Summary
Es wird ein Protokoll vorgestellt, um den Gesamtlipidgehalt der Zellwand einer Vielzahl von Mykobakterien zu extrahieren. Darüber hinaus werden Extraktions- und Analyseprotokolle der verschiedenen Arten von Mykolsäuren gezeigt. Ein dünnschichtchromatographisches Protokoll zur Überwachung dieser mykobakteriellen Verbindungen wird ebenfalls bereitgestellt.
Abstract
Mykobakterienarten können sich in der Wachstumsrate, dem Vorhandensein von Pigmentierung, der koloniemorphologischen Auf festen Medien sowie anderen phänotypischen Merkmalen voneinander unterscheiden. Sie alle haben jedoch den relevantesten Charakter von Mykobakterien gemeinsam: ihre einzigartige und hochhydrophobe Zellwand. Mykobakterien-Arten enthalten einen membrankovalenten Komplex, der Arabinogalactan, Peptidoglycan und lange Ketten von Mykolsäuren mit Typen umfasst, die sich zwischen mykobakterienarten unterscheiden. Darüber hinaus können Mykobakterien auch Lipide produzieren, die sich nicht kovalent auf ihren Zelloberflächen befinden, wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIM), phenolische Glykolipide (PGL), Glykopeptidolipide (GPL), Acyltrehalose (AT) oder Phosphatidil-Inositol-Mannosiside (PIM). Einige von ihnen gelten als Virulenzfaktoren in pathogenen Mykobakterien oder kritische antigene Lipide in der Wirt-Mykobakterien-Interaktion. Aus diesen Gründen besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung von mykobakteriellen Lipiden aufgrund ihrer Anwendung in verschiedenen Bereichen, vom Verständnis ihrer Rolle bei der Pathogenität von Mykobakterieninfektionen bis hin zu einer möglichen Implikation als immunmodulatorische Mittel für die Behandlung von Infektionskrankheiten und anderen Pathologien wie Krebs. Hier wird ein einfacher Ansatz zur Extraktion und Analyse des Gesamtlipidgehalts und der Mykolsäurezusammensetzung von Mykobakterienzellen vorgestellt, die in einem festen Medium unter Verwendung von Mischungen organischer Lösungsmittel gezüchtet wurden. Sobald die Lipidextrakte erhalten sind, wird eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durchgeführt, um die extrahierten Verbindungen zu überwachen. Das Beispielexperiment wird mit vier verschiedenen Mykobakterien durchgeführt: dem schnell wachsenden Mycolicibacterium brumae und Mycolicibacterium fortuitum, dem abgeschwächten langsam wachsenden Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) und dem opportunistischen Erreger Mycobacterium abscessus, was zeigt, dass die im vorliegenden Protokoll gezeigten Methoden bei einer Vielzahl von Mykobakterien eingesetzt werden können.
Introduction
Mycobacterium ist eine Gattung, die pathogene und nicht-pathogene Arten umfasst, die sich durch eine hochhydrophobe und undurchlässige Zellwand auszeichnen, die durch ihre eigenartigen Lipide gebildet wird. Insbesondere enthält die mykobakterielle Zellwand Mykolsäuren, α-Alkyl- und β-Hydroxyfettsäuren sind, bei denen der α-Zweig in allen Mykolsäuren (mit Ausnahme der Länge) konstant ist und die β-Kette, die Meromykolatkette genannt, eine lange aliphatische Kette ist, die verschiedene funktionelle chemische Gruppen enthalten kann, die zusammen mit der Literatur beschrieben werden (α-, α'-, Methoxy-, κ-, Epoxid-, Carboxy- und ω-1-Methoxy-Mykolaten), die daher sieben Arten von Mykolsäuren (I-VII) produzieren1. Darüber hinaus sind auch andere Lipide von unbestreitbarer Bedeutung in der Zellwand von Mykobakterienarten vorhanden. Pathogene Arten wie Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose2 produzieren spezifische lipidbasierte Virulenzfaktoren wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIMs), phenolisches Glykolipid (PGL), Di-, Tri- und Penta-Acyltrehalose (DAT, TAT und PAT) oder Sulfolipide, unter anderem3. Ihre Anwesenheit auf der mykobakteriellen Oberfläche wurde mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, die Immunantwort des Wirts und damit die Evolution und Persistenz des Mykobakteriums im Wirt zu modifizieren4. Zum Beispiel wurde das Vorhandensein von Triacylglycerinen (TAG) mit dem hypervirulenten Phänotyp der Lineage 2-Beijing-Unterlinie von M. tuberculosis, möglicherweise aufgrund seiner Fähigkeit, die Immunantwort des Wirts abzuschwächen5,6. Andere relevante Lipide sind Lipooligosaccharide (LOS), die in tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien vorkommen. Im Falle von Mycobacterium marinumhängt das Vorhandensein von LOSs in seiner Zellwand mit der gleitenden Motilität und der Fähigkeit, Biofilme zu bilden, zusammen und stört die Erkennung durch Makrophagenmustererkennungsrezeptoren, was die Aufnahme und Ausscheidung der Bakterien durch Wirtspagoozyten beeinflusst7,8. Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen oder Vorhandensein einiger Lipide die Klassifizierung von Mitgliedern derselben Spezies in verschiedene Morphotypen mit virulenten oder dämpfenden Profilen, wenn sie mit Wirtszellen interagieren. Zum Beispiel das Fehlen von Glykopeptidolipiden (GPL) im groben Morphotyp von Mycobacterium abscessus wurde mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, eine intraphagosomale Übersäuerung und folglich Zellapoptose zu induzieren9, im Gegensatz zum glatten Morphotyp, der GPLs in seiner Oberfläche besitzt. Darüber hinaus hängt der Lipidgehalt der mykobakteriellen Zellwand mit der Fähigkeit zusammen, die Immunantwort im Wirt zu modifizieren. Dies ist relevant im Zusammenhang mit der Verwendung einiger Mykobakterien, um ein schützendes Immunprofil gegen verschiedene Pathologien auszulösen10,11,12,13. Es wurde beispielsweise nachgewiesen, dass Mycolicibacterium vaccae, ein saprophytisches Mykobakterium, das sich derzeit in klinischen Phase-III-Studien als immuntherapeutischer Impfstoff gegen Tuberkulose befindet, weisen zwei koloniale Morphotypen auf. Während der glatte Phänotyp, der ein Polyester in seiner Oberfläche enthält, eine Th2-Reaktion auslöst, kann der raue Phänotyp ohne Polyester ein Th1-Profil induzieren, wenn er mit Immunzellen des Wirts interagiert.14. Das Repertoire der in der mykobakteriellen Zelle vorhandenen Lipide hängt nicht nur von mykobakterienarten ab, sondern auch von den Bedingungen der mykobakteriellen Kulturen: Zeitpunkt der Inkubation15,16 oder Zusammensetzung des Kulturmediums17,18. Tatsächlich beeinflussen Veränderungen in der Zusammensetzung des Kulturmediums die Antitumor- und immunstimulierende Aktivität von M. bovis BCG und Mycolicibacterium brumae in vitro17. Darüber hinaus wird das schützende Immunprofil ausgelöst durch M. bovis BCG gegen M. tuberculosis Die Herausforderung in Mäusemodellen hängt auch von den Nährmedien ab, in denen M. bovis BCG wächst17. Diese könnten dann mit der Lipidzusammensetzung der Mykobakterien in jedem Kulturzustand zusammenhängen. Aus all diesen Gründen ist die Untersuchung des Lipidgehalts von Mykobakterien relevant. Ein visuelles Verfahren zur Extraktion und Analyse der Lipidzusammensetzung der mykobakteriellen Zellwand wird vorgestellt.
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Protocol
1. Extraktion der gesamten nicht-kovalenten Lipide aus Mykobakterien (Abbildung 1)
- 0,2 g Mykobakterien aus einem festen Medium zerkratzen und mit einem Polytetrafluorethlen (PTFE)-Liner-Schraubverschluss in ein Glasrohr geben. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die aus 5 ml Chloroform und 10 ml Methanol (Chloroform: Methanol, 1: 2) besteht.
HINWEIS: Wenn organische Lösungsmittel verwendet werden, sollte nur Glasempfänger verwendet werden. Kunststoffbehälter sind nicht erlaubt. Darüber hinaus werden PTFE-Liner-Schraubverschlüsse für Flaschen benötigt.
ACHTUNG: Chloroform ist eine potenziell giftige und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Methanol ist eine potenziell giftige und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden. - Lassen Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren, um nicht-kovalente Lipide aus der mykobakteriellen Zelloberfläche zu extrahieren.
HINWEIS: Wenn keine orbitale Schüttelplattform verfügbar ist, kann das ständige Rühren so oft wie möglich durch regelmäßiges manuelles Rühren ersetzt werden. - Decken Sie einen Glastrichter mit einem Filterpapier ab, filtern Sie die organischen Lösungsmittel und sammeln Sie sie in einem Glasrohr.
- Verwenden Sie einen Stickstoffgasfluss, um die flüssige Phase im Rohr zu verdampfen. Füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, decken Sie es ab und lagern Sie es bei 4 °C.
HINWEIS: Schließen Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas an den Stickstoffgasstrom an, um das gewünschte Rohr gezielt zu verdampfen. Halten Sie das Rohr zusätzlich in einer Trockenblockheizung für Rohre bei 37 ° C. Wenn das Lösungsmittel verdampft, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, bevor Sie es schließen. - 15 ml einer Lösung von Chloroform:Methanol (2:1) zu den Zelltrümmern hinzufügen. Lassen Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren, um nicht-kovalente Lipide aus der mykobakteriellen Zelloberfläche zu extrahieren.
HINWEIS: Wenn keine orbitale Schüttelplattform verfügbar ist, kann das ständige Rühren so oft wie möglich durch regelmäßiges manuelles Rühren ersetzt werden. - Lassen Sie die Mischung für 1 h ruhen. Mit einer Pasteur-Pipette die organischen Lösungsmittel zurückgewinnen. Decken Sie einen Glastrichter mit einem Filterpapier ab, filtern Sie die organischen Lösungsmittel und sammeln Sie sie in demselben Glasröhrchen, das zuvor in Schritt 1.3 verwendet wurde. Verwenden Sie einen Stickstoffgasfluss, um die flüssige Phase im Rohr zu verdampfen. Füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, schließen Sie es und lagern Sie es wieder bei 4 °C.
2. Mykolsäureextraktion durch saure Methanolyse (Abbildung 2A)
- 2-5 ml Veresterungslösung in ein hermetisches Glasrohr mit einem PTFE-Liner-Schraubverschluss geben. Fügen Sie 0,2 g Mykobakterien-Biomasse in das Glasrohr hinzu.
HINWEIS: Veresternde Lösung wird durch Mischen von 30 ml Methanol, 15 ml Toluol und 1 ml Schwefelsäure gebildet. Mykobakterienzellen können aus festen Kulturen oder sogar aus entgifteten Zellen entnommen werden, nachdem insgesamt nicht-kovalente Lipide aus Mykobakterien entnommen wurden (verbleibende Zellen nach Filterung in Schritt 1.6).
ACHTUNG: Toluol ist ein brennbarer und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Schwefelsäure ist ein ätzendes und gefährliches Nährstoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden. - Mischen Sie den Inhalt durch Vortexing. Lassen Sie die Mischung über Nacht in einem trockenen Bad bei 80 °C stehen.
- Lassen Sie das Röhrchen abkühlen, bis es die Raumtemperatur erreicht hat, und fügen Sie dann 2 mL n-Hexan in das Rohr hinzu. Mischen Sie den Inhalt durch Wirbeln für 30 s und lassen Sie das Rohr absetzen, bis zwei klare Phasen erscheinen.
ACHTUNG: n-Hexan ist ein potenziell brennbarer, reizender, umweltschädlicher und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden. - Rückgewinnung der oberen Phase, die der n-Hexanphase entspricht. Übertragen Sie es in eine neue Röhre.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3. Stellen Sie die obere Phase wieder her und übertragen Sie sie auf das gleiche Rohr, das in Schritt 2.4 verwendet wurde.
- Verdampfen Sie den Inhalt des Rohres mit einem Stickstoffgasfluss. Füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, schließen Sie es und lagern Sie es bei 4 °C.
3. Mykolsäureextraktion durch Verseifung und Methylierung (Abbildung 2B)
- 0,2 g Mykobakterien aus einem festen Medium zerkratzen und mit einem PTFE-Schraubverschluss in ein Glasrohr geben.
- Fügen Sie 2 ml Methanol-Benzol-Lösung (80:20) hinzu, die 5% ige Kaliumhydroxid enthält. Mischen Sie den Inhalt durch Vortexing. Die Mischung 3 h bei 100 °C erhitzen.
ACHTUNG: Benzol ist ein brennbarer, krebserregender und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden. - Lassen Sie das Rohr auf Raumtemperatur abkühlen. Fügen Sie 20% Schwefelsäure hinzu, um die Proben zu säuern, um einen pH-Wert von = 1 zu erreichen.
- Fügen Sie 3 ml Diethylether hinzu. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Wirbeln.
- Lassen Sie die beiden Phasen durch Absetzen bilden. Rückgewinnung der Diethyletherphase und Übergabe an ein neues Rohr. Wiederholen Sie den Waschschritt insgesamt dreimal.
- Waschen Sie den Diethyletherextrakt mit 2 ml destilliertem Wasser und übertragen Sie den oberen Teil, der dem Diethylether entspricht, in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie den Waschschritt insgesamt dreimal.
- Fügen Sie 2 g wasserfreies Natriumsulfat über den Diethyletherextrakt hinzu, um es zu trocknen.
- Filtern Sie die Suspension. Verdampfen Sie den Inhalt mit einem Stickstoffgasfluss.
- Um den Methylierungsschritt durchzuführen, lösen Sie 3 g N-Nitroso-N-methylharnstoff in einer vorgekühlten Lösung, die aus 45 ml Diethylether und 9 ml 40% KOH in destilliertem Wasser gebildet wird.
ACHTUNG: N-Nitroso-N-methylharnstoff ist ein giftiger, reizender, krebserregender und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden. - Den Überstand (Diazomethan) in einen neuen Kolben geben, der in eishaltigen Kaliumhydroxidpellets (ca. 30 g) gekühlt wird.
HINWEIS: Wenn der Überstand nicht sofort verwendet wird, kann er bei -20 °C für maximal 1 h gelagert werden.
VORSICHT: Kaliumhydroxidpellets sind eine reizende und ätzende Substanz. Dieses Material muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Diazomethan ist hochgiftig und potenziell explosiv. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit Sicherheitsglas verwendet werden, die mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) getragen wird. - 2 ml der Diazomethan enthaltenden Etherlösung, erhalten in Schritt 3.10, werden in den getrockneten Diethyletherextrakt, der Mykolsäuren enthält, zugegeben, der in Schritt 3.8 erhalten wurde. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Verdampfen Sie die Suspension bei 40 °C. Füllen Sie das Röhrchen mit Stickstoffgas, schließen Sie es und lagern Sie die methylierten Lipide bei 4 °C.
HINWEIS: Verdampfen Sie das Diazomethan aus der Etherlösung unter der laminaren Strömungshaube, bis der Ether die gelbe Farbe verliert.
4. Dünnschichtchromatographie (TLC) Analyse
- Sättigen Sie die Glas-TLC-Kammer. Bedecken Sie dazu eine der Wände der TLC-Kammer mit einem Stück Filterpapier und lassen Sie sie mit der mobilen Phase in Kontakt treten, die aus dem Lösungsmittelgemisch besteht. Legen Sie das verbleibende Volumen des Lösungsmittels auf den Boden der TLC-Kammer.
HINWEIS: Der Boden der TLC-Kammer muss von mindestens 1 cm der mobilen Phase bedeckt sein. In den vorliegenden Experimenten wurden verschiedene mobile Phasen zur Entwicklung der TLCs verwendet. Sie bestanden aus 85 ml n-Hexan plus 15 ml Diethylether; 100 ml Dichlormethan; 90 ml Chloroform, 10 ml Methanol und 1 ml Wasser; 30 ml Chloroform plus 8 ml Methanol und 1 ml Wasser; 60 ml Chloroform plus 35 ml Methanol und 8 ml Wasser; 95 ml Chloroform plus 5 ml Methanol; und 90 mL Petrolether (60-80 °C) plus 10 ml Diethylether.
HINWEIS: Verwenden Sie im zweidimensionalen TLC dreimal n-Hexan:Aceton (95:5) in der ersten Richtung und verwenden Sie eine einzige Entwicklung mit Toluol:Aceton (97:3) in der zweiten Richtung, um die Mykolsäurezusammensetzung zu analysieren. Um PIMs zu analysieren, verwenden Sie Chloroform:Methanol:Wasser (60:30:6) einmal in die erste Richtung und Chloroform:Essigsäure:Methanol:Wasser (40:25:3:6) in die zweite Richtung. Um PDIM und AG zu analysieren, verwenden Sie Petrolether (60-80 °C): Ethylacetat (98: 2) in der ersten Richtung dreimal und verwenden Sie eine einzige Entwicklung mit Petrolether (60-80 ° C): Aceton (98: 2) in der zweiten Richtung.
ACHTUNG: Diethylether ist ein potenziell toxischer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Dichlormethan ist ein potenziell toxischer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Petrolether ist ein potenziell brennbarer, umweltschädlicher und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Essigsäure ist eine potenziell brennbare und ätzende Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Ethylacetat ist ein brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Aceton ist ein brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden. - Schließen Sie die TLC-Kammer, um sie für mindestens 20 Minuten zu sättigen. In der Zwischenzeit lösen Sie die im Glasrohr vorhandenen Lipide in 0,2-1 ml Chloroform auf.
HINWEIS: Das Volumen, das zum Auflösen der Lipide verwendet wird, kann in Abhängigkeit von der gewünschten oder erwarteten Konzentration der Probe modifiziert werden. - Tragen Sie 10 μL jeder Suspension mit einem Kapillarglasröhrchen direkt auf die TLC-Platte auf und lassen Sie die Probe 5 min bei Raumtemperatur trocknen.
HINWEIS: Die Proben müssen am unteren Teil der Platte angebracht werden, wobei auf jeder Seite 1 cm übrig bleibt. Die Proben müssen mindestens 0,5 cm voneinander getrennt werden. Nach dem Auftragen der Probe auf die Platte können die Röhrchen wieder mit Stickstoffgas verdampft und bei 4 °C für die weitere Verwendung gelagert werden. - Setzen Sie die Platte in die gesättigte TLC-Kammer ein, die die mobile Phase enthält. Lassen Sie die mobile Phase durch den TLC laufen.
HINWEIS: Jede Bewegung, die auf die TLC-Kammer angewendet wird, wirkt sich auf das laufende Lösungsmittel auf der Platte aus und beeinträchtigt die Lipidmobilität. Bei der Durchführung von zweidimensionalem TLC sind zwei TLC-Kammern erforderlich, die beide Elutionssysteme enthalten. - Entfernen Sie die Platte aus der TLC-Kammer, wenn das Lösungsmittel 1 cm Vom oberen Ende der Platte entfernt ist. Lassen Sie die Platte unter laminarem Flussmittel, bis die Kieselsäure vollständig getrocknet ist.
HINWEIS: Bei der Analyse der Mykolsäurezusammensetzung unter Verwendung von n-Hexan und Diethylether (85:15) wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5 zweimal mehr, bis die mobile Phase dreimal über die TLC-Platte läuft. - Zeigen Sie die Platte mit dem erforderlichen Fleck; Erhitzen Sie die Platte bei Bedarf.
HINWEIS: Im vorliegenden Experiment wurden 15-20 ml der folgenden Lösungen verwendet, um die TLC-Platten zu sprühen: 10% Molybdatophosphorsäurehydrat in Ethanol, bis die Platte hellgelb ist, gefolgt von erhitzen der Platte bei 120 ° C; 5% in Ethanol von 20% α-Naphthol in Schwefelsäure, gefolgt von Erhitzen der Platte bei 120 °C; Molybdänblaues Reagenz (1,3% Molybdänoxid in 4,2 M Schwefelsäure), bis Phosphatbänder oder 1% Anthron in Schwefelsäure auftraten.
ACHTUNG: Molybdatophosphorsäurehydrat ist eine brennbare und ätzende Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Ethanol ist ein potenziell brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: 1-Naphthol ist eine brennbare, ätzende und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: Molybdän Blue Spray Reagenz ist eine ätzende, giftige und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
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Representative Results
Mit dem Ziel, eine breite Palette von Lipiden in verschiedenen Mykobakterienarten zu zeigen, wurde M. bovis BCG ausgewählt, da es sich um raue und langsam wachsende Mykobakterien handelt. Die rauen und schnell wachsenden M. fortuitum und M. brumae wurden in das Verfahren aufgenommen und schließlich wurde auch der glatte Morphotyp von M. abscessus einbezogen. Diese vier Arten ermöglichen es uns, ein breites Spektrum von mykobakterienbasierten Lipiden wie Acyltrehalose (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM und TMM zu visualisieren. Darüber hinaus haben alle vier Arten unterschiedliche Mykolsäuremuster.
Nach Durchführung der Mykolsäure-Extraktionsprotokolle wurden Lipidextrakte durch 1D-TLC-Analyse mit zwei verschiedenen, gleich gültigen Elutionssystemen analysiert (Abbildung 3A, B). Die erste mobile Phase (Abbildung 3A) bestand aus n-Hexan und Diethylether (85:15), und die Platte wurde dreimal ausgeführt. Die zweite mobile Phase bestand zu 100% aus Dichlormethan und die Platte wurde einmal eluiert (Abbildung 3B). In beiden Elutionssystemen befinden sich Mykolsäuren ungefähr in der Mitte der TLC-Platte ab dem Ursprung der Probenanwendung. Wie Abbildung 3 zeigt, besitzt M. brumae nur Mykolsäuren vom Typ I, eine Mykolsäure, die in allen Mykobakterienarten vorhanden ist. M. bovis BCG hat Typ I und IV, M. fortuitum Typ I und V und M. abscessus,Typ I und II MykolsäurenProfile. Die Durchführung von zwei Arten von Methylierungsverfahren ermöglicht es uns, das Vorhandensein von Mykolsäure typ V zu bestätigen, da Mykolsäure Typ V während des Säuremethanolyseverfahrens gespalten wird. Wie Abbildung 3 zeigt, wurde erst nach dem Verseifungsverfahren der Punkt beobachtet, der der Typ V Mykolsäure entspricht. Nach der Methanolyse zeigte TLC die abgeleiteten Verbindungen aus der Typ-V-Spaltung, die in der Nähe des Anwendungspunktes19migrierten. Für Neophytenforscher kann 2D-TLC eine komplementäre Methode zur Identifizierung jedes Mykolsäuretyps ermöglichen (Abbildung 3C,D). Mykolsäureextrakte müssen zunächst dreimal in einem Elutionssystem aus Petrolether (60-80 °C) und Aceton (95:5) ausgeführt werden. Dann muss die Platte in die zweite Richtung mit einer beweglichen Phase aus Toluol und Aceton (97:3) geführt werden. 2D-TLC in Kombination mit Massenspektrometrie (MS) wurde verwendet, um die funktionellen Gruppen von Mykolsäuren zu identifizieren und chemisch zu charakterisieren und wurde ausgiebig verwendet, um Mykolsäuren20,21,22zu charakterisieren . Daher ist das Mykolsäuremuster eines der biochemischen Merkmale, die bei der systematischen mykobakteriellen Bewertung in Kombination mit anderen Analysen aufgrund gemeinsamer Mykolsäuremuster verschiedener Spezies von Wert sind.
Nach Durchführung des oben genannten Verfahrens zur Extraktion der nicht-kovalenten verknüpften Lipide wurden verschiedene Elutionssysteme in Abhängigkeit von der Polarität und Größe des Lipidprofils in Mykobakterienzellen ausgewählt. Die ideale Kombination von Lösungsmitteln in den Elutionssystemen sollte es ermöglichen, die gewünschten Lipide in der mittleren Zone der TLC-Platte sichtbar zu machen, um ihre weitere Reinigung zu erleichtern, falls gewünscht. In Abbildung 4sind TLC-Platten vom Elutionssystem, mit dem die meisten apolaren Lipide überwacht werden können (Abbildung 4A), bis zum Elutionssystem, mit dem die polarsten Lipide visualisiert werden können (Abbildung 4E) angeordnet.
Acylglycerine (AG) und PDIMs sind zwei der apolarsten Lipide in der mykobakteriellen Zellwand und können durch 1D-TLC-Analysen mit einer mobilen Phase, die aus Petrolether: Diethylether (90: 10) gebildet wird, leicht visualisiert werden. Abbildung 4A zeigt, dass AGs in M. bovis BCG, M. fortuitum und M. brumae vorhanden waren, aber nicht im glatten Morphotyp von M. abscessus. Obwohl 1D-TLC das Vorhandensein von PDIM in M. bovis BCG und M. fortuitumnahelegte, wurde es bei M. bovis BCG nur bestätigt, wenn eine 2D-TLC-Analyse durchgeführt wurde (Abbildung 4B). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, wie wichtig es ist, das Vorhandensein einer mykobakteriellen Verbindung durch mindestens zwei verschiedene Elutionssysteme zu bestätigen. Ein weiteres interessantes Lipid, das in der Zusammensetzung von Mykobakterien analysiert werden kann, ist PGL. In den ausgewählten Mykobakterien ist PGL nur in M. bovis BCG vorhanden, und es macht sich bemerkbar, wenn TLC mit dem Elutionssystem aus Chloroform und Methanol eluiert wird (95:5) (Abbildung 4C). Der Idee folgend, mehr polare Komponenten zu visualisieren, wurde das Elutionssystem bestehend aus der Mischung von 90:10:1 (Chloroform:Methanol:Wasser) verwendet, um das Vorhandensein von GPLs zu überwachen(Abbildung 4D),die nur im glatten Morphotyp M. abscessus vorhanden sind. Im selben TLC: PGL, Trehalose Dimycolat (TDM), Acyl Trehalose (AT) und Trehalose Monomycolat (TMM) können ebenfalls beobachtet werden. PGL, GPLs, TDM, AT wurden auch an der Oberseite der Platte beobachtet, wenn das Elutionssystem aus 30:8:1 (Chloroform:Methanol:Wasser) bestand (Abbildung 4E). TMM befindet sich in der Mitte der Platte. TDM und TMM waren in allen untersuchten Mykobakterien eindeutig exprimiert. Obwohl Phosphatidyl-Inositol-Mannoside (PIMs) am Boden der Platte beobachtet werden, ist das beste Elutionssystem zur Analyse von PIMs 60:35:8 (Chloroform:Methanol:Wasser), wie in Abbildung 5A,Bgezeigt. Während alle zuckerhaltigen Lipide mit Anthron aufgedeckt werden (Abbildung 5A), enthalten PIMs Phosphatgruppen, die spezifisch mit Molybdänblau-Reagenz aufgedeckt werden (Abbildung 5B). Ähnlich wie Mykolsäuren, AG und PDIMs können PIMs auch durch 2D-TLC-Analysen einfach visualisiert werden (Abbildung 5C). Darüber hinaus würden bei der Analyse von Mykobakterien, die in der Lage sind, LOSs zu synthetisieren, PIMs und LOSs mit dem gleichen 2D-Elutionssystem unterschieden werden, wie in Ren et al.8beschrieben.
Abbildung 1: Schema des Verfahrens zur Extraktion des Lipidgehalts von Mykobakterien, die auf festen Medien gezüchtet werden. Hauptschritte zur Entschlüsselung von Lipiden, die auf Mykobakterienzellen vorhanden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schema des Verfahrens zur Extraktion des Mykolsäuregehalts von Mykobakterien, die auf festen Medien gezüchtet werden. Hauptschritte zur Entschlüsselung von Mykolsäuren, die auf Mykobakterienzellen vorhanden sind, entweder durch (A) saure Methanolyse oder (B) Verseifung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Lipidextraktion aus Mykobakterien. Dünnschichtchromatographie (TLC) Analyse von Mykolsäuren entwickelt in (A) 85 ml n-Hexan, plus 15 ml Diethylether (drei Läufe) und (B) 100 ml Dichlormethan. (C) Zweidimensionale TLC-Analyse von Mykolsäuren, die durch saure Methanolyse extrahiert werden, entwickelt in 95:5 (n-Hexan:Aceton) (drei Durchläufe) in erster Richtung und 97:3 (Toluol:Aceton) in zweiter Richtung. (D) Zweidimensionale TLC-Analyse von Mykolsäuren aus M. fortuitum, extrahiert durch Verseifung, entwickelt in 95:5 (n-Hexan:Aceton) (drei Durchläufe) in erster Richtung und 97:3 (Toluol:Aceton) in zweiter Richtung. TLCs wurden mit 10% Molybdatophosphorsäurehydrat in Ethanol aufgedeckt, gefolgt von Erhitzen der Platte bei 120 °C. M. bovis BCG Connaught (Linie 1 und 1'); M. fortuitum (Linie 2 und 2'); M. abscessus glatter Morphotyp (Linie 3 und 3') und M. brumae (Linie 4 und 4'). 1-4 Mykolsäuren, die durch saure Methanolyse erhalten werden, und 1'-4' Mykolsäuren, die durch Verseifung erhalten werden. Ich, α-mycolates; II, α'-Mykolete; IV, Ketomykolaten; V, Epoxymykolaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der Lipidextraktion aus Mykobakterien. (A) TLC-Analyse von Acylglycerinen (AG) und Phthioceroldistickstoff (PDIMs), entwickelt in 90:10 (Petrolether (60-80 °C):d Iethylether). (B) Zweidimensionale TLC-Analyse von PDIMs und AG entwickelt in 98:2 (Petrolether (60-80 °C):Ethylacetat) (drei Durchläufe) in erster Richtung und 98:2 (Petrolether (60-80 °C):Aceton) in zweiter Richtung. (C) TLC-Analyse von phenolischem Glykolipid (PGL), entwickelt in 95:5 (Chloroform:Methanol). (D) TLC-Analysen, die in 90:10:1 (Chloroform:Methanol:Wasser) von PGL, Glykopeptidolipiden (GPL), Trehalose-Dimykolat (TDM), Acyltrehalose (AT) und Trehalose-Monomykolat (TMM) entwickelt wurden. (E) TLC-Analyse von PGL-, GPL-, AT-, TMM- und Phosphatidyl-Inositol-Mannosisiden (PIMs), entwickelt in 30:8:1 (Chloroform:Methanol:Wasser). A-B-C wurden mit 10% Molybdatophosphorsäurehydrat in Ethanol aufgedeckt, gefolgt von Erhitzen der Platte bei 120 °C. D-E wurden mit 5% in Ethanol von 20% α-Naphthol in Schwefelsäure offenbart und bei 120 °C erhitzt. Linie 1: M. bovis BCG Connaught; Linie 2: M. fortuitum; Linie 3: M. abscessus glatter Morphotyp; Linie 4: M. brumae. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse von PIMs aus Mykobakterien. (A-B) TLC-Analyse von PIMs, die in 60:35:8 (Chloroform:Methanol:Wasser) entwickelt wurden. (C) Zweidimensionale TLC-Analyse von PIMs, die in 60:30:6 (Chloroform:Methanol:Wasser) in erster Richtung und 40:25:3:6 (Chloroform:Essigsäure:Methanol:Wasser) in der zweiten Richtung entwickelt wurden. A-C wurden mit 1% Anthron in Schwefelsäure aufgedeckt, gefolgt von Erhitzen der Platte bei 120 °C. B wurde mit Molybdänblau-Reagenz offenbart, bis Phosphatbänder auftraten. Linie 1: M. bovis BCG Connaught; Linie 2: M. fortuitum; Linie 3: M. abscessus glatter Morphotyp; Linie 4: M. brumae. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Ein einfaches Protokoll, das als Goldstandardmethode für die Extraktion von nichtkovalent verknüpften Lipidverbindungen aus der mykobakteriellen Zellwand gilt, wird vorgestellt. Weitere Visualisierungen durch ein- und zweidimensionale TLCs aus den extrahierten Lipiden von vier verschiedenen Mykobakterien werden gezeigt.
Zwei aufeinander folgende kombinierte Mischungen von Chloroform und Methanol zur Wiederherstellung des Lipidgehalts von Mykobakterienzellen ist die am weitesten verbreitete Lösungsmittelmischung23,24,25,26,27,28,29. Diese Mischung ermöglicht die Rückgewinnung einer Vielzahl von apolaren und polaren Lipiden aus den Zellen. Dennoch wurden in der Literatur einige andere Methoden beschrieben, um totale oder spezifische mykobakterielle Lipide zu extrahieren, die kürzlich von Hameed et al.29überprüft wurden. Zum Beispiel ist die Folch-Methode eines der am weitesten verbreiteten Protokolle, das entwickelt wurde, um die gesamten mykobakteriellen Lipide aus Geweben30 zurückzugewinnen, und wurde auch an reine mykobakterielle Kulturen angepasst. Es besteht aus der Suspendierung mykobakterieller Zellen in Chloroform: Methanol (1: 2), gefolgt von zentrifugation und der Zugabe von Chloroform, um ein Verhältnis von 1: 1 zu erhalten. Schließlich wird KCl verwendet, um Nichtlipidkomponenten aus demExtrakt 31zu entfernen. Parallel dazu wurden weitere Protokolle entwickelt, um spezifische Lipide zu extrahieren. Slayden etal. verwendeten eine Mischung aus Chloroform:Methanol plus Aceton, um gezielt Glykolipide wie TDM oder TMM32 zurückzugewinnen. Insgesamt basieren die veröffentlichten Methoden darauf, mykobakterielle Zellen unterschiedlichen Konzentrationen von Lösungsmitteln, hauptsächlich Chloroform und Methanol, auszusetzen. Ebenso werden gelegentlich einige Salze hinzugefügt, um andere zellartige Komponenten auf der Probe zu verwerfen.
Neben nichtkovalent verknüpften Lipiden wird auch die Mykolsäureextraktion durch zwei verschiedene Verfahren gezeigt. Während die saure Methanolyse die einfache Extraktion von Mykolsäuren mit weniger gefährlichen Reagenzien ermöglicht, bewahrt das Verseifungsverfahren die Struktur aller Mykolsäuretypen, einschließlich der Mykolsäure Typ V, die während der Methanolyseverfahren gespalten wird. Sobald die Lipide extrahiert sind, sind 1D- oder 2D-TLC Standardmethoden, um sie zu überwachen, und der verwendete Assay variiert je nach den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lipide. Die Polarität und Größe jedes Moleküls bestimmt die Auswahl des benötigten Elutionssystems, was die Bestimmung der Lipide ermöglicht, die Teil des Mykobakteriums sind. Eindimensionales TLC kann gewählt werden, wenn die Retentionsfaktoren (Rf) zwischen mykobakteriellen Lipiden unterschiedlich sind, während 2D-TLC die Visualisierung erleichtert, wenn verschiedene Lipide Molekulargewicht und Polaritätseigenschaften teilen. Um die Identifizierung zu erleichtern, sollten gereinigte Lipide parallel zur extrahierten Probe laufen, um ähnliche Rf zu vergleichen. Die Identifizierung eines Lipids kann erreicht werden, wenn es mit dem gleichen Rf wie das der bekannten gereinigten Steuerung mindestens in zwei TLC-Systemen (zwei verschiedene mobile Phasen) läuft. Gereinigte Lipide können von kommerziellen Lieferanten oder von mykobakteriellen Forschungslabors bezogen werden. Schließlich zeigt die biochemische Natur des Moleküls, welcher Fleck verwendet werden kann, um TLC-Platten freizulegen. Es gibt universelle Färbemethoden wie Phosphomolybdsäure, die es ermöglicht, die Visualisierung jeder organischen Komponente zu visualisieren, wenn sie an Kohlenstoffbindungen bindet. Während andere wie A-Naphthol oder Anthron bestimmte Farben für Zuckerrückstände liefern, bindet Molybdänblau spezifisch an Phosphatrückstände.
Die wichtigste Überlegung zur Analyse des Lipidgehalts von Mykobakterien besteht darin, die Verwendung von Kunststoffmaterial während der gesamten Verfahren zu vermeiden, da der Kontakt organischer Lösungsmittel mit Kunststoff die Proben kontaminieren kann und in den TLC-Platten beobachtet werden kann. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass die zusammensetzung des Kulturmediums, das für die Kultivierung von Mykobakterien verwendet wird, sowie die Temperatur oder die Tage der Inkubation das Lipidmuster jedes Mykobakteriums verändern können, wie zuvor beschrieben16. Mykobakterien, die entweder auf flüssigen und festen Medien gezüchtet werden, können verwendet werden, um die nicht-kovalenten verknüpften Lipide oder Mykolsäuren zu extrahieren. Wenn Zellen aus flüssiger Kultur erhalten werden, sollten sie ausreichend gefiltert und getrocknet werden, um das Vorhandensein flüssiger Medien in der Probe zu vermeiden. Darüber hinaus müssen bakterien bei der Verwendung von Mykobakterien aus flüssigen Medien zwischen den Experimenten richtig und gleichmäßig gezüchtet werden, um im Laufe der Zeit reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus können mykobakterielle Zellen auch auf Pellikeln17,33,34,35,36gezüchtetwerden,aus denen die äußersten Lipide mit organischen Lösungsmitteln gewonnen und durch TLC überwacht werden können, wie wir im vorliegenden Artikel gezeigt haben.
Die Haupteinschränkung der mykobakteriellen Lipidextraktionsverfahren bleibt die Verwendung toxischer Lösungsmittel unter sicheren Bedingungen. Das TLC-Verfahren ist weniger empfindlich als andere Techniken wie die Gaschromatographie oder die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Darüber hinaus erlaubt TLC keine Quantifizierung von Proben, und es müssen weitere Techniken angewendet werden, um die Struktur der extrahierten Verbindungen zu identifizieren. Zum Beispiel muss eine Kernspinresonanz durchgeführt werden, um Lipidisomere zu unterscheiden. Bemerkenswert ist, dass für die erstmalige Beschreibung der Struktur eines mykobakteriellen Lipids Massenspektrometrie oder Infrarotspektroskopie erforderlich sind. Daher erfordert die quantitative und qualitative Analyse von Lipidklassen in der Regel Kombinationen verschiedener Extraktions-, Derivatisierungs-, Chromatographie- und Detektionsmethoden, wie z. B. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Tandem-Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie37,38,39,40. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Verwendung einer einstufigen Dünnschichtchromatographie-Flammenionisations-Detektionstechnik die Quantifizierung und das vorläufige Screening von Mykolsäuren in Actinobakterien41ermöglicht. Dennoch ist TLC eine äußerst nützliche, zeitsparende und kostengünstige Technik, um die lipidische Zusammensetzung von Mykobakterien zu screenen und zu bewerten. Insgesamt sind die hier vorgestellten Verfahren sehr vielseitig und bieten grundlegende Werkzeuge, um das relevanteste Merkmal von Mykobakterienzellenzellen zu analysieren: ihre komplexe Zellwand.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (RTI2018-098777-B-I00), den FEDER Funds und der Generalitat of Catalunya (2017SGR-229) finanziert. Sandra Guallar-Garrido ist Trägerin eines PhD-Vertrags (FI) der Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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