension de leur rôle dans la pathogénicité des infections à mycobactéries, à une implication possible en tant qu’agents immunomodulateurs pour le traitement des maladies infectieuses et d’autres pathologies telles que le cancer. Ici, une approche simple pour extraire et analyser la teneur totale en lipides et la composition en acide mycolique des cellules de mycobactéries cultivées dans un milieu solide à l’aide de mélanges de solvants organiques est présentée. Une fois les extraits lipidiques obtenus, une chromatographie sur couche mince (TLC) est effectuée pour surveiller les composés extraits. L’exemple d’expérience est réalisé avec quatre mycobactéries différentes: mycolicibacterium brumae et Mycolicibacterium fortuitum, mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), à croissance lente atténuée, et Mycobacterium abcessus ,un pathogène opportuniste à croissance rapide, démontrant que les méthodes présentées dans le présent protocole peuvent être utilisées pour un large éventail de mycobactéries.
Introduction
Mycobacterium est un genre qui comprend des espèces pathogènes et non pathogènes, caractérisées par une paroi cellulaire hautement hydrophobe et imperméable formée par leurs lipides particuliers. Plus précisément, la paroi cellulaire mycobactérienne contient des acides mycoliques, qui sont des acides gras α-alkyle et β-hydroxy, dans lesquels la branche α est constante dans tous les acides mycoliques (à l’exception de la longueur) et la chaîne β, appelée chaîne méroromycolate, est une longue chaîne aliphatique qui peut contenir différents groupes chimiques fonctionnels décrits avec la littérature (α-, α'-, méthoxy-, Mycolates κ-, époxy-, carboxy- et ω-1-méthoxy-), produisant donc sept types d’acides mycoliques (I-VII)1. De plus, d’autres lipides d’une importance incontestable sont également présents dans la paroi cellulaire des espèces de mycobactéries. Espèces pathogènes telles que Mycobacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose2 produire des facteurs de virulence spécifiques à base de lipides tels que les dimycocérosates de phtiocérol (PDIM), les glycolipides phénoliques (PGL), les di-, tri- et penta-acyltréhaloses (DAT, TAT et PAT), ou les sulfolipides, entre autres3. Leur présence sur la surface mycobactérielle a été associée à la capacité de modifier la réponse immunitaire de l’hôte et, par conséquent, à l’évolution et à la persistance de la mycobactérie à l’intérieur de l’hôte.4. Par exemple, la présence de triacylglycérols (TAG) a été associée au phénotype hypervirulent de la sous-lignée 2-Beijing de M. tuberculosis, peut-être en raison de sa capacité à atténuer la réponse immunitaire de l’hôte5,6. D’autres lipides pertinents sont les lipooligosaccharides (LS) présents dans les mycobactéries tuberculeuses et non tuberculeuses. Dans le cas de Mycobacterium marinum, la présence de LS dans sa paroi cellulaire est liée à la motilité glissante et à la capacité de former des biofilms et interfère avec la reconnaissance par les récepteurs de reconnaissance des formes de macrophages, affectant l’absorption et l’élimination des bactéries par les phagocytes hôtes7,8. De plus, l’absence ou la présence de certains lipides permet aux membres d’une même espèce d’être classés en différents morphotypes avec des profils virulents ou atténués lorsqu’ils interagissent avec les cellules hôtes. Par exemple, l’absence de glycopeptidolipides (GPL) dans le morphotype approximatif de Mycobacterium abscessus a été associé à la capacité d’induire une acidification intraphagosomale et, par conséquent, une apoptose cellulaire9, contrairement au morphotype lisse qui possède des GPG à leur surface. De plus, la teneur en lipides de la paroi cellulaire mycobactérielle est liée à la capacité de modifier la réponse immunitaire chez l’hôte. Ceci est pertinent dans le contexte de l’utilisation de certaines mycobactéries pour déclencher un profil immunitaire protecteur contre différentes pathologies10,11,12,13. Il a été démontré, par exemple, que Mycolicibacterium vaccae, une mycobactérie saprophyte, qui fait actuellement l’objet d’essais cliniques de phase III en tant que vaccin immunothérapeutique contre la tuberculose, présente deux morphotypes coloniaux. Alors que le phénotype lisse, qui contient un polyester à sa surface, déclenche une réponse Th2, le phénotype rugueux dépourvu de polyester peut induire un profil Th1 lorsqu’il interagit avec les cellules immunitaires de l’hôte.14. Le répertoire des lipides présents dans la cellule mycobactérielle dépend non seulement des espèces de mycobactéries, mais aussi des conditions des cultures mycobactériennes: temps d’incubation15,16 ou la composition du milieu de culture17,18. En fait, les changements dans la composition du milieu de culture affectent l’activité antitumorale et immunostimulante de M. bovis BCG et Mycolicibacterium brumae in vitro17. De plus, le profil immunitaire protecteur déclenché par M. bovis BCG contre M. tuberculosis le défi dans les modèles de souris dépend également du milieu de culture dans lequel M. bovis Le BCG se développe17. Ceux-ci pourraient alors être liés à la composition lipidique des mycobactéries dans chaque condition de culture. Pour toutes ces raisons, l’étude de la teneur en lipides des mycobactéries est pertinente. Une procédure visuelle pour extraire et analyser la composition lipidique de la paroi cellulaire mycobactérienne est présentée.
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Protocol
1. Extraction des lipides totaux non liés par covalents des mycobactéries (Figure 1)
- Rayer 0,2 g de mycobactéries d’un milieu solide et ajouter à un tube de verre avec un bouchon à vis de doublure en polytétrafluoroéthène (PTFE). Ajouter une solution composée de 5 mL de chloroforme et de 10 mL de méthanol (chloroforme:méthanol, 1:2).
REMARQUE: Lorsque des solvants organiques sont utilisés, seul le récipient en verre doit être utilisé. Aucun contenant en plastique n’est autorisé. De plus, des bouchons à vis en PTFE pour les bouteilles sont nécessaires.
ATTENTION : Le chloroforme est une substance potentiellement toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : Le méthanol est une substance potentiellement toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile). - Laissez le tube en agitation constante pendant la nuit pour extraire les lipides non liés à la covalence de la surface de la cellule mycobactérielle.
REMARQUE: Si une plate-forme d’agitation orbitale n’est pas disponible, l’agitation constante peut être remplacée par une agitation manuelle périodique aussi souvent que possible. - Couvrez un entonnoir de verre avec un papier filtre, filtrez les solvants organiques et collectez-les dans un tube en verre.
- Utilisez un flux d’azote gazeux pour évaporer la phase liquide dans le tube. Remplissez le tube d’azote gazeux, couvrez-le et conservez-le à 4 °C.
REMARQUE: Connectez une pipette Pasteur en verre au flux d’azote gazeux pour évaporer spécifiquement le tube souhaité. De plus, maintenez le tube à l’intérieur d’un bloc chauffant sec pour les tubes à 37 ° C. Lorsque le solvant s’évapore, remplissez le tube d’azote gazeux avant de le fermer. - Ajouter 15 mL d’une solution de chloroforme:méthanol (2:1) aux débris cellulaires. Laissez le tube en agitation constante pendant la nuit pour extraire les lipides non liés à la covalence de la surface de la cellule mycobactérielle.
REMARQUE: Si une plate-forme d’agitation orbitale n’est pas disponible, l’agitation constante peut être remplacée par une agitation manuelle périodique aussi souvent que possible. - Laisser reposer le mélange pendant 1 h. Avec une pipette Pasteur, récupérez les solvants organiques. Recouvrez un entonnoir de verre avec un papier filtre et filtrez les solvants organiques et collectez-les dans le même tube de verre précédemment utilisé à l’étape 1.3. Utilisez un flux d’azote gazeux pour évaporer la phase liquide dans le tube. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez-le à nouveau à 4 °C.
2. Extraction de l’acide mycolique par méthanolyse acide (Figure 2A)
- Ajouter 2 à 5 mL de solution estérifiante dans un tube en verre hermétique avec un bouchon à vis en PTFE. Ajouter 0,2 g de biomasse de mycobactéries dans le tube de verre.
REMARQUE: La solution estérifiante est formée en mélangeant 30 mL de méthanol, 15 mL de toluène et 1 mL d’acide sulfurique. Les cellules de mycobactéries peuvent être prélevées à partir de cultures solides ou, même, de cellules délipidées après avoir effectué l’extraction de lipides totaux non liés à la covalente de mycobactéries (cellules restantes après filtrage à l’étape 1.6).
ATTENTION : Le toluène est une substance inflammable et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : L’acide sulfurique est une substance corrosive et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile). - Mélangez le contenu en vortexant. Laissez le mélange reposer dans un bain sec à 80 °C pendant la nuit.
- Laissez refroidir le tube jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante, puis ajoutez 2 mL de n-hexane au tube. Mélanger le contenu en vortexant pendant 30 s et laisser le tube se déposer jusqu’à ce que deux phases claires apparaissent.
ATTENTION : Le n-hexane est une substance potentiellement inflammable, irritante, dommageable pour l’environnement et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile). - Récupérer la phase supérieure correspondant à la phase n-hexane. Transférez-le dans un nouveau tube.
- Répétez l’étape 2.3. Récupérez à nouveau la phase supérieure et transférez-la dans le même tube que celui utilisé à l’étape 2.4.
- Évaporer le contenu du tube à l’aide d’un flux d’azote gazeux. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez-le à 4 °C.
3. Extraction de l’acide mycolique par saponification et méthylation (Figure 2B)
- Rayer 0,2 g de mycobactéries d’un support solide et ajouter à un tube de verre avec un bouchon à vis en PTFE.
- Ajouter 2 mL de solution méthanol-benzène (80:20) contenant 5 % d’hydroxyde de potassium. Mélanger le contenu en vortexant. Chauffer le mélange pendant 3 h à 100 °C.
ATTENTION : Le benzène est une substance inflammable, cancérigène et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile). - Laissez le tube refroidir à la température ambiante. Ajouter 20% d’acide sulfurique pour acidifier les échantillons afin d’obtenir un pH = 1.
- Ajouter 3 mL d’éther diéthylique. Mélanger doucement le contenu en vortexant.
- Laissez les deux phases se former en s’installant. Récupérez la phase d’éther diéthylique et transférez-la dans un nouveau tube. Répétez l’étape de lavage pour un total de trois fois.
- Laver l’extrait d’éther diéthylique avec 2 mL d’eau distillée et transférer la partie supérieure correspondant à l’éther diéthylique dans un nouveau tube. Répétez l’étape de lavage pour un total de trois fois.
- Ajouter 2 g de sulfate de sodium anhydre sur l’extrait d’éther diéthylique pour le sécher.
- Filtrer la suspension. Évaporez le contenu à l’aide d’un flux d’azote gazeux.
- Pour effectuer l’étape de méthylation, dissoudre 3 g de N-nitroso-N-méthyl urée dans une solution prérefroidie formée de 45 mL d’éther diéthylique et de 9 mL de KOH à 40 % dans de l’eau distillée.
ATTENTION : La N-nitroso-N-méthylurée est une substance toxique, irritante, cancérigène et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile). - Transférer le surnageant (diazométhane) dans une nouvelle fiole refroidie dans de la glace contenant des pastilles d’hydroxyde de potassium (environ 30 g).
REMARQUE: Si le surnageant n’est pas immédiatement utilisé, il peut être conservé à -20 °C pendant un maximum de 1 h.
ATTENTION : Les pastilles d’hydroxyde de potassium sont une substance irritante et corrosive. Ce matériau doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : Le diazométhane est hautement toxique et potentiellement explosif. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire avec du verre de sécurité portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile). - Ajouter 2 mL de la solution d’éther contenant du diazométhane, obtenue à l’étape 3.10, dans l’extrait d’éther diéthylique séché qui contient des acides mycoliques, obtenu à l’étape 3.8. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Évaporer la suspension à 40 °C. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez les lipides méthylés à 4 °C.
REMARQUE: Évaporez le diazométhane de la solution d’éther sous la hotte à écoulement laminaire, jusqu’à ce que l’éther perde sa couleur jaune.
4. Analyse par chromatographie sur couche mince (TLC)
- Saturer la chambre TLC en verre. Pour ce faire, recouvrez l’une des parois de la chambre TLC d’un morceau de papier filtre et laissez-la entrer en contact avec la phase mobile composée par le mélange de solvants. Placez le volume restant du solvant sur le fond de la chambre TLC.
REMARQUE: Le fond de la chambre TLC doit être recouvert d’au moins 1 cm de la phase mobile. Dans les expériences actuelles, différentes phases mobiles ont été utilisées pour développer les TLC. Ils étaient constitués de 85 mL de n-hexane plus 15 mL d’éther diéthylique; 100 mL de dichlorométhane; 90 mL de chloroforme, 10 mL de méthanol et 1 mL d’eau; 30 mL de chloroforme, plus 8 mL de méthanol et 1 mL d’eau; 60 mL de chloroforme, plus 35 mL de méthanol et 8 mL d’eau; 95 mL de chloroforme plus 5 mL de méthanol; et 90 mL d’éther de pétrole (60-80 °C) plus 10 mL d’éther diéthylique.
REMARQUE: Dans le TLC bidimensionnel, utilisez n-hexane:acétone (95:5) dans la première direction trois fois, et utilisez un seul développement avec toluène:acétone (97:3) dans la deuxième direction pour analyser la composition en acide mycolique. Pour analyser les PIP, utilisez chloroforme:méthanol:eau (60:30:6) dans la première direction une fois, et utilisez chloroforme:acide acétique:méthanol:eau (40:25:3:6) dans la deuxième direction. Pour analyser pdIM et AG, utilisez trois fois l’éther de pétrole (60-80 °C): acétate d’éthyle (98:2) dans la première direction, et utilisez un seul développement avec de l’éther de pétrole (60-80 °C): acétone (98:2) dans la deuxième direction.
ATTENTION : L’éther diéthylique est une substance potentiellement toxique et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : Le dichlorométhane est une substance potentiellement toxique et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : L’éther de pétrole est une substance potentiellement inflammable, dommageable pour l’environnement et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : L’acide acétique est une substance potentiellement inflammable et corrosive. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : L’acétate d’éthyle est une substance inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : L’acétone est une substance inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile). - Fermez la chambre TLC pour la saturer pendant au moins 20 min. Pendant ce temps, dissoudre les lipides présents dans le tube de verre dans 0,2-1 mL de chloroforme.
REMARQUE: Le volume utilisé pour dissoudre les lipides peut être modifié en fonction de la concentration souhaitée ou attendue de l’échantillon. - Appliquer 10 μL de chaque suspension à l’aide d’un tube de verre capillaire directement sur la plaque TLC et laisser sécher l’échantillon pendant 5 min à température ambiante.
REMARQUE: Les échantillons doivent être appliqués dans la partie inférieure de la plaque en laissant 1 cm de chaque côté. Les échantillons doivent être séparés les uns des autres sur une longueur d’au moins 0,5 cm. Une fois l’échantillon appliqué sur la plaque, les tubes peuvent être évaporés à nouveau avec de l’azote gazeux et stockés à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. - Insérez la plaque dans la chambre TLC saturée contenant la phase mobile. Laissez la phase mobile passer par le TLC.
REMARQUE: Tout mouvement appliqué à la chambre TLC affecte le solvant en cours d’exécution sur la plaque et affecte la mobilité des lipides. Dans le cas de l’exécution d’un TLC bidimensionnel, deux chambres TLC sont nécessaires pour contenir les deux systèmes d’élution. - Retirez la plaque de la chambre TLC lorsque le solvant atteint une distance de 1 cm de l’extrémité supérieure de la plaque. Laissez la plaque sous flux laminaire jusqu’à ce que la silice soit totalement séchée.
REMARQUE: Dans le cas de l’analyse de la composition de l’acide mycolique, en utilisant du n-hexane et de l’éther diéthylique (85:15), répétez les étapes 4.4 et 4.5 deux fois plus, jusqu’à ce que la phase mobile soit exécutée trois fois sur la plaque TLC. - Révélez la plaque avec la tache requise; chauffer la plaque si nécessaire.
REMARQUE: Dans la présente expérience, 15 à 20 mL des solutions suivantes ont été utilisées pour pulvériser les plaques TLC: hydrate d’acide molybdatophosphorique à 10% dans l’éthanol jusqu’à ce que la plaque soit jaune vif, puis chauffage de la plaque à 120 ° C; 5 % dans l’éthanol de 20 % α-naphtol dans l’acide sulfurique, puis chauffage de la plaque à 120 °C; Réactif bleu de molybdène (1,3 % d’oxyde de molybdène dans de l’acide sulfurique 4,2 M) jusqu’à l’apparition de bandes phosphate ou 1 % d’anthrone dans l’acide sulfurique.
ATTENTION : L’hydrate d’acide molybdatophosphorique est une substance inflammable et corrosive. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : L’éthanol est une substance potentiellement inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : Le 1-naphtol est une substance inflammable, corrosive et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : Le réactif molybdène Blue Spray est une substance corrosive, toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
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Representative Results
Dans le but de montrer un large éventail de lipides présents dans différentes espèces de mycobactéries, M. bovis BCG a été sélectionné car il s’agit de mycobactéries rugueuses et à croissance lente. Les M. fortuitum et M. brumae rugueux et à croissance rapide ont été ajoutés à la procédure et, enfin, le morphotype lisse de M. abscessus a également été inclus. Ces quatre espèces nous permettent de visualiser un large spectre de lipides dérivés de mycobactéries tels que les acyltréhaloses (AT), les GPL, le PDIM, le PGL, le PIM, le TDM et le TMM. De plus, les quatre espèces ont des profils d’acide mycolique différents.
Après avoir effectué les protocoles d’extraction de l’acide mycolique, les extraits lipidiques ont été analysés par analyse 1D-TLC à l’aide de deux systèmes d’élution différents, également valides (Figure 3A, B). La première phase mobile(Figure 3A)était composée de n-hexane et d’éther diéthylique (85:15), et la plaque a été exécutée trois fois. La deuxième phase mobile était constituée à 100 % de dichlorométhane et la plaque a été éluée une fois(Figure 3B). Dans les deux systèmes d’élution, les acides mycoliques sont situés approximativement au milieu de la plaque TLC à partir de l’origine de l’application de l’échantillon. Comme le montre la figure 3, M. brumae ne possède que des acides mycoliques de type I, un acide mycolique présent dans toutes les espèces de mycobactéries. M. bovis Le BCG a des profils d’acides mycoliques de type I et IV, M. fortuitum de type I et V, et M. abscessus,de type I et II. L’exécution de deux types de procédures de méthylation nous permet de confirmer la présence d’acide mycolique de type V puisque l’acide mycolique de type V est clivé pendant la procédure de méthanolyse acide. Comme le montre la figure 3, ce n’est qu’après la procédure de saponification que l’on a observé la tache correspondant à l’acide mycolique de type V. Après la méthanolyse, TLC a montré les composés dérivés du clivage de type V qui ont migré près du point d’application19. Pour les chercheurs néophytes, le 2D-TLC peut permettre une méthode complémentaire pour identifier chaque type d’acide mycolique(Figure 3C,D). Les extraits d’acide mycolique doivent d’abord être exécutés dans un système d’élution formé par l’éther de pétrole (60-80 °C) et l’acétone (95:5) trois fois. Ensuite, la plaque doit être exécutée dans la deuxième direction avec une phase mobile formée de toluène et d’acétone (97:3). 2D-TLC combiné avec la spectrométrie de masse (MS) a été utilisé pour identifier et caractériser chimiquement les groupes fonctionnels des acides mycoliques et a été largement utilisé pour caractériser les acides mycoliques20,21,22. Par conséquent, le profil d’acide mycolique est l’une des caractéristiques biochimiques de valeur dans l’évaluation mycobactérienne systématique en combinaison avec d’autres analyses en raison des modèles d’acide mycolique partagés entre différentes espèces.
Après avoir effectué la procédure susmentionnée pour extraire les lipides liés non covalents, différents systèmes d’élution ont été sélectionnés en fonction de la polarité et de la taille du profil lipidique trouvé dans les cellules de mycobactéries. La combinaison idéale de solvants dans les systèmes d’élution devrait permettre de visualiser les lipides souhaités dans la zone médiane de la plaque TLC pour faciliter leur purification ultérieure, si vous le souhaitez. Dans la Figure 4,les plaques TLC sont ordonnées du système d’élution qui permet de surveiller les lipides les plus apolaires(Figure 4A)au système d’élution qui permet de visualiser le plus grand nombre de lipides polaires(Figure 4E).
Les acylglycérols (AG) et les PDIM sont deux des lipides les plus apolaires présents dans la paroi cellulaire mycobactériennes et sont facilement visualisés grâce à des analyses 1D-TLC à l’aide d’une phase mobile formée par l’éther de pétrole: l’éther diéthylique (90:10). La figure 4A montre que les AG étaient présents chez M. bovis BCG, M. fortuitum et M. brumae mais pas dans le morphotype lisse de M. abcès. Bien que le 1D-TLC ait suggéré la présence de PDIM dans M. bovis BCG et M. fortuitum,il n’a été corroboré dans le BCG M. bovis que lorsque l’analyse 2D-TLC a été effectuée(Figure 4B). Dans l’ensemble, ces résultats démontrent l’importance de corroborer la présence d’un composé mycobactérien par au moins deux systèmes d’élution différents. Un autre lipide intéressant à analyser dans la composition des mycobactéries est le PGL. Dans les mycobactéries choisies, le PGL n’est présent que dans le BCG de M. bovis, et il est perceptible lorsque le TLC est élué avec le système d’élution composé de chloroforme et de méthanol (95:5)(Figure 4C). Suivant l’idée de visualiser des composants plus polaires, le système d’élution constitué du mélange de 90:10:1 (chloroforme:méthanol:eau) a été utilisé pour surveiller la présence de LPG(Figure 4D),qui ne sont présents que dans le morphotype lisse de M. abcès. Dans le même TLC: PGL, dimycolate de tréhalose (TDM), acyl tréhaloses (AT) et monomycolate de tréhalose (TMM), peuvent également être observés. PGL, GPLs, TDM, AT ont également été observés au sommet de la plaque lorsque le système d’élution était composé de 30:8:1 (chloroforme:méthanol:eau)(Figure 4E). TMM est situé au milieu de la plaque. La GDT et la MTT ont été clairement exprimées dans toutes les mycobactéries étudiées. Bien que des mannosides de phosphatidyl-inositol (MIP) soient observés au bas de la plaque, le meilleur système d’élution pour analyser les MIP est de 60:35:8 (chloroforme:méthanol:eau) comme le montre la figure 5A,B. Alors que tous les lipides contenant du sucre sont révélés avec l’anthrone (Figure 5A), les MIP contiennent des groupes phosphate qui sont spécifiquement révélés avec le réactif Molybdenum Blue (Figure 5B). Semblables aux acides mycoliques, aux AG et aux PDIM, les PIP peuvent également être facilement visualisés grâce à des analyses 2D-TLC(Figure 5C). De plus, dans le cas de l’analyse des mycobactéries capables de synthétiser les LS, les PAM et les LS seraient différenciés à l’aide du même système d’élution 2D, comme détaillé dans Ren et al.8.
Figure 1: Schéma de la procédure d’extraction de la teneur en lipides des mycobactéries cultivées sur des milieux solides. Principales étapes pour déchiffrer les lipides présents sur les cellules de mycobactéries. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Schéma de la procédure d’extraction de la teneur en acide mycolique des mycobactéries cultivées sur des milieux solides. Principales étapes pour déchiffrer les acides mycoliques présents sur les cellules de mycobactéries en utilisant soit (A) la méthanolyse acide ou (B) la saponification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Résultats représentatifs de l’extraction des lipides des mycobactéries. Analyse par chromatographie sur couche mince (TLC) d’acides mycoliques développés en (A) 85 mL de n-hexane, plus 15 mL d’éther diéthylique (trois séries) et (B) 100 mL de dichlorométhane. (C) Analyse TLC bidimensionnelle des acides mycoliques extraits par méthanolyse acide développée en 95:5 (n-hexane:acétone) (trois séries) dans la première direction et 97:3 (toluène:acétone) dans la seconde direction. (D) Analyse TLC bidimensionnelle des acides mycoliques de M. fortuitum extraits par saponification développée en 95:5 (n-hexane:acétone) (trois séries) dans la première direction et 97:3 (toluène:acétone) dans la seconde direction. Les TLC ont été révélés avec 10% d’hydrate d’acide molybdatophosphorique dans l’éthanol, suivis du chauffage de la plaque à 120 °C. M. bovis BCG Connaught (lignes 1 et 1'); M. fortuitum (lignes 2 et 2'); M. abcèssus morphotype lisse (lignes 3 et 3') et M. brumae (lignes 4 et 4'). 1-4 acides mycoliques obtenus par méthanolyse acide et 1'-4' acides mycoliques obtenus par saponification. I, α-mycolates; II, α'-mycolates; IV, cétomycolates; V, époxymycolates. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Résultats représentatifs de l’extraction lipidique des mycobactéries. (A) Analyse TLC des acylglycérols (AG) et des dimycocéros de phthiocérol (PDIM) développés en 90:10 (éther de pétrole (60-80 °C):d éther iéthylique). (B) Analyse TLC bidimensionnelle des PDIM et AG développée en 98:2 (éther de pétrole (60-80 °C):acétate d’éthyle) (trois essais) dans la première direction et 98:2 (éther de pétrole (60-80 °C):acétone) dans la seconde. (C) Analyse TLC du glycolipide phénolique (PGL) développé en 95:5 (chloroforme:méthanol). (D) Analyses TLC développées en 90:10:1 (chloroforme:méthanol:eau) de PGL, glycopeptidolipides (GPL), dimycolate de tréhalose (TDM), acyl tréhaloses (AT) et monomycolate de tréhalose (TMM). (E) Analyse TLC des mannosides PGL, GPL, AT, TMM et phosphatidyl-inositol (PIMs) développés en 30:8:1 (chloroforme:méthanol:eau). A-B-C ont été révélés avec 10% d’hydrate d’acide molybdatophosphorique dans l’éthanol suivi d’un chauffage de la plaque à 120 ° C. D-E ont été révélés avec 5% dans l’éthanol de 20% de α-naphtol dans l’acide sulfurique et chauffé à 120 ° C. Ligne 1: M. bovis BCG Connaught; Ligne 2 : M. fortuitum; Ligne 3 : Morphotype lisse de M. abcès; Ligne 4: M. brumae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Résultats représentatifs des MIP provenant de mycobactéries. (A-B) Analyse TLC des MIP développés en 60:35:8 (chloroforme:méthanol:eau). (C) Analyse TLC bidimensionnelle des MIP développés en 60:30:6 (chloroforme:méthanol:eau) dans la première direction et 40:25:3:6 (chloroforme:acide acétique:méthanol:eau) dans la seconde direction. A-C ont été révélés avec 1% d’anthrone dans l’acide sulfurique suivi d’un chauffage de la plaque à 120 ° C. B a été révélé avec un réactif Molybdenum Blue jusqu’à l’apparition de bandes de phosphate. Ligne 1: M. bovis BCG Connaught; Ligne 2 : M. fortuitum; Ligne 3 : Morphotype lisse de M. abcès; Ligne 4: M. brumae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un protocole simple considéré comme la méthode de référence pour l’extraction de composés lipidiques non liés par cocovalence de la paroi cellulaire mycobactérielle est présenté. Une visualisation plus poussée par des TLC unidimensionnels et bidimensionnels à partir des lipides extraits de quatre mycobactéries différentes est montrée.
Deuxmélanges combinés consécutifs de chloroforme et de méthanol pour récupérer la teneur lipidique des cellules mycobactériennes est le mélange de solvants le plus largement utilisé23,24,25,26,27,28,29. Ce mélange permet de récupérer une large gamme de lipides apolaires et polaires des cellules. Néanmoins, d’autres méthodes ont été décrites dans la littérature pour extraire des lipides mycobactériens totaux ou spécifiques, qui ont été récemment examinés par Hameed et al.29. Par exemple, la méthode Folch est l’un des protocoles les plus largement utilisés développés pour récupérer les lipides mycobactériens totaux des tissus30 et a également été adapté aux cultures mycobactériennes pures. Elle consiste à suspendre les cellules mycobactériennes dans le chloroforme:méthanol (1:2), suivies d’une centrifugation et de l’addition de chloroforme pour obtenir un rapport de 1:1. Enfin, KCl est utilisé pour éliminer les composants non lipidiques de l’extrait31. En parallèle, d’autres protocoles ont été développés pour extraire des lipides spécifiques. Slayden etal. ont utilisé un mélange de chloroforme:méthanol plus acétone pour récupérer spécifiquement les glycolipides tels que TDM ou TMM32. Dans l’ensemble, les méthodes publiées sont basées sur l’exposition des cellules mycobactériennes à différentes concentrations de solvants, principalement le chloroforme et le méthanol. De même, certains sels sont parfois ajoutés pour éliminer d’autres composants cellulaires présents sur l’échantillon.
En plus des lipides non liés de manière non covalente, l’extraction de l’acide mycolique par deux procédures différentes est également montrée. Alors que la méthanolyse acide permet l’extraction facile des acides mycoliques avec des réactifs moins dangereux, la procédure de saponification préserve la structure de tous les types d’acide mycolique, y compris l’acide mycolique de type V, qui est clivé pendant les procédures de méthanolyse. Une fois les lipides extraits, les TLC 1D ou 2D sont des méthodes standard pour les surveiller, et le test utilisé varie en fonction des caractéristiques physico-chimiques des lipides. La polarité et la taille de chaque molécule détermineront la sélection du système d’élution nécessaire, permettant de déterminer les lipides qui font partie de la mycobactérie. Le TLC unidimensionnel peut être choisi lorsque les facteurs de rétention (Rf) entre les lipides mycobactériens sont différents, tandis que le TLC 2D facilite la visualisation lorsque différents lipides partagent des caractéristiques de poids moléculaire et de polarité. Pour faciliter l’identification, les lipides purifiés doivent être exécutés parallèlement à l’échantillon extrait pour comparer des Rf similaires. L’identification d’un lipide peut être réalisée lorsqu’il fonctionne avec le même Rf que celui du contrôle purifié connu au moins dans deux systèmes TLC (deux phases mobiles différentes). Les lipides purifiés peuvent être obtenus auprès de fournisseurs commerciaux ou de laboratoires de recherche mycobactériens. Enfin, la nature biochimique de la molécule indique quelle tache peut être utilisée pour révéler les plaques TLC. Il existe des méthodes de coloration universelles, telles que l’acide phosphomolybdique qui permet de visualiser n’importe quel composant organique lorsqu’il se lie à des liaisons carbone. Alors que d’autres comme l’a-naphtol ou l’anthrone fournissent des couleurs spécifiques aux résidus de sucre, le bleu de molybdène se lie spécifiquement aux résidus de phosphate.
La considération la plus importante pour analyser la teneur en lipides des mycobactéries est d’éviter l’utilisation de matière plastique tout au long des procédures, car le contact de solvants organiques avec du plastique peut contaminer les échantillons et peut être observé dans les plaques TLC. Il est également pertinent de considérer que la composition du milieu de culture utilisé pour la culture des mycobactéries, ainsi que la température ou les jours d’incubation, peuvent modifier le profil lipidique de chaque mycobactérie, comme décrit précédemment16. Les mycobactéries cultivées sur des milieux liquides et solides peuvent être utilisées pour extraire les lipides liés non covalents ou les acides mycoliques. Lors de l’obtention de cellules à partir d’une culture liquide, elles doivent être correctement filtrées et séchées pour éviter la présence de milieux liquides dans l’échantillon. De plus, lors de l’utilisation de mycobactéries à partir de milieux liquides, les bactéries doivent être cultivées correctement et également entre les expériences afin d’obtenir des résultats reproductibles dans le temps. De plus, les cellules mycobactériennes peuvent également être cultivées sur les pellicules17,33,34,35,36, à partir desquelles les lipides les plus externes peuvent être récupérés à l’aide de solvants organiques et surveillés par TLC, comme nous l’avons montré dans le présent article.
La principale limite des procédures d’extraction des lipides mycobactériens reste l’utilisation de solvants toxiques dans des conditions sûres. La procédure TLC est moins sensible que d’autres techniques, telles que la chromatographie en phase gazeuse ou la chromatographie liquide à haute performance. En outre, la TLC ne permet pas la quantification des échantillons et d’autres techniques doivent être appliquées pour identifier la structure des composés extraits. Par exemple, la résonance magnétique nucléaire doit être effectuée pour distinguer les isomères lipidiques. Il est à noter que pour décrire la structure d’un lipide mycobactérien pour la première fois, une spectrométrie de masse ou une spectroscopie infrarouge sont nécessaires. Ainsi, l’analyse quantitative et qualitative des classes de lipides nécessite normalement des combinaisons de différentes méthodes d’extraction, de dérivatisation, de chromatographie et de détection, telles que la chromatographie liquide à haute ou ultra-performance spectrométrie de masse en tandem et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire37,38,39,40. Des études récentes ont démontré que l’utilisation d’une technique de détection par chromatographie sur couche mince-ionisation de flamme en une seule étape permet la quantification et le criblage préliminaire des acides mycoliques chez les Actinobactéries41. Néanmoins, TLC est une technique extrêmement utile, rapide et peu coûteuse pour dépister et évaluer la composition lipidique des mycobactéries. Dans l’ensemble, les procédures présentées ici sont très polyvalentes et fournissent des outils de base pour analyser la caractéristique la plus pertinente des cellules de mycobactéries: sa paroi cellulaire complexe.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le ministère espagnol de la Science, de l’Innovation et des Universités (RTI2018-098777-B-I00), les Fonds FEDER et la Generalitat de Catalogne (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido est titulaire d’un contrat de doctorat (FI) de la Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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